Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este estudio identifica una firma relacionada con el estrés oxidativo de 10 lncRNA en el carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) utilizando datos del Atlas del Genoma del Cáncer. Aunque la validación mostró un rendimiento predictivo clínico limitado, la firma diferenció patrones de microambientes inmunitarios y los ensayos in vitro respaldaron LINC01615 como candidato relacionado con migración e invasión para una investigación mecanicista adicional.
El ARN no codificante de cadena larga (ARNnc) influye significativamente en el valor pronóstico del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) y en la infiltración inmunitaria. Este estudio tenía como objetivo demostrar cómo los ARNCn relacionados con el estrés oxidativo afectan al carcinoma escamoso pulmonar (CCE). El conjunto de datos Cancer Genome Atlas (TCGA) recopiló información transcriptómica y datos clínicos relacionados para LUSC. Para construir un modelo pronóstico, se identificaron 10 genes relacionados con el pronóstico mediante una serie de análisis bioinformáticos que compararon la expresión aberrante del gen OS en tumores y tejidos sanos, así como su asociación con la malignidad. Los sujetos fueron estratificados en grupos de alto y bajo riesgo según la puntuación mediana de riesgo derivada de la firma de 10 genes. Aunque el modelo matemático de riesgo demostró un rendimiento predictivo independiente limitado en la cohorte de validación (AUC ~ 0,5), las evaluaciones funcionales e inmunológicas revelaron diferencias significativas en el microambiente tumoral (TME) entre los estratos de riesgo. En concreto, los pacientes de alto riesgo presentaron perfiles de infiltración inmunitaria distintos y puntuaciones inmunológicas alteradas en comparación con sus homólogos de bajo riesgo. Por lo tanto, en lugar de servir como una herramienta directa de predicción clínica, esta firma de ARNnc relacionada con el estrés oxidativo proporciona valiosas perspectivas biológicas sobre el panorama inmunológico de la LUSC y destaca posibles objetivos terapéuticos para una investigación mecanicista más profunda.
El cáncer de pulmón presenta la mayor incidencia y mortalidad global entre lasmalignidades 1. Dentro de las variantes histológicas del cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC), el carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) es un subtipo predominante, que a menudo se correlaciona con resultados clínicos desfavorables y la falta de tratamientos dirigidos altamente efectivos en comparación con el adenocarcinomapulmonar 2. Aunque los enfoques terapéuticos principales incluyen intervención quirúrgica, radioterapia y quimioterapia, los pacientes con LUSC avanzada suelen presentar resistenciaterapéutica 3. Por ello, es urgente identificar biomarcadores moleculares robustos para mejorar la estratificación pronóstica y guiar estrategias terapéuticas exploratorias paraLUSC 4.
El estrés oxidativo, caracterizado por la acumulación patológica de especies reactivas de oxígeno (ROS), desempeña un papel fundamental en la iniciación, crecimiento y metástasis tumorales. En ausencia de mecanismos eficientes de eliminación de ROS, los niveles elevados de ROS inducen daño en el ADN y genotoxicidad, lo que finalmente resulta en diversas alteraciones genómicas que contribuyen al desarrollo del cáncer. Cabe destacar que los estudios han demostrado consistentemente un aumento en los niveles de ROS y el estrés oxidativo, especialmente dentro de la patogénesis del cáncer depulmón 5,6. Investigaciones recientes han puesto de manifiesto aún más que los grupos de genes vinculados al estrés oxidativo pueden funcionar como biomarcadores pronósticos prospectivos en malignidadespulmonares 7. Los ARN largos no codificantes (ARNnc) han surgido como reguladores cruciales de la expresión génica y representan biomarcadores pronósticos prometedores en diversas malignidades. Aunque un estudio anteriordestacado estableció con éxito un modelo pronóstico de ARNlnc relacionado con el estrés oxidativo para adenocarcinoma pulmonar (LUAD), el panorama pronóstico específico y las implicaciones inmunitarias de estos ARNnc en LUSC siguen siendo en gran medida inexplorados.
En esta investigación, los autores analizaron sistemáticamente conjuntos de datos de TCGA para construir una nueva firma de ARNnN relacionada con el estrés oxidativo específicamente adaptada para LUSC. Además, a diferencia de los análisis puramente bioinformáticos, el presente estudio incorpora validación experimental in vitro para confirmar el papel funcional biológico de los ARNnc clave identificados (por ejemplo, Linc01615). En lugar de reclamar una aplicabilidad clínica inmediata para decisiones diagnósticas y terapéuticas, esta investigación busca principalmente explorar los posibles mecanismos del estrés oxidativo en LUSC y su correlación con el microambiente inmunitario tumoral. Estos hallazgos tienen como objetivo proporcionar valiosos conocimientos biológicos y destacar posibles objetivos terapéuticos para futuras investigaciones mecanicistas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Adquisición y preprocesamiento de datos
Todos los datos analizados en este estudio se obtuvieron de la base de datos de acceso público de la TCGA que aparece en la Tabla de Materiales. Este estudio se adhiere estrictamente a la Política de Compartición de Datos Genómicos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y a las directrices de publicación proporcionadas por TCGA. Dado que los conjuntos de datos consisten en datos clínicos y multiómicos desidentificados, disponibles públicamente, este estudio quedó exento de la aprobación posterior por parte del Comité de Revisión Institucional (IRB). Los datos transcriptomas y la información clínica correspondiente para LUSC se descargaron de la base de datos Cancer Genome Atlas (TCGA). Inicialmente, la cohorte estaba compuesta por 551 muestras (502 tumores y 49 normales). Para garantizar la robustez de este modelo pronóstico, se excluyeron de la analiza de supervivencia posterior a pacientes que carecieran de datos completos de supervivencia global (SO), estado de supervivencia o características clínicas esenciales. Tras este estricto proceso de filtrado, se estableció una cohorte analítica final de 470 pacientes con LUSC. Estos 470 pacientes fueron posteriormente divididos aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento (n = 235) y otro conjunto de pruebas (n = 235) para la construcción y validación del modelo de riesgo. Un total de 792 genes relacionados con el estrés oxidativo se recopilaron a través de la base de datos GeneCards, listados en la Tabla de Materiales, utilizando un criterio de inclusión con una puntuación de relevancia ≥ 7. El paquete limma (versión 3.66.0) se utilizó para detectar genes de estrés oxidativo expresados diferencialmente. Los diagramas de volcán se producían usando el paquete ggplot2 (versión 4.0.2). Entre el grupo de entrenamiento y el grupo de pruebas, no hubo variación apreciable en las características clínicas (p > 0,05). El conjunto de entrenamiento se utilizaba para la construcción del modelo, y el conjunto de pruebas para la validación interna.
Construcción y verificación del modelo de riesgo
Para identificar los ARNCn asociados al estrés oxidativo, se realizó un análisis de coexpresiones de Pearson. Los autores evaluaron la correlación entre los perfiles de expresión de los genes relacionados con el estrés oxidativo diferencialmente expresados identificados y todos los ARNlcRNA anotados dentro del conjunto de datos TCGA-LUSC. Los criterios de correlación para seleccionar lncRNAs coexpresados se establecieron en un coeficiente de correlación |R| > 0,4 y un valor p < 0,001. A partir de estos umbrales, se derivaron y extrajeron un total de 6.088 candidatos a RNCn relacionados con el estrés oxidativo. Posteriormente, estos 6.088 candidatos a ARNnc fueron evaluados mediante regresión LASSO y enfoques analíticos complementarios para construir el modelo de riesgo pronóstico. Utilizando los datos procesados, los participantes de los pacientes se clasificaron en estratos de alto y bajo riesgo.
Factores independientes y curvas ROC
Se utilizaron modelos de regresión de Cox univariantes y multivariantes para identificar variables pronósticas independientes. Específicamente, para controlar la tasa de error familiar durante los análisis de regresión de Cox univariantes múltiples (n = 236 pruebas), se aplicó la corrección de Bonferroni, estableciendo el umbral de significancia ajustado estrictamente en p < 0,00021 (calculado como 0,05 / 236).
Análisis de supervivencia y análisis de componentes principales
El paquete de supervivencia (versiones 3.8-6) se utilizó para calcular las tasas de supervivencia global (OS), y el análisis de componentes principales (PCA) se empleó para evaluar la robustez del modelo de riesgo.
Nomograma
El índice de ajuste se evaluó utilizando el paquete rms en R para evaluar la fiabilidad del nomograma. La carga mutacional tumoral (TMB) fue evaluada y visualizada utilizando el paquete maftools (versión 2.22.0). Se utilizaron algoritmos, incluido ssGSEA, para detectar infiltraciones inmunitarias. Además, se utilizó el paquete ggpubr (versión 0.6.3) para comparar puntos de control inmunitarios entre grupos de riesgo. El algoritmo ESTIMATE se utilizó para caracterizar el microambiente tumoral (TME).
Análisis funcional
El paquete clusterProfiler (versión 4.14.6) en R se utilizó para el análisis de enriquecimiento. Para explorar más a fondo las vías funcionales, se realizó un análisis GSEA. Utilizando Cytoscape, se creó una red de coexpresiones para la observación.
Métodos experimentales
Condiciones y agrupación de cultivos celulares
La línea celular NCI-H520 de carcinoma escamoso de pulmón humano (RRID: CVCL_1566; incluida en la Tabla de Materiales) fue cultivada en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v) y al 1% de penicilina-estreptomicina. Las células en fase logarítmica se sembraron en placas de cultivo de 6 pozos. Tras la adherencia exitosa, las células se asignaron aleatoriamente en tres grupos experimentales distintos: un grupo control en blanco mantenido bajo condiciones estándar de cultivo, un grupo control negativo (si-NC) transfectado con siRNA no dirigido, y un grupo experimental knockdown (si-LINC01615) transfectado con siRNA específico de LINC01615.
Transfección celular
Los reactivos si-LINC01615 y si-NC se descongelaron en hielo. Para la preparación del complejo de transfección, se pipetearon 95 μL de medio RPMI-1640 sin suero en tubos estériles de centrífuga, seguido de la adición secuencial de 3 μg del respectivo siRNA y 5 μL del reactivo de transfección Lipo3000. Se aplicó el mismo procedimiento tanto para elgrupo si LINC01615 como para el siNC. Las soluciones se mezclaron suavemente e incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para facilitar la formación compleja, resultando en un volumen total de aproximadamente 200 μL por tubo. Posteriormente, esta mezcla se distribuyó uniformemente en los pozos de cultivo designados que contenían 800 μL de medio basal RPMI-1640. Tras un periodo de incubación de 6 horas a 37 °C, el medio de transfección se aspiraba cuidadosamente y se reemplazaba por medio fresco y completo de cultivo.
Ensayo de cicatrización de heridas (scratch)
Para el ensayo de cicatrización de heridas, las células NCI-H520 (RRID: CVCL_1566) que crecieron logarítmicamente se siembraron en placas de cultivo de 6 pozos con una densidad de 5,6 × 10 célulasde 5 por pozo. Al alcanzar una confluencia del 95–100%, se creó artificialmente una herida lineal rascando verticalmente la monocapa de la célula a través del centro del pozo usando una punta estéril de pipeta de 200 μL. Posteriormente, los pozos se lavaron tres veces con PBS para eliminar células desprendidas y restos celulares, y después se incubaron en un medio RPMI-1640 sin suero. Se capturaron imágenes de las áreas heridas idénticas a las 0, 24 y 48 horas utilizando un microscopio invertido. El área de cicatrización de la herida se cuantificó midiendo la distancia del espacio usando ImageJ (RRID: SCR_003070; incluida en la Tabla de Materiales), y la tasa de migración se calculó en relación con el área inicial de la herida a 0 h.
Migración transwell e ensayos de invasión
Las capacidades de migración e invasión celular se evaluaron utilizando cámaras Transwell de 24 pozos equipadas con insertos de membrana de policarbonato de 8,0 μm del tamaño de un poro que se enumeran en la Tabla de Materiales. Para el ensayo de invasión, las cámaras apicales se pre-recubrieron con 50 μL de Matrigel (diluido 1:8 en medio libre de suero; listado en la Tabla de Materiales) y incubadas a 37 °C durante 2 horas para polimerizarse, mientras que el ensayo migratorio utilizó insertos sin recubrir. Tras la transfección celular y un periodo de inanición sérica de 24 horas, se extrayeron células NCI-H520, se resuspendieron en un medio RPMI-1640 libre de suero y se siembraron en las cámaras apicales con una densidad de 1,8 ×10 5 células por pozo en 200 μL. Las cámaras basales se llenaron con 600 μL de medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS como quimioatrayente. Tras una incubación de 48 horas a 37 °C con un 5% de CO₂, los insertos se retiraron y lavaron tres veces con PBS. Las células que quedaban en la superficie apical de la membrana se retiraban suavemente con un hisopo de algodón húmedo. Las células que habían migrado o invadido la superficie basolateral se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y se teñieron con solución de Giemsa listada en la Tabla de Materiales durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células migradas e invadidas fueron visualizadas y enumeradas en tres campos ópticos seleccionados aleatoriamente por inserto usando un microscopio invertido a 40x de aumento.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos y visualizaciones de datos se realizaron utilizando el software R (versión 4.1.2; RRID: SCR_001905; listados en la Tabla de Materiales). Los números de versión específicos de todos los paquetes R utilizados en este estudio han sido detallados explícitamente en sus respectivas subsecciones metodológicas. Un valor significativo se definía convencionalmente como p < 0,05 salvo que se indicara lo contrario. Cuando se realizaron comparaciones múltiples (por ejemplo, las regresiones múltiples univariantes de Cox), el método de Bonferroni se aplicó rigurosamente para mantener la tasa de error familiar (FWER), con el umbral exacto ajustado (p. ej., p < 0,00021) detallado en la subsección metodológica correspondiente. Los datos cuantitativos in vitro se expresaron como desviación media ± estándar y se analizaron utilizando la prueba t de Student o ANOVA unidireccional según correspondá.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Identificación de genes expresados diferencialmente para el estrés oxidativo
El flujo de trabajo se muestra en la Figura 1. Las características clínicas de la cohorte analítica final, compuesta por 470 pacientes con LUSC, se detallan en la Tabla 1. Basándose en el umbral definido de una puntuación de relevancia ≥ 7, los autores recuperaron un total de 792 genes relacionados con el estrés oxidativo...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
El carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) es un subtipo histológico predominante y altamente agresivo de cáncer de pulmón no de células pequeñas, caracterizado a menudo por tasas de supervivencia deficientes y resistencia a las modalidades terapéuticasconvencionales 8,9. La evidencia emergente subraya el estrés oxidativo como un factor clave en la patogénesis y progresión de diversas malignidades. La acumulación patológica de especie...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los autores no declaran intereses en competencia. No se utilizaron herramientas de inteligencia artificial (IA) ni tecnologías asistidas por IA durante la preparación del manuscrito; Todo el contenido científico, análisis, datos en bruto y conclusiones fueron generados, revisados y aprobados de forma independiente por los autores.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención nº 8200430). Agradecemos sinceramente a los colaboradores e instituciones implicadas, incluyendo la Universidad de Medicina Tradicional China de Hunan y el Hospital Afiliado de la Academia de Medicina Tradicional China de Hunan, por sus recursos y apoyo. También expresamos nuestro agradecimiento a todos los investigadores y participantes que contribuyeron a este estudio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehído | Beyotime | P0099 | Usado para fijación de células |
| Cytoscape | Consorcio Cytoscape | https://cytoscape.org/ | Usado para creación de red de co-expresión |
| Suero Bovino Fetal (SBF) | Gibco | 10099-141 | Concentración final 10% (v/v) |
| Base de datos GeneCards | Base de datos de genes humanos GeneCards | https://www.genecards.org/ | Pantalla de genes relacionados con el estrés oxidativo |
| Tinción de Giemsa | Sigma-Aldrich | GS500 | Usado para tinción de células migradas/invadidas |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Usado para cuantificación de brechas de herida |
| Reactivo de transfección Lipo3000 | GLPBIO | GK20006 | Usado para transfección de siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | Diluido 1:8 en medio libre de suero |
| Carcinoma de células escamosas de pulmón humano NCI-H520 | ATCC | HTB-182 | Usado para ensayos de validación in vitro |
| PBS (Salina Fosfato Enbuferizada) | Gibco | 10010-023 | Usado para lavado de células |
| Penicilina-Estreptomicina (1%) | Gibco | 15140-122 | Suplemento antibiótico para cultivo celular |
| Software R (v4.1.2) | Fundación R | https://www.r-project.org/ | Análisis estadístico y visualización |
| Medio RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Medio de cultivo celular |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Común de Datos Genómicos | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Fuente de datos de transcriptoma & clínicos |
| Cámaras Transwell (8,0 μm) | Corning | 3422 | Usado para ensayos de migración e invasión |