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Artículo de investigación

Los efectos causales de los metabolitos plasmáticos en la lesión del tendón de Aquiles: un estudio de aleatorización mendeliano

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DOI:

10.3791/69807

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27 de marzo de 2026

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1Department of Orthopaedic Centre Hand-Foot Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 2Ningxia Yinchuan Energy College, Nursing College, 3General Surgery Department, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo combinado de aleatorización mendeliana y validación experimental para identificar metabolitos causales en la lesión del tendón de Aquiles, identificando 19 metabolitos plasmáticos con vínculos causales con la lesión del tendón de Aquiles, y demostrando la aplicación terapéutica de 5,6-dihidrotimina e hidroxiasparagina para promover la reparación tisular y reducir la inflamación.

Resumen

Para investigar los efectos causales de los metabolitos plasmáticos en la progresión y recuperación de la lesión del tendón de Aquiles (ATI), se aplicó la aleatorización mendeliana (RM) utilizando un enfoque de dos muestras con datos genéticos de dos grandes conjuntos de datos. Los datos de ATI se obtuvieron del proyecto IEU-OpenGWAS (ebi-a-GCST90018895), mientras que los datos de metabolitos plasmáticos incluyeron 1.400 metabolitos. Se identificaron variables instrumentales (IV) significativas para los metabolitos y se aplicaron cinco métodos de RM —IVW, MR-Egger, mediana ponderada, modo simple y modo ponderado— para evaluar las relaciones causales. Se realizó un análisis de resonancia magnética inversa para explorar el impacto de la ATI en los niveles de metabolitos. La reparación tisular y la expresión de IL-6, TNF-α, VEGFA y TGF-β1 en el tejido tendinoso de Aquiles del ratón se evaluaron al día 7 posttratamiento con 5,6-dihidrotimina (Dih) e hidroxiasparagina (Hyd) utilizando tinción H&E y Western blot. El análisis por RM identificó 19 metabolitos con asociaciones causales significativas con la ITA. De estos, 12 metabolitos, incluyendo Dih (IVW: OR = 1,197, IC 95%: 1,074-1,334; P = 0,001) y Pregnanediol-3-glucurónido (IVW: OR = 1,098, IC 95%: 1,023-1,177; P = 0,001), se asociaron positivamente con la progresión de la ITA. En contraste, 7 metabolitos, como Hyd (IVW: OR = 0,789, IC 95%: 0,707-0,880; P < 0,001), se relacionaron con la recuperación de la ITA. El análisis de RM inversa no indicó efectos causales significativos de la ITA sobre los niveles de metabolitos, lo que sugiere una relación unidireccional. Los análisis de radiografías y H&E revelaron que el tratamiento con Dih y Hyd mejoró significativamente la cicatrización del tendón de Aquiles de manera dependiente de la dosis. Además, el tratamiento con Dih y Hyd redujo notablemente la expresión de IL-6 y TNF-α (P < 0,05) mientras aumentaba los niveles de VEGFA y TGF-β (P < 0,05), lo que indica una reducción de la inflamación y la promoción de la reparación tisular. Este estudio identificó posibles relaciones causales entre metabolitos plasmáticos específicos y los resultados de la ATI. Estos hallazgos pueden informar futuras estrategias terapéuticas y destacar la utilidad de la RM para explorar las asociaciones entre metabolitos y enfermedades.

Introducción

La lesión del tendón de Aquiles (ITA) es una condición musculoesquelética prevalente y debilitante, especialmente entre deportistas e individuos físicamenteactivos 1,2. El tendón de Aquiles, el tendón más grande y fuerte del cuerpo humano, desempeña un papel fundamental en la locomoción, transmitiendo fuerzas desde los músculos de la pantorrilla al talón durante actividades como caminar, correr ysaltar 3,4,5,6. Su suministro limitado de sangre y el alto estrés mecánico que soporta lo hacen especialmente vulnerable al sobreuso y a las lesiones 2,7. La ITA se manifiesta en diversas formas, que van desde tendinopatía leve hasta rotura total, causando dolor significativo, movilidad deteriorada y rehabilitaciónprolongada 8,9. A pesar de los avances en el tratamiento, la ITA suele provocar dolor persistente, disminución de la movilidad y tiempos de recuperación prolongados, con un mayor riesgo de complicaciones crónicas yre-lesión 5,10,11,12.

Estudios recientes han destacado el papel crítico de los metabolitos plasmáticos en el proceso de curación de ATI13,14. Se cree que estos metabolitos, implicados en diversas vías bioquímicas, influyen en factores clave como la inflamación, la reparación tisular y la salud de lostendones. Por ejemplo, aminoácidos y lípidos específicos son esenciales para la síntesis de colágeno y el manejo del estrés oxidativo, ambos cruciales en la patologíatendinosa 16,17. El plasma rico en plaquetas (PRP), rico en factores de crecimiento como PDGF, TGF-β, VEGF e IGF, ha mostrado potencial para promover la curación de los tendones, aunque su eficacia en el tratamiento de la tendinopatía crónica de Aquiles sigue siendo objetode debate. En los últimos años, las tecnologías ómicas de alto rendimiento, como la metabolómica y la proteómica, han ofrecido oportunidades sin precedentes para explorar el panorama molecular de condiciones complejas como ATI18,19. Las tecnologías metabolómicas avanzadas han facilitado la identificación de biomarcadores vinculados a los resultados de la ATI, proporcionando información sobre cómo metabolitos específicos influyen en la progresión y recuperación de lesiones.

El perfilado de metabolitos y el análisis de vías metabólicas se han convertido en enfoques poderosos para identificar biomarcadores y vías asociadas a lesiones20,21. La aleatorización mendeliana (RM) es un método robusto de inferencia causal que utiliza variantes genéticas como variables instrumentales (IVs) para abordar sesgos de confusión comunes en estudios epidemiológicostradicionales 22,23,24,25,26,27. La RM es especialmente útil para estudiar las relaciones causales entre exposiciones, como los metabolitos plasmáticos, y resultados como la ITA. A diferencia de los estudios observacionales convencionales, que son susceptibles a la confusión y causalidad inversa, la RM utiliza variantes genéticas como IVs para proporcionar inferencias causales más sólidas. Una comprensión más profunda de cómo los metabolitos plasmáticos influyen en la salud de los tendones es esencial para avanzar en estrategias terapéuticas y mejorar los resultados de recuperación.

A partir de estos avances, el presente estudio investiga el papel causal de los metabolitos plasmáticos en la ATI mediante la RM. Se analizaron variaciones genéticas asociadas a los niveles de metabolitos para identificar metabolitos específicos vinculados a la progresión y recuperación de la ITA. Además, se validaron experimentalmente metabolitos candidatos, como 5,6-dihidrotimina (Dih) e hidroxiasparagina (Hyd), en modelos animales para dilucidar sus efectos en el curso y curación de la ATI.

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Protocolo

Ética de aprobación y consentimiento para participar

Todos los diseños experimentales con animales se llevaron a cabo estrictamente conforme a las Medidas de Manejo de Animales de Laboratorio de la Provincia de Ningxia y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular de la Región Autónoma Hui de Ningxia, Universidad Médica de Ningxia.

Diseño del estudio

Este estudio investigó las relaciones causales entre 1.400 metabolitos plasmáticos y la ATI empleando una metodología de resonancia magnética de dos muestras. Para garantizar la validez de los IVs en la inferencia causal, deben cumplirse tres supuestos críticos: (1) la variación genética está directamente asociada con la exposición de interés; (2) la variación genética no se confunde por posibles factores de confusión entre la exposición y el resultado; y (3) la variación genética influye exclusivamente en el resultado a través de la exposición y no por vías alternativas.

Fuentes de datos GWAS para ATI

Los datos para el Estudio de Asociación Generalizada del Genoma (GWAS) sobre ATI se obtuvieron del proyecto IEU-OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/), utilizando específicamente el conjunto de datos ebi-a-GCST90018895. El análisis GWAS abarcó a 357.658 individuos de ascendencia europea, comprendiendo 7.746 casos y 349.912 controles. Tras procedimientos de control de calidad, se identificaron un total de 19.072.056 polimorfismos de nucleótido único (SNPs). Los procedimientos de control de calidad incluyeron la eliminación de SNPs con frecuencia alelada menor<0,01, equilibrio Hardy-Weinberg P<1×10-⁶ y tasa de llamada genotípica <0,95. La estratificación poblacional se evaluó mediante análisis de componentes principales y se calculó el factor de inflación genómica (λ) para evaluar el sesgo sistemático.

Fuentes de datos GWAS para metabolitos plasmáticos

El conjunto de datos de Factores de Exposición incluye datos GWAS para 1.400 metabolitos plasmáticos, que consisten en 1.091 niveles de metabolitos y 309 proporciones de metabolitos, según se cataloga en la base de datos GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Los análisis de RM se restringieron a personas de ascendencia europea. La información detallada sobre el conjunto de datos se proporciona en Materiales Suplementarios, Tabla S1.

Selección de IVs

En la identificación de IVs, el umbral de significación estadística de 19.072.056 SNPs asociados a metabolitos plasmáticos se estableció en P < 1 × 10-5. Para asegurar la independencia de los análisis, los SNPs se agregaron usando umbrales de r2 = 0,001 y kilobase (kb) = 10.000, excluyendo 19.037.213 SNPs con r2 > 0,001 y kb < 10.000 para eliminar posibles efectos del Desequilibrio de Enlace (LD). Los SNPs con valores de estadístico F < 10 fueron excluidos de análisis posteriores debido a su alta heterogeneidad, mientras que 34.843 SNPs que cumplían los criterios se mantuvieron como IVs válidos.

Animales y diseño experimental

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de estricta conformidad con las Medidas de Manejo de Animales de Laboratorio de la Provincia de Ningxia y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular de la Región Autónoma Hui de Ningxia, Universidad Médica de Ningxia. Se adquirieron ratones BALB/c machos (8 semanas, grado SPF) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekín, China). Los ratones se aclimataron durante una semana en un entorno controlado (temperatura 23 ± 1°C, humedad 60 ± 10%), con libre acceso a comida y agua estándar, y un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Tras la aclimatación, se estableció un modelo de lesión del tendón murino. Tras una incisión longitudinal cutánea, se expuso el tendón de Aquiles izquierdo y se realizó una transsección transversal estandarizada de grosor completo en el punto medio del tendón utilizando tijeras microquirúrgicas. El tendón fue reparado inmediatamente con suturas 6-0 no absorbibles bajo un estereomicroscopio. Inmediatamente después de la cirugía, se realizaron radiografías para verificar el establecimiento exitoso del modelo murino ATI. Simultáneamente, se adquirieron imágenes de rayos X para el grupo de control bajo condiciones anestésicas idénticas para servir como un controlen blanco 28. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia general inducida por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg·kg-1), y el análisis postoperatorio se administró buprenorfina (0,05 mg·kg-1, subcutánea) cada 12 horas durante 48 h29. Tras la inducción exitosa del modelo, los ratones fueron asignados aleatoriamente a los siguientes grupos: grupos de control, modelo y tratamiento que recibieron Dih en dosis bajas (10 mg·kg-1, LD-Hyd), medias (30 mg·kg-1, MD-Hyd) y altas (50 mg·kg-1, HD-Hyd). Cálculo del tamaño de la muestra: Basándose en datos preliminares que muestran una mejora del 40% en las puntuaciones de cicatrización con el tratamiento de metabolitos (DE = 15%), se determinó que n = 6 ratones por grupo proporcionarían un 80% de potencia para detectar esta diferencia en α = 0,05 (de dos colas). La aleatorización se realizó utilizando números aleatorios generados por ordenador por un investigador cegado ante la asignación de grupos. Los procedimientos experimentales y las evaluaciones de resultados fueron realizados por investigadores que no se veían ante las tareasgrupales 30.

Tinción por hematoxilina y eosina (HE)

Al día 7 tras el tratamiento, los ratones fueron eutanasiados bajo anestesia profunda inducida por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg·kg-1), asegurando la pérdida total de reflejos antes de la recogida de tejido, en consecuencia. El tejido tendinoso lesionado, incluyendo una pequeña porción del tejido blando circundante, fue cuidadosamente extraído y procesado. Se extirpó un trozo de pielde 15 mm 2 centrado en el tendón de Aquiles. Las muestras de piel se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 48 horas, seguidas de deshidratación, incrustación de parafina y seccionamiento de 5 μm. Se evaluaron las características estructurales de la piel de la herida, la formación de tejido de granulación y la infiltración celular inflamatoria mediante tinción H&E. Para la evaluación histológica, se desparafinan secciones en xileno (2 × 10 minutos), se rehidrataron mediante etanol graduado (100%, 95%, 85% y 75%, 5 minutos cada una) y se enjuagaron en agua destilada. Las láminas se teñieron con hematoxilina Harris durante 5 minutos, se enjuagaron con agua del grifo corriente durante 5 minutos, se diferenciaron en alcohol ácido al 1% durante 10 segundos y se enazulearon en agua al 0,2% de amoníaco durante 30 segundos. Después del lavado, las secciones se contra-teñieron con eosina al 0,5% durante 2 minutos, seguidas de deshidratación, limpieza y montaje. Fiabilidad de la evaluación histológica: Para garantizar la precisión de la medición, el 20% de las muestras seleccionadas al azar fueron puntuadas de forma independiente por dos observadores cegados. La fiabilidad entre evaluadores se evaluó utilizando el coeficiente de correlación intraclase (ICC). La ICC para la organización del colágeno fue de 0,89 (IC 95%: 0,81-0,94), para la degeneración tisular de 0,92 (IC 95%: 0,86-0,96) y para la infiltración celular inflamatoria de 0,87 (IC 95%: 0,78-0,93), indicando una excelente fiabilidad. La fiabilidad intra-evaluadora se evaluó haciendo que un observador re-puntuara el 15% de las muestras tras un intervalo de dos semanas, dando valores ICC > 0,85 para todos los parámetros31.

Análisis de Western blot

La expresión proteica fue analizada por Western blot. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el kit de ensayo de concentración de proteínas de BCA. Cantidades iguales de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana estuvo bloqueada durante 1 hora con leche desnatada al 5% en solución fisiológica con Tris-buffer que contenía 0,1% Tween-20 a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios para VEGFA (1:1000, ab46154), TGF-β1 (1:1000, 21898-1-AP), IL-6 (1:1000, 26404-1-AP) y TNF-α (1:1000, 17590-1-AP). Tras tres lavados con PBS, las membranas fueron incubadas con anticuerpos secundarios (1:5000) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando el kit de sustrato quimioluminiscencia ECL (véase la Tabla de Materiales para más detalles) siguiendo el protocolo del fabricante y se analizaron usando el software ImageJ (versión 1.8; Institutos Nacionales de Salud). El GAPDH (10494-1-AP) se utilizó como control de carga.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R Studio. Los paquetes TwoSampleMR e ieugwasr R se emplearon para extraer datos de exposición y filtrar IVs válidos, incluyendo agrupamiento (r² < 0,001, tamaño de ventana = 10.000 kb), armonización de alelos y cálculo de estadística F (F = β²_exposure/SE²_exposure). Para análisis de RM e IRM inversa, utilizamos los paquetes VariantAnnotation, gwasglue y TwoSampleMR, que facilitaron pruebas robustas de inferencia causal y sensibilidad. Se realizó un estudio de resonancia magnética de dos muestras para investigar rasgos relacionados con metabolitos plasmáticos. Se emplearon cinco enfoques analíticos distintos: Ponderación por Inversa de Varianza (IVW), MR-Egger, Mediana Ponderada (WM), Modo Simple y Modo Ponderado. Los resultados primarios se determinaron mediante el método de la FIV, con significación estadística fijada en P < 0,01. El método de la VV asigna pesos para minimizar el impacto de la variación, proporcionando estimaciones de efecto más precisas. La regresión de MR-Egger se utilizó para evaluar la pleiotropía (el fenómeno en el que los genes afectan a múltiples rasgos), evaluando la pleiotropía horizontal mediante el valor P del intercepto (P > 0,05), y la heterogeneidad evaluada usando el método de IVW combinado con la estadística Q de MR-Egger. No se observó heterogeneidad significativa cuando P > 0,05. Se aplicó corrección por pruebas múltiples utilizando el método de la tasa de descubrimiento de falsos errores (FDR) de Benjamini-Hochberg, considerando que FDR < 0,05 era significativo. La heterogeneidad se cuantificó utilizando la estadística Q de Cochran y la estadística I2 , donde la I2 > 50% indicó una heterogeneidad sustancial. Para los valores de I2 , se calcularon intervalos de confianza del 95% siguiendo el método descrito por Ioannidis et al. Los análisis de sensibilidad se realizaron eliminando secuencialmente cada SNP para evaluar la influencia de variantes individuales en los resultados generales.

Para evaluar la fiabilidad de las mediciones, se realizaron análisis de prueba y reprueba sobre medidas clave de resultado (cuantificación de la burbuja blanca y puntuación histológica) utilizando los coeficientes de correlación intraclase (ICC). El ICC se empleó para evaluar la fiabilidad interevaluador e intra-evaluador de la cuantificación y la puntuación histológica de Western Blot (WB). Los criterios se interpretaron de la siguiente manera: por debajo de 0,50 (pobre), entre 0,50 y 0,75 (moderado), entre 0,75 y 0,90 (bueno) y por encima de 0,90 (excelente)32. Tres investigadores independientes evaluaron ciegamente el mismo conjunto de muestras en dos momentos separados por una semana. Los ICC para la cuantificación Western blot de IL-6, TNF-α, VEGFA y TGF-β oscilaron entre 0,87 y 0,93, lo que indica una excelente fiabilidad. Las ICC para la puntuación histológica fueron 0,85 para la organización del colágeno y 0,82 para la evaluación de neovascularización.

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Resultados

Relación causal entre 1.400 metabolitos plasmáticos y ATIs

Se realizó un análisis completo por resonancia magnética de 1.400 metabolitos plasmáticos para evaluar sus efectos causales sobre la ITA. El análisis principal utilizó el enfoque de la FIV, con controles estrictos para el LD y posibles factores de confusión, para identificar metabolitos que impactan significativamente en la progresión y recuperación de la ITA. La Figura 1 muestra las asoci...

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Discusión

Este estudio realizó un análisis completo de resonancia magnética para explorar las relaciones causales entre 1.400 metabolitos plasmáticos y la ATI. Se identificaron diecinueve metabolitos plasmáticos como significativamente asociados con la progresión y curación de la ITA, destacando Dih y Hyd como factores clave que influyen en los resultados de la ITA. Experimentos posteriores in vivo confirmaron el papel beneficioso de estos metabolitos en la promoción de la curación de los...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Investigación de aplicación clínica sobre la evaluación de la flora intestinal y el tratamiento escalonado de úlceras crónicas en el pie diabético, Proyecto de Innovación en Ciencia y Tecnología de Yinchuan (2024SF005). Investigación de aplicación sobre los efectos de diferentes métodos quirúrgicos en el suministro sanguíneo del tejido peritendal y la reparación biomecánica de la ruptura aguda del tendón de Aquiles cerrado bajo el programa de investigación y desarrollo clave de Ningxia (2019BEG3036).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5,6-DihidrotiminaReactivo696-04-8Reactivo
Kit de ensayo de proteínas BCAReactivoP0012Reactivo
Kit de sustrato de quimioluminiscencia ECLReactivoP0018SReactivo
Anticuerpo GAPDHAnticuerpo10494-1-APAnticuerpo
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaReactivoG1120Reactivo
HidroxiasparaginaReactivoH1126Reactivo
Anticuerpo IL-6Anticuerpo26404-1-APAnticuerpo
ImageJSoftwareVersión 1.8Software
Membrana de nitrocelulosaConsumiblesHATF08130Consumibles
ParaformaldehídoReactivoP0099-3LReactivo
RStudioSoftwareVersión 4.5.2Software
Kit de preparación de gel SDS-PAGEReactivoP0012ACReactivo
Pentobarbital sódicoAnestesia200-323-9Anestesia
TGF-& beta; 1 AnticuerpoAnticuerpo21898-1-APAnticuerpo
TNF-& alfa; AnticuerpoAnticuerpo17590-1-APAnticuerpo
Anticuerpo VEGFAAnticuerpoab46154Anticuerpo
Sistema de rayos XInstrumentoMX-20Instrumento

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