Perfilado fitoquímico, cromatografía de gases–análisis de espectrometría de masas y actividad in vivo de la mantalía de Terminalia en ratas

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que integra análisis fitoquímicos, caracterización de Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas, y ensayos in vivo validados para evaluar las actividades antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas de Terminalia mantaly, proporcionando un marco reproducible para la evaluación farmacológica de plantas medicinales.

Resumen

Los fármacos sintéticos para la inflamación, el dolor y la fiebre son eficaces, pero a menudo causan efectos adversos, lo que aumenta el interés en alternativas terapéuticas de origen vegetal. Terminalia mantaly H. Perrier, tradicionalmente utilizada en la medicina africana, tiene una validación científica limitada. Este estudio presenta un protocolo experimental integrado que combina cribado fitoquímico, análisis cuantitativo de compuestos fenólicos y flavonoides, caracterización de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y pruebas farmacológicas in vivo para evaluar el potencial terapéutico del extracto metanolo de T. mantaly. El cribado fitoquímico confirmó la presencia de múltiples clases bioactivas, y el análisis GC–EM identificó veinte constituyentes, incluyendo ácidos grasos, fitoesteroles, tocoferoles y otros compuestos bioactivos con propiedades antiinflamatorias y antioxidantes conocidas. La evaluación farmacológica in vivo en ratas demostró actividad antiinflamatoria dependiente de la dosis en el modelo de edema de la pata inducido por carragenina, una prolongación significativa de la latencia de abstinencia del dolor en el ensayo de inmersión de cola y una reducción de la pirexia inducida por levaduras. En dosis más altas, el extracto mostró efectos comparables a fármacos estándar como el diclofenaco y el paracetamol. Las evaluaciones de toxicidad aguda y citotoxicidad indicaron un perfil de seguridad favorable dentro del rango de dosis probado. En conjunto, estos hallazgos validan el uso etnomedicinal de T. mantaly y demuestran un marco experimental reproducible para vincular la composición fitoquímica con la actividad farmacológica. El protocolo proporciona una referencia metodológica práctica para investigadores que investigan plantas medicinales y apoya el desarrollo de agentes derivados de plantas para el manejo de condiciones inflamatorias y febriles.

Introducción

La inflamación, el dolor y la fiebre son procesos patológicos interconectados que subyacen a una amplia gama de enfermedades agudas y crónicas. Aunque los fármacos sintéticos como los antiinflamatorios no esteroideos, los corticosteroides y el paracetamol siguen siendo la base del tratamiento, su uso a largo plazo suele estar asociado a irritación gastrointestinal, complicaciones renales, hepatotoxicidad y otros efectos^adversos. Estas limitaciones han suscitado un interés creciente por las plantas medicinales como alternativas más seguras y sostenibles para el manejo de condiciones inflamatorias y febriles. Los productos naturales son ampliamente reconocidos por su gran diversidad de moléculas bioactivas, muchas de las cuales sirven como líderes para el desarrollo moderno de fármacos. En este contexto, T. mantaly, miembro de la familia Combretaceae, ha llamado la atención debido a su uso etnomedicinal en sistemas tradicionales africanos para tratar infecciones, enfermedades gastrointestinales y trastornos^{inflamatorios 2,3}. A pesar de su relevancia tradicional, los estudios farmacológicos sistemáticos que validan su potencial terapéutico siguen siendo limitados. En particular, existe una escasez de investigaciones exhaustivas que integren cribado fitoquímico, evaluaciones biológicas in vivo y métodos avanzados de perfilado químico, como GC–MS. Abordar esta carencia es crucial para fundamentar científicamente sus aplicaciones folclóricas e identificar posibles compuestos principales para uso^{farmacéutico 4}. En el presente estudio, el extracto metanolo de T. mantaly fue sometido a una evaluación fitoquímica y farmacológica detallada. El análisis preliminar confirmó la presencia de metabolitos clave, incluyendo fenólicos, flavonoides, taninos, saponinas y terpenoides, todos los cuales se sabe que contribuyen a efectos antiinflamatorios, analgésicos y^{antioxidantes 5}. Los ensayos cuantitativos revelaron además que el extracto contenía niveles sustanciales de compuestos fenólicos y flavonoides, con valores comparables a los estándares de referencia, lo que sugiere un fuerte potencial antioxidante.

Se utilizaron modelos animales porque las respuestas farmacológicas evaluadas involucran vías inflamatorias, neurales y termorreguladoras integradas que no pueden reproducirse in vitro. Los ensayos in vivo proporcionaron evidencia farmacológica clara de bioactividad. Se probaron en ratas las propiedades antiinflamatorias (edema de la pata inducido por la carragenina), analgésicas (inmersión en la cola) y antipiréticas (pirexia inducida por levaduras), demostrando una actividad antiinflamatoria dependiente de la dosis similar a la del diclofenaco sódico en dosis más altas. De manera similar, el extracto aumentó las latencias de inmersión en la cola en ratas, confirmando su eficacia analgésica, mientras que los modelos de pirexia inducida por levadura mostraron efectos antipiréticos notables, muy similares a los del^{paracetamol 6}. El perfilado químico mediante análisis GC–EM proporcionó una visión más profunda de su composición bioactiva. Se identificaron un total de 20 compuestos, incluyendo 3,5-dihidroxi-6-metil-2,3-dihidro-4H-piran-4-ona, ácido linoleico, γ-sitosterol, escualeno y vitamina E. Estos compuestos están bien documentados por sus propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y cardioprotectoras, lo que respalda los resultados farmacológicos^{observados 7,8}. Es importante destacar que las evaluaciones de toxicidad revelaron efectos citotóxicos insignificantes, subrayando su seguridad en las dosis analizadas. En conjunto, este estudio aborda una carencia crítica al proporcionar tanto evidencia fitoquímica como farmacológica sobre el valor medicinal de T. mantaly. Los hallazgos no solo respaldan sus aplicaciones tradicionales, sino que también destacan su potencial como fuente natural de compuestos principales para desarrollar nuevas terapias contra la inflamación y trastornos relacionados. Los modelos experimentales utilizados en este estudio reflejan principalmente respuestas inflamatorias agudas y nociceptivas y, por tanto, proporcionan evidencia farmacológica preliminar en lugar de una indicación directa de eficacia terapéutica crónica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y cumplieron con las recomendaciones de la OCDE. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Bahauddin Zakariya, Multán. (Aprobación: 3 /UREC/2025). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de animales utilizados.

1. Preparación del extracto de Metanol Integral de T. mantaly (TMWM)

1. Recoge tallos, raíces y hojas frescas de T. mantaly, autentica el material vegetal y deposita un ejemplar de comprobación en un herbario reconocido.
   NOTA: El material vegetal utilizado en este estudio fue recogido en el Vivero de Punjab, Mattital Road, Multan, el 12 de noviembre de 2023. Las coordenadas geográficas del sitio de la colección son 30.2236° N, 71.4755° E. La planta fue autenticada taxonómicamente por el taxónomo Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, profesor de botánica de la Universidad Bahauddin Zakariya de Multan, y un ejemplar de comprobación (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) fueron depositados en el herbario de la Universidad Bahauddin Zakariya de Multan. La planta fue recogida de su hábitat natural bajo condiciones ambientales adecuadas, y el lugar de la recogida fue documentado con fotografías.
2. Lava el material vegetal con agua del grifo, seguido de agua destilada para eliminar los contaminantes, y después seca a la sombra a 25–30 °C durante 7–10 días hasta alcanzar un peso constante.
3. Muele el material seco hasta obtener polvo grueso y pesa 500 g usando una balanza analítica. Transfiere el polvo a un recipiente de cristal limpio y añade 2,5 L de metanol.
4. Macerala la mezcla a temperatura ambiente durante 72 horas con agitaciones intermitentes cada 6–8 horas. Filtra a través del papel filtro Whatman No.1.
5. Concentra el filtrado a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 39 °C y luego guarda el extracto seco en recipientes herméticos a temperatura ambiente hasta su uso.
   PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico e inflamable. Realiza la manipulación dentro de una campana extractora mientras llevas guantes y gafas protectoras. Eliminar los residuos de disolventes según las directrices de seguridad química de las instituciones.
   NOTA: El extracto seco puede almacenarse en recipientes herméticos a temperatura ambiente durante varias semanas antes de un análisis adicional.

2. Estimación del contenido fenólico total (método de Folin–Ciocalteu)

1. Preparar una solución de ácido gálico (100 μg/mL) disolviendo 10 mg de ácido gálico en 100 mL de metanol y preparar diluciones en serie que van de 1 a 10 μg/mL.
2. Disuelve extracto de 10 mg en 10 mL de metanol para obtener una solución de 1 mg/mL. Transfiere 0,5 mL de cada estándar o muestra a tubos de ensayo.
3. Añade 2,5 mL de reactivo Folin–Ciocalteu diluido 1:1 con agua, luego añade 2,0 mL de solución de carbonato sódico al 7,5%. Mezcla e incuba a 25 ± 2 °C durante 30 minutos.
4. Mide la absorbancia a 765 nm frente a un reactivo en blanco y calcula el contenido fenólico total como mg de equivalentes de ácido gálico por g de extracto.

3. Estimación del contenido total de flavonoides (método del cloruro de aluminio)

1. Preparar una solución de reserva de rutina (1000 μg/mL) disolviendo rutina en metanol, luego preparar diluciones en serie en el rango de 10–80 μg/mL.
2. Transfiere 0,5 mL de la solución estándar o extractora a tubos de ensayo y añade 1,5 mL de metanol, 0,1 mL de solución de cloruro de aluminio al 10% (AlCl₃), 0,1 mL de solución de acetato de potasio de 1 M y 2,8 mL de agua destilada.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y medir la absorbancia a 415 nm. Expresa los resultados como mg de equivalentes de rutina por g^{extracto 9}.

4. Cromatografía de gases–espectrometría de masas (GC–MS)

1. Disolver extracto de 10 mg en metanol de grado HPLC de 1 mL y filtrar a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm hasta un frasco de GC.
2. Realizar análisis utilizando un GC Agilent 7890B acoplado a un 5977A MS equipado con una columna capilar HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Utiliza helio como gas portador a 1,0 mL/min con la temperatura del inyector a 250 °C.
3. Mantener la temperatura de la fuente iónica en 230 °C y la temperatura cuadrupolar en 150 °C. Programa el horno de 60 °C (2 minutos de aguanta) a 180 °C a 10 °C/min y luego a 280 °C a 5 °C/min con una retención final de 10 min.
4. Inyectar 1 μL del extracto filtrado en modo dividido (10:1) y registrar cromatogramas en un rango m/z de 40–600. Haz un filtro en blanco con disolvente antes de la inyección de la muestra.
5. Identificar compuestos comparando espectros con la biblioteca espectral de masas del NIST y confirmar identidades usando la normalización del tiempo de retención y del área de pico.

5. Actividad antiinflamatoria (edema de las patas inducido por la carragenina)

1. Utiliza ratas Wistar albinas sanas que pesen entre 180 y 220 g y aclimata durante 7 días. Animales rápidos durante la noche antes del experimento con acceso libre al agua.
2. Dividir aleatoriamente los animales en cinco grupos (n = 5 por grupo). Administrar solución salina normal a los controles; administrar por vía oral 100, 200 y 300 mg/kg a los grupos de tratamiento; y administrar diclofenaco sódico (40 mg/kg, subcutáneo) al grupo estándar.
3. Después de 1 hora, inyectar 0,1 mL de carragenina al 1% recién preparada en la región subplantar de la pata trasera derecha.
4. Mide el grosor de la pata en 0, 1, 2, 3 y 4 h usando un calibrador digital de vernier y calcula el aumento respecto a la línea base.
5. Determinar el porcentaje de inhibición del edema en comparación con el grupo^{control 10}.
   PRECAUCIÓN: El polvo de carragenina puede causar irritación. Evitar la inhalación y el contacto con la piel y eliminar los residuos biológicos según los procedimientos de bioseguridad institucional.

6. Actividad analgésica (prueba de inmersión de cola)

1. Utiliza ratas Wistar albinas aclimatadas mantenidas bajo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad con acceso libre a comida y agua.
2. Dividir los animales en cinco grupos (n = 5). Administrar agua destilada a los grupos de control, extraer por vía oral a 100, 200 y 300 mg/kg a los grupos de tratamiento, y paracetamol (20 mg/kg) al grupo estándar.
3. Mantén el baño maría a 55 ± 1 °C. Sumergir 1–2 cm de la cola distal y registrar la latencia de retirada base usando un tiempo de corte de 15 s.
4. Repite las mediciones a los 30, 60, 90 y 120 minutos después del tratamiento, asegurando que la misma parte de la cola quede sumergida cada vez.
5. Calcula el porcentaje de aumento en la latencia y expresa los resultados como media ± SD.

7. Actividad antipirética

1. Utiliza ratas aclimatadas y registra la temperatura rectal normal usando un termómetro digital lubricado.
2. Prepara una suspensión de levadura de cerveza al 20% en agua destilada e inyecta subcutáneamente a 10 mL/kg en el dorso para inducir pirexia.
3. Después de 18 horas, mide de nuevo la temperatura rectal y excluye a los animales que no muestren al menos un aumento de 0,5 °C.
4. Dividir aleatoriamente las ratas con fiebre en cinco grupos (n = 5 por grupo). Administrar solución salina normal al grupo control, extracto vegetal por vía oral a 100, 200 y 300 mg/kg a los grupos de tratamiento, y paracetamol (150 mg/kg) al grupo estándar.
5. Mide la temperatura rectal a 0, 1, 2 y 3 h después del tratamiento y calcula la reducción respecto a la línea base¹¹.
   PRECAUCIÓN: Las suspensiones de levadura de cerveza son materiales biológicos y deben manipularse con las precauciones estándar de bioseguridad. Deshacerse de los materiales en suspensión no utilizados y contaminados como residuos biológicos.
   NOTA: Tras la inyección de levaduras, los animales pueden ser devueltos a jaulas y mantenidos en condiciones estándar hasta la medición de la temperatura.

8. Estudios de toxicidad aguda

1. Realizar el estudio según la directriz 423 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) utilizando ratas Wistar albinas sanas de ambos sexos que pesan entre 180 y 220 g.
2. Ayuno animales durante la noche antes de la dosificación y divídelos aleatoriamente en grupos (n = 5 por grupo).
3. Administrar una dosis oral única de 5 g/kg de peso corporal del extracto a los animales tratados y agua destilada (1 mL/kg) a los animales de control.
4. Observa a los animales de forma continua durante las primeras 4 horas tras la dosis, periódicamente durante las primeras 24 horas y diariamente durante 14 días.
   NOTA: Los criterios de observación incluyen cambios en la condición de la piel y el pelaje, ojos y mucosas, patrón respiratorio, salivación, temblores, convulsiones, actividad locomotora y respuestas conductuales generales.
5. Registrar signos clínicos de toxicidad, mortalidad y peso corporal en el día 0, día 7 y día 14.
6. Evaluar la seguridad en función de la tasa de supervivencia y los cambios conductuales o físicos^{observados 12}.
   NOTA: La puntuación conductual incluye el seguimiento de la postura, la marcha, el nivel de actividad, el comportamiento de acicalamiento, la respuesta a estímulos externos y los signos de letargo o hiperactividad.

9. Análisis estadístico

1. Compila todos los datos experimentales y expresa los resultados como media ± desviación estándar con n = 5 animales por grupo.
2. Introduce los datos en el software GraphPad Prism en formato columna.
3. Evalúa la normalidad de los datos utilizando la prueba de Shapiro–Wilk antes de aplicar el análisis comparativo.
4. Realiza análisis estadísticos usando el software GraphPad Prism seleccionando: Analizar → ANOVA unidireccional → comparaciones múltiples de Tukey.
5. Realizar un análisis unidireccional de la varianza seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey para determinar la significación estadística entre grupos.
6. Consideremos diferencias estadísticamente significativas en p < 0,05.

Resultados

Los enfoques experimentales descritos en este estudio generaron datos reproducibles in vitro e in vivo que permitieron evaluar tanto la composición fitoquímica como las actividades farmacológicas del extracto metanolo de T. mantaly. Todas las mediciones experimentales se realizaron en réplicas y los resultados se presentan como media ± desviación estándar (DS). La significación estadística entre grupos se determinó mediante ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey, considerando p < 0,05 sig...

Discusión

En este estudio, se utilizó una combinación de caracterización fitoquímica y modelos farmacológicos establecidos in vivo para evaluar el potencial antiinflamatorio, analgésico y antipirético del extracto metanol de T. mantaly. Los modelos experimentales empleados se utilizan ampliamente en la investigación de productos naturales y proporcionan un marco práctico para la evaluación preliminar de la actividad biológica.

Los tiempos de retención reproduci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratas Wistar albinas	Casa de animales institucional	N/A	Animales experimentales
Cloruro de aluminio	Sigma-Aldrich	237051	Ensayo flavonoide
Cervecero' S levadura	Sigma-Aldrich	YSC2	Inducción por pirexia
Carragenino	Sigma-Aldrich	C1013	Inducción del edema de la pata
Centrifugadora	Eppendorf	5810R	Procesamiento de muestras
Diclofenaco sódico	Sigma-Aldrich	D6899	Estándar antiinflamatorio
Termómetro rectal digital	Omron	MC-246	Medición de temperatura rectal
Pinza vernier digital	Mitutoyo	500-196-30	Medición del grosor de la pata
Agua destilada	Internamente	N/A	Disolvente
Folin– Reactivo de Ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252	Ensayo fenólico
Ácido galo	Sigma-Aldrich	G7384	Estándar fenólico
Sistema GC– MS	Agilent Technologies	7890B– 5977A	Perfilado fitoquímico
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 8.0	Software de análisis estadístico
Metanol (grado HPLC)	Merck	106009	Disolvente de extracción
Aguja de gavage oral	Instech	FTP-20-38	Administración oral
Paracetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Estándar analgésico y antipirético
Acetato de potasio	Merck	104820	Ensayo flavonoide
Evaporador rotatorio	Bü chi	R-200	Concentración del extracto
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Estándar flavonoide
Carbonato de sodio	Merck	106392	Ensayo fenólico
UV– Espectrofotómetro visible	Shimadzu	UV-1800	Medición de absorbancia
Baños maria (termostático)	Memmert	WNB14	Prueba de inmersión en la cola