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Artículo de investigación

El eje NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 regula la polarización e inflamación de los macrófagos en modelos de sepsis

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DOI:

10.3791/69802

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16 de enero de 2026

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1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

En este artículo

Resumen

Este protocolo integra muestras clínicas, macrófagos cultivados y un modelo murino de ligadura y punción cecal (CLP) para investigar cómo el eje NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 regula la polarización e inflamación de los macrófagos en la sepsis, proporcionando una guía paso a paso que puede adaptarse a otras vías inmunitarias mediadas por lncRNA.

Resumen

La sepsis se caracteriza por una respuesta inmunitaria del huésped desregulada y sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial. El ARN largo y no codificante NEAT1 ha estado implicado en enfermedades inflamatorias, pero su papel específico en la polarización de los macrófagos durante la sepsis no ha sido completamente definido. Aquí, examinamos sistemáticamente el eje NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 en muestras clínicas, macrófagos cultivados y un modelo murino CLP. Se utilizan experimentos cuantitativos de PCR, western bloting, ensayos de reportero con doble luciferasa y extractos de ARN hacia abajo para confirmar la interacción competitiva con ARN endógeno (ceRNA) entre NEAT1, miR-181a-5p y HMGB1. Se aplican ensayos funcionales, incluyendo inmunofluorescencia, migración transwell y marcaje terminal de desoxinucleotiltransferasa dUTP (TUNEL), para evaluar la polarización, migración y apoptosis de los macrófagos. In vivo, el modelo CLP combinado con ELISA e histopatología valida el impacto del knockdown de NEAT1 en los perfiles de citocinas y en la lesión de órganos. NEAT1 y HMGB1 están regulados al alza, mientras que miR-181a-5p está regulado a la baja en pacientes con sepsis y en macrófagos estimulados con lipopolisacáridos. El silenciamiento de NEAT1 promueve la polarización de los macrófagos M2, reduce las citocinas proinflamatorias, dificulta la migración de los macrófagos y alivia el daño tisular en ratones sépticos mediante el eje miR-181a-5p/HMGB1. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo integrado que caracteriza el circuito regulador lncRNA-microARN-HMGB1 en sepsis utilizando enfoques clínicos, in vitro y in vivo armonizados. Proporciona un marco metodológico para dirigirse a redes de ceRNA relacionadas con NEAT1 como posibles estrategias terapéuticas.

Introducción

La sepsis se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta del huésped desregulada ala infección 1. A pesar de los avances en el manejo clínico, su mortalidad sigue siendo alta y los mecanismos moleculares subyacentes al desequilibrio inmunitario no se comprendenplenamente 2,3. Entre los reguladores inmunitarios, los ARN largos no codificantes (lncRNA) han surgido como moduladores importantes de la señalización inflamatoria y la función de losmacrófagos 4,5. NEAT1, un transcripto abundante enriquecido nuclearmente, es un componente estructural de los paraspeckles y se ha asociado con respuestas inmunitarias y de lesióntisular 6,7. Estudios previos han relacionado NEAT1 con inflamación intestinal, isquemia/lesión por reperfusión y síndrome de dificultad respiratoriaaguda 8,9,10.

En el contexto de la sepsis, la evidencia acumulada indica que los ARNnc regulan la polarización de los macrófagos y la señalización inflamatoria, influyendo así en la progresión de la enfermedad y el resultado11,12. Por ejemplo, se ha informado que los lncRNAs KCNQ1OT1 y SNHG1 modulan la lesión miocárdica inducida por sepsis a través de vías mediadas pormicroARN13,14. Sin embargo, no se ha definido sistemáticamente si NEAT1 regula la polarización de los macrófagos a través del eje miR-181a-5p/HMGB1 en sepsis. Para cubrir esta brecha, establecimos un protocolo que combina muestras de sangre de pacientes, macrófagos RAW264.7 estimulados con lipopolisacáridos y un modelo murino de ligadura cecal y punción para interrogar el eje NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. Utilizando PCR cuantitativa, western bloting, ensayos de reporteros de doble luciferasa, pull-down de ARN y lecturas funcionales de la polarización, migración y apoptosis de los macrófagos M1/M2, este protocolo proporciona un marco experimental reproducible para definir NEAT1 como regulador de la función de los macrófagos en sepsis y para apoyar el desarrollo de estrategias dirigidas alncRNA 17,18.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos fueron aprobados por la Junta de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Hebei (Aprobación nº HDFY-LL-2021-232). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes o, cuando correspondía, de sus representantes legales. Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices institucionales y las normativas nacionales, y fueron aprobados por el mismo comité de ética. El protocolo aprobado especificaba detalles sobre el procedimiento de ligadura y punción cecal (CLP), administración de adenovirales, régimen anestésico y criterios humanos.

Recogida de muestras de pacientes

Los pacientes con sepsis fueron reclutados prospectivamente en el Hospital Afiliado de la Universidad de Hebei entre febrero de 2022 y julio de 2024. Un total de 50 pacientes cumplieron los criterios de inclusión, incluyendo 26 varones y 24 mujeres, de entre 24 y 69 años (media 52,4 ± 10,2 años). La sepsis fue diagnosticada según los criterios de Sepsis-3, requiriendo infección sospechosa o confirmada más un aumento en la puntuación de la Evaluación Secuencial de Insuficiencia Orgánica (SOFA) en ≥ 2 puntos. Para cada paciente, se registraron la fuente primaria de infección (como infección pulmonar, intraabdominal, urinaria o del torrente sanguíneo) y la gravedad de la enfermedad (sepsis o shock séptico), y se resumió la distribución de las puntuaciones SOFA para caracterizar la carga de la enfermedad. Como grupo de control, se incluyeron 39 individuos sanos sin evidencia clínica de infección o enfermedad inflamatoria sistémica (20 hombres y 19 mujeres, de 26 a 70 años, media 50,7 ± 11,0 años), y no hubo diferencias significativas en edad o sexo entre los grupos.

Se recogió sangre venosa periférica de pacientes con sepsis antes de iniciar el tratamiento específico para sepsis siempre que fuera posible. La sangre (normalmente 5-10 mL) se extraía en tubos recubiertos de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) y se invertía suavemente varias veces para mezclar el anticoagulante. Las muestras se procesaron en aproximadamente 1 hora tras la recogida. El plasma se obtuvo mediante centrifugación a 1.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente, se alicuó en microtubos marcados y se almacenó a -80 °C para mediciones posteriores de citocinas. Para la extracción de ARN y proteínas, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una porción de las mismas muestras utilizando un medio de separación con gradiente de densidad según las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron dos veces en PBS, se contaron y se almacenaron como pellets celulares a -80 °C.

Cultivo celular y transfección

Las células macrófagas murinas RAW264,7 se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2. Las células pasaron con un raspador celular antes de alcanzar la sobreconfluencia para preservar un fenotipo estable.

Para la transfección, se sembraron células RAW264,7 a 5 × 105 células por pozo en placas de 6 pozos en 2 mL de medio completo aproximadamente 24 horas antes de la exposición al reactivo. Cuando los cultivos alcanzaron una confluencia del 70-90%, los ácidos nucleicos (como plásmidos de expresión NEAT1 o HMGB1, constructos de horquilla corta, imitadores o inhibidores de miR-181a-5p y sus controles correspondientes) se complejaron con un reactivo transfectitivo a base de lípidos en un medio libre de suero según las instrucciones del fabricante. Normalmente, se mezclaban 2-3 μg de ADN plasmídico o 50-100 pmol de ARN pequeño con el volumen recomendado de reactivo, se dejaba formar complejos a temperatura ambiente durante 10-15 minutos y luego se añadía gota a gota a las células en un medio libre de antibióticos. Tras 4-6 horas, el medio se reemplazaba por medio fresco y completo, y las células se incubaban durante 24-48 horas más antes de los ensayos aguas abajo.

Inducción de polarización de los macrófagos

Para inducir la polarización inflamatoria de los macrófagos, se permitió que las células RAW264.7 se adhieran en placas de 6 pozos durante al menos 4 horas en un medio completo. El medio se sustituyó entonces por DMEM que contenía 100 ng/mL lipopolisacáridos (LPS), y las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C con un 5% de CO2. Tras la estimulación, las células se procesaban inmediatamente para extracción de ARN y proteínas, tinción por inmunofluorescencia, ensayos de migración o análisis de apoptosis, según el diseño experimental.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)

El ARN total se extrajo de células cultivadas, PBMCs o tejidos de ratón utilizando un reactivo monofásico basado en fenol-guanidinio según los procedimientos estándar. En resumen, las muestras se lisaron en 1 mL de reactivo por cada 106 células o 50-100 mg de tejido, se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se mezclaron vigorosamente con cloroformo (0,2 mL por cada 1 mL de reactivo). Tras la incubación durante 2-3 minutos, los lisados se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar las fases. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se precipitó ARN con un volumen igual de isopropanol. La mezcla se incubó aproximadamente 10 minutos y se centrifugó de nuevo a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El pellet resultante se lavó con etanol al 75%, centrifugó a 7.500 × g durante 5 minutos a 4 °C, se secó brevemente al aire y se disolvió en agua libre de RNasa. La concentración y pureza del ARN se evaluaron mediante espectrofotometría UV, y se utilizaron muestras con una relación A260/A280 de aproximadamente 1,8-2,0 para análisis posteriores. Cuando era necesario, la integridad se comprobaba mediante electroforesis en gel de agarosa.

El ADN complementario (cDNA) se sintetizó a partir de ARN total utilizando un kit de transcripción inversa comercialmente disponible, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para miR-181a-5p, se emplearon cebadores específicos de genes o de lazos de tallo, según la recomendación. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real y una mezcla maestra adecuada (como SYBR Green- o química basada en sondas) en un volumen de reacción total de 20 μL que contiene plantilla de ADNc y 0,2-0,4 μM de cada cebador. Las condiciones típicas de ciclismo incluyeron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s, con análisis de curva de fusión cuando correspondía para confirmar la especificidad del amplicon. Los niveles de expresión de NEAT1 y HMGB1 se normalizaron a GAPDH, y la expresión de miR-181a-5p se normalizó a ARN nuclear pequeño de U6. La expresión relativa se calculó usando el método 2-ΔΔCt y se expresó como cambio de pliegue en comparación con los grupos de control. Las secuencias de cebadores y tamaños de amplicones se compilaron en una hoja de cálculo separada para su envío como Tabla Suplementaria 1.

Western blot

Para el western bloting, las células se lavaron dos veces con PBS bien frío y se lisaron en un tampón adecuado de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasa. Los lisados se incubaron sobre hielo durante 15-30 minutos con una mezcla suave ocasional y se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar restos celulares. Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA).

Se mezclaron cantidades iguales de proteína (típicamente 40 μg por carril) con tampón de carga, se hirviron a 95 °C durante 5-10 minutos para desnaturalizar las proteínas, y se separaron en geles de dodecilo sulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida con concentración adecuada de acrilamida (por ejemplo, 10-12% para HMGB1). Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia húmedo o semiseco bajo condiciones recomendadas para el rango de peso molecular de interés. Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada o albúmina sérica bovina (BSA) en suero salino con Tris-buffer y 0,1% Tween-20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego incubados durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra HMGB1 (por ejemplo, dilución 1:500) y GAPDH (por ejemplo, dilución 1:1.000) diluidos en tampón bloqueador. Tras tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavados adicionales, se visualizaron las bandas proteicas utilizando un sustrato quimioluminiscencia mejorado y se capturaron con un sistema de imagen digital. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software de análisis de imágenes, las señales de HMGB1 se normalizaron a GAPDH y se comparó la expresión relativa entre grupos.

Ensayo reportero dual-luciferase

Fragmentos de tipo salvaje y mutantes de NEAT1 y de la región no traducida 3′ de HMGB1 (3′-UTR) que contienen los sitios de unión predichos de miR-181a-5p fueron clonados en un vector reporteroluciferasa 19. Todos los constructos fueron verificados mediante secuenciación Sanger para confirmar los sitios de inserción ymutación 20. Las células RAW264,7 se sembraron en placas de 24 pozos y se dejaron adherir durante la noche. Las células fueron luego co-transfectadas con plásmidos reporteros y inhibidores de miR-181a-5p, mimics o controles negativos correspondientes utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos, tal como se describe para el procedimiento general de transfección.

Tras aproximadamente 24-48 horas de incubación, las células fueron lavadas con PBS, lisadas en un tampón pasivo de lisis adecuado (por ejemplo, 20 μL por pozo) y agitadas suavemente para asegurar una lisis completa. La actividad de la luciferasa se midió utilizando un kit de ensayo doble de luciferasa y un luminómetro, siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de Firefly se normalizó a actividad de luciferasa de Renilla para controlar la eficiencia de la transfección, y la actividad relativa de luciferasa de cada grupo se comparó con el control correspondiente.

Ensayo migratorio Transwell

La migración de los macrófagos se evaluó utilizando cámaras transwell pre-recubiertas con un gel de matriz extracelular adecuado para ensayos de invasión celular. El gel se diluyó 1:6 en un medio sin suero sobre hielo, y se añadieron 50 μL de la solución diluida a la superficie superior de cada inserto. La placa se incubó a 37 °C durante aproximadamente 4 horas para permitir que el gel se solidificara. Se extrajeron células RAW264,7 transfectadas o tratadas, se resuspendieron en un medio libre de suero a 1 × 106 células/mL, y se añadieron 100 μL de la suspensión celular (1 × 105 células) a la cámara superior. La cámara inferior se llenó con 600 μL de medio completo que contenía un 10% de suero bovino fetal como quimioatrayente.

Las células se incubaron a 37 °C con 5% deCO2 durante 24 horas. Al final de la incubación, las células no migratorias que quedaban en la superficie superior de la membrana fueron retiradas suavemente con un hisopo de algodón. Las células migradas adheridas a la superficie inferior de la membrana se fijaron con etanol al 95% durante unos 20 minutos a temperatura ambiente y luego se teñieron con solución de violeta cristalina al 0,5% durante 10-15 minutos. El exceso de tinte se eliminaba lavándolo con PBS y las membranas se secaban al aire. Las células migradas se examinaron bajo un microscopio óptico, y las células de varios campos seleccionados aleatoriamente por inserto fueron contadas de forma ciega para cuantificar la capacidad migratoria.

Ensayo de apoptosis TUNEL

Para la detección de la apoptosis, se cultivaron células RAW264.7 en cubiertas de vidrio y se sometieron a los tratamientos o transfecciones indicados. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30-60 minutos a temperatura ambiente y se enjuagaron con PBS. La actividad endógena de la peroxidasa se bloqueó mediante la incubación en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 20 minutos, seguida de lavados con PBS. Se utilizó un kit de ensayo TUNEL y se aplicó la mezcla de etiquetado para cubrir las celdas. Las muestras se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 60 minutos en una cámara humidificada, y la reacción se detuvo según las instrucciones del kit. Tras la incubación con estreptavidina-HRP o un reactivo de detección equivalente durante 30 minutos a 37 °C, se visualizaron núcleos con un sustrato cromogénico como 3,3′-diaminobenzidina (DAB) hasta que se hicieron evidentes núcleos apoptóticos teñidos de marrón. Las láminas se contra-tinturaron con hematoxilina, se deshidrataron mediante etanol graduado, se limpiaron en xileno y se montaron con un medio permanente. Se observaron células apoptóticas y núcleos totales bajo un microscopio óptico, y el índice apoptótico se calculó como el porcentaje de células positivas a TUNEL.

Inmunofluorescencia

Para la inmunofluorescencia, las secciones de tejido incrustadas en parafina se desenceraron en xileno y se rehidrataron mediante una serie graduada de etanol hasta obtener agua. La recuperación de antígenos se realizó utilizando un tampón adecuado (como el tampón de citrato, pH 6,0) y la recuperación de epítopos inducida por calor mediante microondas o olla a presión, según las recomendaciones de anticuerpos. Tras enfriar y enjuagar, las secciones se bloquearon con suero normal al 5% en PBS durante 1 hora a 37 °C para reducir la unión inespecífica. Los tejidos se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra marcadores de polarización de macrófagos y citocinas inflamatorias, incluyendo CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), IL-4, IL-10 y Arg-1 (comúnmente a 1:500 de dilución), diluidos en buffer bloqueante.

Al día siguiente, se lavaron las secciones con PBS e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad. Los núcleos se contra-tinturaron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 minutos. Tras los lavados finales, se montaron secciones con un medio de montaje anti-desvanecimiento y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia utilizando conjuntos de filtros adecuados. Las imágenes se adquirieron con ajustes de exposición consistentes en todos los grupos, y se indicaron barras de escala (por ejemplo, 20 μm) y aumentos en todos los paneles y leyendas de las figuras.

Modelo de ratón de sepsis inducida por CLP

Los ratones machos C57BL/6 (24-32 g) fueron aclimatados al menos durante 1 semana antes de la cirugía y luego asignados aleatoriamente a los grupos Sham, CLP, CLP más control negativo con horquilla corta, o CLP más NEAT1 con horquilla corta (n = 6 por grupo). Los ratones fueron anestesiados inhalando éter en una cámara cerrada durante aproximadamente 1-3 minutos hasta la pérdida del éter del reflejo de enderezamiento u otro anestésico aprobado por la institución con una dosis y duración de exposición que indujo la pérdida del reflejo de enderezamiento manteniendo una función respiratoria adecuada. Se afeitó el vello abdominal y se desinfectó la piel con una solución antiséptica adecuada. Se realizó una laparotomía de la línea media de aproximadamente 1-2 cm para exponer el ceco junto con su intestino adyacente.

Para la CLP, el ceco se exteriorizó suavemente y se ligó con una sutura estéril aproximadamente a dos tercios de su longitud, teniendo cuidado de no obstruir la válvula ileocecal ni comprometer el flujo sanguíneo mesentérico. El ceco ligado se perforó dos veces con una aguja estéril del calibre especificado en el protocolo aprobado (por ejemplo, 21 G), y se extruyó suavemente una pequeña cantidad de material fecal para asegurar la permeabilidad de los puntos de punción. El ceco se devolvió a la cavidad peritoneal y la pared abdominal y la piel se cerraron en capas con suturas. Los ratones operados por simulación sufrieron la misma laparotomía y exposición al ceco sin ligadura ni punción.

Para lograr el knockdown in vivo de NEAT1, se preparó un vector adenoviral que codifica shNEAT1 y un vector control negativo correspondiente a un título definido (por ejemplo, 1 ×10 9 unidades formadoras de placas/mL). Se administró un volumen fijo de suspensión viral (como 100 μL por ratón) a través de la vena caudal en un momento específico respecto al CLP (por ejemplo, 1 hora después de la cirugía), tal como se describió en el diseño experimental y fue aprobado por el comité de ética. Tras la cirugía, los ratones recibieron cuidados postoperatorios estándar, incluyendo reanimación subcutánea con líquido si era necesario, y fueron monitorizados en busca de signos clínicos de sepsis y malestar. En el momento predeterminado, los animales fueron eutanasiados humanamente mediante inhalación sobredosis de éter en una cámara cerrada, utilizando aproximadamente 5-10 mL de éter para asegurar una rápida cesación de la respiración, seguido de la confirmación de la muerte, se recogió sangre para análisis de citocinas y se extrajeron órganos para histopatología, inmunofluorescencia y ensayos moleculares.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS versión 23.0 o un paquete de software estadístico equivalente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS), salvo que se indique lo contrario. Para comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student no emparejada cuando los datos normalmente se distribuyeron con varianzas homogéneas. Para comparaciones entre tres o más grupos, se aplicó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido de pruebas post hoc adecuadas para comparaciones múltiples cuando se detectó un efecto global significativo. Se consideró estadísticamente significativo un valor p bilateral < 0,05. El significado de los símbolos estadísticos (por ejemplo, p < 0,05, *p < 0,01) se definió en las leyendas de la figura, y el número de réplicas biológicas se indica en el texto o leyendas correspondientes.

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Resultados

Detección de la expresión e interacciones de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 en sepsis

En sueros de pacientes con sepsis, los niveles de NEAT1 y HMGB1 fueron significativamente más altos que en controles sanos, mientras que miR-181a-5p se redujo notablemente. Se observaron patrones de expresión similares en PBMC y en macrófagos RAW264.7 estimulados con lipopolisacáridos, lo que indica que este eje se altera consistentemente en sepsis y en condiciones inflamatorias similares a sepsis (...

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Discusión

La sepsis se caracteriza por una profunda y a menudo prolongada desregulación inmunitaria, en la que las fases de hiperinflamación e inmunosupresión coexisten y contribuyen conjuntamente a la insuficiencia orgánica y a los malosresultados 21,22. La evidencia acumulada indica que los ARN largos no codificantes (lncRNAs) participan en estos procesos modulando la señalización inflamatoria y la polarización de losma...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen al personal clínico y de laboratorio del Hospital Afiliado de la Universidad de Hebei su ayuda en la captación de pacientes, el procesamiento de muestras y el cuidado de animales. Este trabajo fue apoyado por la Comisión de Salud de la provincia de Hebei (Subvención nº 20220640).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vector Adenoviral (shNEAT1)10692-V5Vigene BiosciencesAdenovirus utilizado para reducir la expresión de NEAT1 in vivo e in vitro.
Kit de ensayo de proteínas BCA23227Thermo FisherKit utilizado para cuantificar la concentración de proteínas en lisados celulares.
Kit de Ensayo Dual-Luciferase ReporterE1910PromegaKit utilizado para ensayos de reporteros con doble luciferasa para medir la interacción miR-181a-5p.
Kits ELISA (citocinas)N/AR& Sistemas DKits utilizados para medir los niveles de citocinas en muestras de suero y tejido.
Suero fetal bovino (FBS)16000-044GibcoSuplemento utilizado en medios de cultivo para el crecimiento celular.
Anticuerpo GAPDH2118STecnología de señalización celularAnticuerpo primario contra GAPDH utilizado como control de carga en western blot.
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaN/AThermo FisherKit utilizado para la tinción histológica de secciones de tejido para análisis patológicos.
Anticuerpos de inmunofluorescencia (CD206)14693-1-APProteintechAnticuerpo utilizado para detectar el marcador de macrófago M2 CD206 en secciones de tejido.
Lipopolisacáridos (LPS)L2630Sigma-AldrichLPS se utiliza para inducir la polarización inflamatoria de los macrófagos en células RAW264.7.
miR-181a-5p MimicN/AN/AImitador sintético del miR-181a-5p utilizado para modular los niveles del miR-181a-5p.
Plásmido de expresión de NEAT1N/AN/APlásmido utilizado para la sobreexpresión de NEAT1 en macrófagos RAW264.7.
Células de macrófagos RAW264.7TIB-71ATCCLínea celular de macrófagos murinos utilizada para experimentos in vitro.
Búfer de Lisis RIPA89901Thermo FisherTampón utilizado para lisar células y extraer la proteína total.
RPMI-1640 Medium11875-093GibcoMedio de cultivo para macrófagos RAW264.7.
SYBR Green Master Mix4385612Thermo FisherReactivo utilizado para análisis cuantitativo de PCR en tiempo real.
Cámaras de ensayo migratorio Transwell3422CorningCámaras utilizadas para ensayos de migración transwell para evaluar la migración de macrófagos.
Kit de ensayo de apoptosis TUNELAB66110AbcamKit utilizado para detectar apoptosis en células RAW264.7 mediante tinción TUNEL.
Anticuerpos Western Blot (HMGB1)ab18256AbcamAnticuerpo primario contra HMGB1 usado en Western bloting.

Referencias

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