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Artículo de investigación

La decocción de Gegen Qinlian atenúa la colitis ulcerosa al inhibir la PANoptosis: un estudio multiómico y experimental

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DOI:

10.3791/69858

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22 de mayo de 2026

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1College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Gynaecology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou University, 4College of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5College of Health and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6State Key Laboratory of Oral Diseases, National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Traditional Chinese Medicine, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 7Department of Stomatology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que integra análisis multiómico con validación in vivo para investigar cómo la Decocción de Gegen Qinlian alivia la colitis ulcerosa al regular los objetivos relacionados con la PANoptosis y las vías inflamatorias de señalización.

Resumen

Presentamos un protocolo integrado de bioinformática y farmacología de redes para aclarar los mecanismos terapéuticos de la Decocción de Gegen Qinlian (GQD) en la colitis ulcerosa (UC), con especial atención a la regulación relacionada con la PANoptosis. Este protocolo está diseñado para identificar sistemáticamente compuestos bioactivos potenciales, objetivos terapéuticos, vías de señalización y mecanismos relacionados con el sistema inmunitario mediante la minería de múltiples bases de datos y el análisis transcriptómico. Los perfiles de expresión génica de cohortes de CU, incluyendo GSE87466 y GSE92415 de la base de datos GEO, se analizan mediante análisis de expresión diferencial y análisis ponderado de redes de coexpresiones génicas para identificar genes relacionados con enfermedades. Los objetivos candidatos de la GQD se recopilan de bases de datos públicas de farmacología y se intersectan con genes asociados a UC y PANoptosis para determinar los objetivos terapéuticos principales. A continuación, se realizan la construcción de redes de interacción proteína-proteína, análisis de enriquecimiento y modelado de redes de vías compuesto-objetivo para revelar la base molecular de la actividad GQD. Además, se incorpora el análisis de infiltración inmune para explorar la relación entre genes clave y el microambiente inmunitario intestinal. El acoplamiento molecular se utiliza además para evaluar el potencial de unión entre los principales compuestos activos y los objetivos centrales. Este protocolo proporciona un marco sistemático y reproducible para investigar cómo la GQD alivia la CU modulando la PANoptosis y las vías inflamatorias relacionadas, y puede servir como referencia útil para estudios mecanicistas de otras fórmulas de la medicina tradicional china en enfermedades inflamatorias complejas.

Introducción

La colitis ulcerosa (CU), una de las principales formas de enfermedad inflamatoria intestinal, es un trastorno inflamatorio crónica recurrente que afecta principalmente a la mucosa del colon y normalmente comienza en el recto con una extensión proximal continua. Su patogénesis es compleja e implica una activación inmune mucosa aberrante, disfunción de la barrera epitelial, perturbación microbiana e interacciones desreguladas entre el huésped y el entorno, imponiendo en conjunto una carga sanitaria global considerabley creciente 1,2. La inflamación mucosa persistente no solo provoca síntomas recurrentes como dolor abdominal, diarrea y hematoquecia, sino que también aumenta el riesgo a largo plazo de cáncer colorrectal asociado a la colitis, especialmente en pacientes con enfermedad extensay prolongada 3,4.

El manejo farmacológico actual de la CU se basa principalmente en 5-aminosalicilatos, corticosteroides, inmunomoduladores, biológicos y agentes de pequeñas moléculas, dependiendo de la gravedad de la enfermedad y la respuestaterapéutica 5. Aunque estas estrategias han mejorado los resultados clínicos, una proporción considerable de pacientes sigue experimentando no respuesta primaria, pérdida secundaria de respuesta, intolerancia, dependencia a los esteroides o eventos adversos relacionados con el tratamiento, lo que pone de manifiesto la necesidad de opciones terapéuticas más seguras y orientadas almecanismo. Por lo tanto, identificar programas moleculares aguas arriba que regulen simultáneamente la lesión epitelial y la desregulación inmune intestinal es de gran importancia traslacional.

Estudios recientes han demostrado que la muerte celular programada y desregulada está profundamente implicada en la patogénesis de la CU. Más allá de la apoptosis clásica, la pirooptosis y la necroptosis han estado implicadas en la destrucción de la barrera epitelial y en la amplificación de la inflamación mucosa7. La PANoptosis, una vía inflamatoria programada de muerte celular recientemente definida que integra características clave de la pirooptosis, apoptosis y necroptosis, ha surgido como un marco mecanicista particularmente relevante para las enfermedades inflamatoriascrónicas. Este proceso está coordinado por complejos PANoptosomas multiproteicos e involucra mediadores centrales como ZBP1, RIPK1/RIPK3, CASP8 y moléculas relacionadas con el inflammasoma incluyendo NLRP3, de manera dependiente delcontexto 9. Es importante destacar que la evidencia acumulada indica que la PANoptosis se activa en la CU y puede promover daños epiteliales intestinales, la ruptura de barreras y el desequilibrio inmunitario, contribuyendo así a la progresión de laenfermedad 10,11,12. Estos hallazgos sugieren que la panoptosis no es simplemente una consecuencia posterior de la inflamación, sino que puede representar un ganglio mecanísticamente accionable que vincula la lesión epitelial con la amplificación inmune mucosa.

La Decocción Gegen Qinlian (GQD), una prescripción clásica registrada por primera vez en Shang Han Lun, consiste en Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis y Glycyrrhiza uralensis. Durante mucho tiempo se ha utilizado en la medicina tradicional china para la diarrea y trastornos inflamatorios intestinales. Estudios farmacológicos modernos han demostrado que la GQD puede aliviar la colitis experimental suprimiendo respuestas inflamatorias, restaurando la integridad de la barrera intestinal, remodelando la microbiota intestinal y modulando la homeostasis inmune, incluyendo la señalización y actividad inflamatoria relacionada con Th17/Treg 13,14. Estas acciones multiobjetivo hacen que GQD sea un candidato plausible para intervenir en procesos patológicos relacionados con la PANoptosis en la UC15. Sin embargo, a pesar de la creciente evidencia sobre su eficacia anti-cólico, sigue sin estar claro si la EQG ejerce efectos terapéuticos mediante la regulación coordinada de las redes moleculares asociadas a la PANoptosis.

Actualmente, quedan dos grandes lagunas. En primer lugar, los estudios existentes sobre los mecanismos de muerte celular de la CU se han centrado principalmente en vías aisladas como la apoptosis, la pirooptosis o la ferroptosis, mientras que el papel integrado de la PANoptosis en la mediación de los efectos terapéuticos de las fórmulas herbales no se ha aclaradosuficientemente 7,10,11. En segundo lugar, aunque la farmacología de redes es muy adecuada para caracterizar la naturaleza de "múltiples componentes-múltiples objetivos-múltiples vías" de las fórmulas tradicionales, las predicciones basadas únicamente en bases de datos compuesto y objetivo pueden carecer de especificidad en contexto de enfermedad y requerir priorización transcriptómica y validación experimental para mejorar la plausibilidad biológica y la fiabilidad traslacional 16,17,18,19 . Así, una estrategia integrada que combine transcriptómica de enfermedades, farmacología de redes y verificación in vivo podría proporcionar un marco más riguroso para esclarecer el mecanismo de la GQD en la UC.

En comparación con enfoques basados únicamente en la observación histopatológica, ensayos moleculares de vía única o farmacología de redes basada únicamente en bases de datos, el flujo de trabajo actual se adapta mejor a esta cuestión porque permite la validación cruzada entre señales transcriptómicas del contexto de la enfermedad, la predicción de fórmula-objetivo y la verificación biológica en un modelo experimental de colitis. Las lecturas histológicas o moleculares por sí solas solo pueden capturar dimensiones limitadas de la patología de la UC, mientras que la farmacología de redes por sí sola puede carecer de suficiente especificidad de la enfermedad y apoyo experimental. Al integrar la priorización transcriptómica con la validación in vivo, este flujo de trabajo mejora la plausibilidad biológica de la identificación de objetivos y proporciona un marco más coherente para vincular la intervención de la DBG con los mecanismos asociados a la PANoptosis en la CU.

Este protocolo es más adecuado para estudios mecanicistas que buscan evaluar cómo las intervenciones multicomponente regulan la lesión epitelial, las respuestas inflamatorias y las vías relacionadas con la PANoptosis en la CU experimental. Es especialmente útil cuando el objetivo es conectar la predicción computacional con la validación biológica a nivel animal en un flujo de trabajo estandarizado. Sin embargo, no pretende sustituir los enfoques diagnósticos clínicos, ni aborda de forma integral todas las dimensiones de la patogénesis de la CU, como la heterogeneidad a largo plazo del paciente, las interacciones causales a nivel de microbioma o el mapeo inmune unicelular y espacialmente resuelto. Por lo tanto, su alcance se define mejor como un marco preclínico reproducible para la evaluación orientada a mecanismos y terapéutica.

Por ello, planteamos la hipótesis de que la GQD mejora la colite ulcerosa modulando las redes de señalización relacionadas con la PANoptosis, atenuando así la lesión epitelial intestinal y reprogramando el microambiente inflamatorio. Para probar esta hipótesis, integramos el análisis transcriptómico de la CU con la farmacología de redes para identificar objetivos terapéuticos compartidos y vías clave de la GQD, con especial atención a los reguladores asociados a la PANoptosis. Validamos además los mecanismos previstos en un modelo de colitis murina inducida por dextrano sulfato sódico (DSS). Al combinar la priorización computacional de objetivos con la verificación biológica, este estudio pretendía proporcionar una explicación más relevante para la enfermedad y fundamentada mecánicamente para los efectos anti-CU de la GQD, y ofrecer nueva evidencia que apoye la PANoptosis como un posible eje terapéutico en la CU.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados antes del inicio del estudio por el Comité Ético de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Aprobación nº 2022-126). Solo se utilizaron conjuntos de datos GEO y GWAS disponibles públicamente para los análisis bioinformáticos; Por lo tanto, no se requirió consentimiento informado adicional ni aprobación ética para el componente computacional de este estudio. Todos los procedimientos que involucraban productos químicos peligrosos, muestras biológicas y desechos animales se realizaron de acuerdo con las normativas institucionales de seguridad en laboratorios y los procedimientos institucionales para la eliminación de residuos peligrosos.

Adquisición y preprocesamiento de conjuntos de datos GEO

Los conjuntos de datos transcriptómicos humanos relacionados con la colitis ulcerosa (CU) se extrajeron de la base de datos GEO utilizando la palabra clave "colitis ulcerosa". Tras el cribado de conjuntos de datos de perfilado de expresión con grupos de CU y control sanos claramente definidos y un tamaño de muestra suficiente, se seleccionaron GSE8746620 yGSE92415 21, ambos generados en la plataforma GPL13158, como cohorte de entrenamiento. Estos conjuntos de datos contenían 87 muestras de CU y 21 controles sanos, y 53 muestras de CU y 21 controles sanos, respectivamente. Para validación externa,GSE87473 22 (106 muestras de CU y 21 controles sanos) y GSE1687923 (48 muestras de CU y 12 controles sanos; se incluyeron la plataforma GPL570). Se descargaban archivos en bruto o de matriz en serie e importaban a R para su preprocesamiento. Los identificadores de la sonda se convertían en símbolos génicos según los archivos de anotación correspondientes de la plataforma. Cuando varias sondas se asignaban al mismo símbolo génico, se mantenía el valor medio de expresión. Las muestras que carecían de información clara sobre los grupos fueron excluidas antes del análisis posterior. Los dos conjuntos de datos de entrenamiento se fusionaron mediante símbolos génicos comunes. Los valores de expresión se transformaron log2 cuando fue necesario, normalizados mediante un procedimiento estándar de normalización entre arrays, y corregidos por efectos por lotes mediante un método de ajuste por lotes tras definir el origen del conjunto de datos como variable por lotes. El análisis de componentes principales y la inspección de diagramas de caja se usaron antes y después de la normalización/corrección por lotes como puntos de control de calidad. El preprocesamiento exitoso se definió por una mejora en la superposición de las distribuciones de muestras entre conjuntos de datos y la atenuación del agrupamiento basado en conjuntos de datos. Se recopilaron un total de 902 genes relacionados con PANoptosis a partir de la literatura publicada y se utilizaron como conjunto génico de referencia para el análisis integrativo.

Identificación de genes expresados diferencialmente y construcción de la red WGCNA

La matriz de entrenamiento combinada se analizó en R utilizando un flujo de trabajo de expresión diferencial. Genes con|log 2 de cambio de multiplicación| ≥ 0,585 y P ajustado < 0,05 se definieron como genes expresados diferencialmente (DEGs). Se generaron gráficos volcánicos y mapas de calor como salidas intermedias para confirmar que los criterios de filtrado arrojaron diferencias de expresión biológicamente interpretables entre los grupos de UC y control. Para el análisis ponderado de la red de coexpresiones génicas (WGCNA), los genes se clasificaron por varianza entre muestras, y el 25% superior de genes más variables se mantuvo como entrada. Se examinó primero un árbol de agrupamiento de muestras para identificar posibles muestras atípicas; no se mantuvieron valores atípicos evidentes para la construcción de la red a menos que la eliminación se justificara mediante criterios de control de calidad. Se seleccionó una potencia de umbral suave en función del índice de ajuste de topología libre de escala, y la potencia más pequeña que logró una red aproximadamente libre de escala se utilizó para construir la matriz de adyacencia. La matriz de adyacencia se transformó entonces en una matriz de solapamiento topológico, y se realizó agrupamiento jerárquico usando disimilitudes basadas en TOM. Los módulos se identificaron mediante corte dinámico de árboles con un tamaño mínimo de módulo de 100 genes. Los módulos estrechamente relacionados se fusionaron cuando su correlación de autogenes superó el criterio de fusión preestablecido. Se calcularon los autogenes de los módulos, la significancia de los módulos y los valores de significancia génica para identificar los módulos más fuertemente asociados con el fenotipo de la CU. Un paso exitoso de la WGCNA se definió por la separación estable de los módulos, tamaños de módulo biológicamente plausibles y uno o más módulos que mostraron una clara correlación con el estado de la enfermedad.

Identificación de objetivos candidatos en GQD

Se recogieron compuestos candidatos y objetivos correspondientes a los cuatro componentes herbales de la Decocción Gegen Qinlian (GQD) —Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis y Glycyrrhiza uralensis— de TCMSP24 y BATMAN-TCM25. Los umbrales de cribado se establecieron de la siguiente manera: biodisponibilidad oral ≥ 30% y similitud con fármacos ≥ 0,18 para registros derivados de una base de datos; la puntuación de confianza ≥ 0,84 y la P ajustada < 0,05 para registros derivados de otra base de datos. Se complementaron compuestos adicionales de una base de datos de medicina herbal cuando no se capturaron registros relevantes en la búsqueda inicial. Las cadenas canónicas SMILES de compuestos retenidos se enviaron a una plataforma de evaluación ADME en línea. Los compuestos se retuvieron cuando mostraron alta absorción gastrointestinal y cumplieron al menos dos reglas de similitud entre Lipinski, Ghose, Veber, Egan y Muegge. Los objetivos putativos se predijeron entonces usando una plataforma de predicción de objetivos con probabilidad > 0,1 y se estandarizaron a símbolos génicos oficiales mediante una base de datos de anotación de proteínas. Los compuestos duplicados y los objetivos duplicados se eliminaron tras la fusión de bases de datos. El resultado esperado de este paso fue un conjunto de datos compuesto GQD no redundante adecuado para análisis de solapamiento.

Identificación de la acción de genes superpuestos y rendimiento del análisis funcional

Los posibles objetivos terapéuticos se definieron como la intersección entre los objetivos relacionados con GQD, los genes relacionados con la CU identificados a partir de la expresión diferencial y el WGCNA, y el conjunto génico relacionado con PANoptosis. Las relaciones de solapamiento se visualizaron usando un diagrama de Venn. Los genes que se intersectaban se sometieron entonces a una base de datos de interacción proteína-proteína (PPI), y se conservaron pares de interacción con puntuación de confianza ≥ 0,4. La red PPI resultante fue exportada y visualizada en una plataforma de análisis de red. Un paso exitoso de PPI se definía por la presencia de una red conectada que contenía la mayoría de los genes intersectantes en lugar de solo nodos aislados. El análisis de enriquecimiento funcional, incluyendo el análisis de Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), se realizó en R con q < 0,05 como umbral de significación. Se excluyeron los términos o vías que no cumplían este umbral. Se resumieron los procesos biológicos y las vías de señalización enriquecidos para inferir el mecanismo potencial a través del cual la GQD podría regular la CU. Se generaron diagramas de barras y diagramas de burbujas como salidas intermedias para verificar si los resultados del enriquecimiento estaban dominados por vías relacionadas con la inflamación, la inmunidad o la lesión epitelial, como era de esperar en el contexto biológico.

Análisis de patrones de expresión, localización cromosómica y correlaciones

Se compararon los niveles de expresión de los genes compartidos entre los grupos de CU y control utilizando un flujo de trabajo estándar de visualización de expresión diferencial en R. Se generaron diagramas de caja y mapas de calor, y se consideró estadísticamente significativo P < 0,05. Solo se conservaron genes con dirección de expresión interpretable y comportamiento consistente en toda la cohorte de entrenamiento para la evaluación mecanicista posterior. La localización cromosómica de genes centrales seleccionados se mapeó tras formatear los archivos de anotación génica en la estructura de entrada requerida, y las posiciones genómicas se visualizaron mediante un flujo de trabajo de trazado cromosómico circular. Las matrices de correlación entre los genes centrales se calcularon después mediante análisis de correlación par a par. El resultado esperado de este paso fue la identificación de pares de genes que mostraran patrones de expresión coordinados que pudieran apoyar la regulación compartida o la interacción funcional.

Construcción y evaluación de modelos de aprendizaje automático

El desarrollo del modelo diagnóstico se realizó utilizando la cohorte de entrenamiento fusionada (GSE87466 + GSE92415), mientras que GSE16879 y GSE87473 se usaron como conjuntos de datos externos independientes de validación. Se utilizaron doce algoritmos de aprendizaje automático —Lasso, Ridge, Stepglm, XGBoost, Random Forest, Enet, plsRglm, GBM, NaiveBayes, LDA, glmBoost y SVM— para generar 113 combinaciones demodelos, 26. Se aplicó una validación cruzada diez veces dentro de la cohorte de formación. En cada plegado, el entrenamiento del modelo, la selección de características y la estimación de rendimiento se realizaron usando la misma lógica de particionamiento de entrenamiento/prueba para evitar fugas de información. El rendimiento del modelo se evaluó principalmente por el área bajo la curva característica de funcionamiento del receptor (AUC). El modelo óptimo se definió como el modelo con el mayor promedio de AUC en los conjuntos de datos de entrenamiento y validación, en lugar del AUC de entrenamiento más alto por sí solo. No se conservaron modelos que mostraron un AUC de entrenamiento muy alto pero un bajo rendimiento de validación externa. Se generaron curvas ROC para cada modelo retenido y se construyó un nomograma a partir de los biomarcadores seleccionados finalmente. Un paso exitoso de modelado se definió por un rendimiento estable en la validación cruzada y la preservación de la capacidad discriminativa en los conjuntos de datos externos.

Rendimiento de la expresión génica de GSVA y del núcleo de perfil

Se realizó un Análisis de Variación del Conjunto Génico (GSVA) para comparar el enriquecimiento de vías entre grupos de alta y baja expresión definidos por el valor mediano de expresión de cada gen central. Se utilizó un P ajustado < 0,05 como corte para diferencias significativas en las vías. Las vías que no cumplían este umbral quedaron excluidas de la interpretación. Se generaron mapas de calor y gráficos de correlación para ilustrar la actividad de las vías y los patrones de coexpresión. El éxito intermedio de este paso se indicó por perfiles de enriquecimiento consistentes con una desregulación inflamatoria, inmune o metabólica relevante para la CU.

Análisis del paisaje inmunitario y construcción de la red de CERNA

La composición de las células inmunitarias se estimó mediante un algoritmo de deconvolución con 1.000 permutaciones. Las muestras que no cumplían el criterio de significación interna de la deconvolución fueron excluidas del análisis posterior de correlación inmunitaria. Para complementar este análisis, también se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos de muestra única (ssGSEA) para evaluar patrones de infiltración inmune. Luego se calcularon y visualizaron las correlaciones entre las fracciones de las células inmunitarias y la expresión génica central. Para la construcción de la red de ceRNA, se identificaron miARN dirigidos a los mRNAs centrales a partir de bases de datos de interacción públicas, y posteriormente se cribraron los lncRNAs candidatos que interactuaban con estos miARN. Solo se conservaron las interacciones soportadas por registros de predicción o anotación de bases de datos. La red reguladora de ARNm-miARN-lncRNA se visualizó en una plataforma de análisis de red. El resultado esperado de este paso fue una red estructurada de ceRNA con reguladores ascendentes biológicamente plausibles vinculados a los genes centrales.

Rendimiento del análisis de celda única

El conjunto de datos de una sola celda GSE214695 se importó a R y se convirtió en objetos de una sola celda utilizando un flujo de trabajo estándar de análisis de celda única. El control de calidad se realizaba filtrando las células según métricas estándar, incluyendo células de baja característica, posibles gotas vacías y células con baja calidad de transcripción. Se normalizaron las células que pasaron el control de calidad y se seleccionaron los 2.000 genes más variables para el análisis de componentes principales. Los componentes principales que contribuyeron a la variación biológica significativa se mantuvieron para el agrupamiento no supervisado, y UMAP se utilizó para la visualización bidimensional. Los genes marcadores de conglomerado se identificaron mediante análisis de expresión diferencial entre conglomerados. La anotación por tipo de celda se realizaba entonces mediante clasificación basada en referencias, y las anotaciones se contrastaban con la expresión canónica de marcadores cuando era posible. Un paso exitoso en una sola célula se definió mediante la separación clara de las principales poblaciones celulares en el gráfico UMAP, genes marcadores interpretables para cadagrupo 27 y una anotación consistente de los principales tipos celulares inmunes y estromales relevantes para la CU.

Rendimiento del análisis de aleatorización mendeliana

Se realizó una aleatorización mendeliana (RM) de dos muestras para evaluar posibles relaciones causales entre la expresión génica central y la susceptibilidad a la CU. Se extrajeron variables instrumentales de conjuntos de datos de locus cuantitativos de rasgos de expresión, y se utilizaron estadísticas resumen de estudios de asociación genómica en UC como conjunto de datos de resultados. Los SNP se evaluaron según criterios estándar de control de calidad de la RM, incluyendo la relevancia para el rasgo de exposición y la eliminación de variantes ambiguas o duplicadas cuando la armonización lo requirió. Se utilizó el método ponderado por inversa de la varianza como estimador causal principal. Se aplicó la prueba Q de Cochran para evaluar la heterogeneidad. Se utilizaron análisis MR-Egger y MR-PRESSO como análisis de sensibilidad para evaluar y, cuando fue necesario, corregir la pleiotropía horizontal. Un paso exitoso de la RM se definió por la armonización válida del instrumento, la ausencia de heterogeneidad mayor o pleiotropía28, y estimaciones direccionalmente consistentes entre métodos complementarios de RM.

Rendimiento del acoplamiento molecular de compuestos candidatos

Las estructuras tridimensionales de proteínas objetivo se obtuvieron del Banco de Datos de Proteínas, y las estructuras de ligandos de una base de datos pública de moléculas pequeñas. Antes del acoplamiento, las proteínas y ligandos se preprocesaban eliminando moléculas de agua cuando era apropiado, añadiendo hidrógenos, definiendo tipos de átomos y convirtiendo los formatos de archivo necesarios para el acoplamiento. A continuación, se realizó el acoplamiento mediante un flujo de trabajo de acoplamiento molecular, y se calcularon las energías de enlace para cada par ligando-objetivo. Las afinidades de unión inferiores a -5 kcal/mol se interpretaron como unión favorable, mientras que valores inferiores a -7 kcal/mol se interpretaron como una unión relativamente fuerte. Se trazaron mapas térmicos de acoplamiento para comparar patrones globales de unión entre objetivos. Las conformaciones mejor valoradas se visualizaron en tres dimensiones para inspeccionar enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y proximidad a residuos. La finalización exitosa de este paso se definió mediante archivos de salida estables de acoplamiento, poses plausibles de ligandos dentro de la región de unión objetivo y energías de enlace consistentes con la priorización candidata.

Rendimiento de la validación experimental in vivo

Preparación para GQD

El GQD se preparó a partir de cuatro hierbas medicinales tradicionales chinas en las siguientes proporciones de fármacos crudos: 24 g de Puerariae Lobatae Radix (Gegen), 9 g de Scutellariae Radix (Huangqin), 9 g de Coptidis Rhizoma (Huanglian) y 6 g de Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (Gancao). Los detalles de los materiales botánicos y sus fuentes se proporcionan en la Tabla de Materiales. Las hierbas se molían hasta obtener un polvo fino, se mezclaban bien y se remojaban en 390 mL de agua destilada durante 1 hora. La mezcla se decoctó dos veces. En la primera decocción, las hierbas se hirviron a fuego alto y luego se cocieron a fuego lento durante 30 minutos. Tras la filtración mediante gasa, los residuos se volvieron a hacer un rehilo con un volumen de agua multiplicado por diez. Los dos filtrados se combinaron y concentraron en un baño maria hasta alcanzar una concentración final de fármaco bruto de 5 g/mL. El extracto se filtraba, se enfriaba y se almacenaba a 4 °C hasta su uso.

Establecimiento del modelo de ratón UC inducido por el DSS

En este estudio se utilizaron dieciocho ratones BALB/c machos (de 8 semanas), y todos los procedimientos en animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Aprobación nº 2022-126). Los detalles sobre la fuente animal se proporcionan en la Tabla de Materiales. Los ratones se alojaron bajo condiciones específicas libres de patógenos a 20–22 °C y con un 55% de humedad bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Tras un periodo de aclimatación de una semana, los animales se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 6 por grupo): NC, UC y GQD. El grupo NC recibió agua potable estéril durante todo el experimento, mientras que a los grupos de UC y GQD se les administró un 1,5% (p/v) de dextrano sulfato sódico (MW 36-50 kDa) en agua potable durante 5 días consecutivos, seguidos de 2 días de agua normal. Este ciclo se repitió tres veces para establecer colitis crónica. Durante el periodo de intervención, los grupos NC y CU fueron administrados dos veces al día con 200 μL de carboximetilcelulosa sódica al 0,5%, mientras que el grupo GQD recibió GQD por gavage oral dos veces al día.

La prescripción clínica de GQD consistía en 24 g de Gegen, 9 g de Huangqin, 9 g de Huanglien y 6 g de Gancao, lo que corresponde a una cantidad total de 48 g de fármaco crudo al día para adultos. Suponiendo un peso corporal estándar en adultos de 60 kg, la dosis equivalente en adulto era de 0,8 g/kg/día. Según el coeficiente de conversión convencional de humano a ratón de 1:12, la dosis correspondiente para ratón era de 9,6 g/kg/día. Según la proporción preestablecida de dosis baja, media y alta de 1:2:4, las dosis calculadas fueron 9,6, 19,2 y 38,4 g/kg/día, respectivamente. Teniendo en cuenta la gravedad y persistencia de la inflamación colónica en el modelo repetido de colitis inducida por el DSS, se seleccionó el régimen de dosis altas para asegurar una intervención farmacológica adecuada durante la validación in vivo. Para apoyar una exposición farmacológica suficiente durante la fase inflamatoria activa, la dosis diaria total de 38,4 g/kg/día se dividió en dos administraciones iguales. Durante todo el experimento se monitorizó diariamente el peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado rectal. Al final del protocolo, se sacrificaron ratones y se recogieron tejidos de colon para análisis posteriores.

Evaluación del peso corporal e índice de actividad de la enfermedad

El peso corporal se registró diariamente y se expresó como el porcentaje del peso corporal inicial en el día 0. La gravedad de la enfermedad se evaluó utilizando el índice de actividad de la enfermedad (DAI), que incluía tres parámetros: pérdida de peso corporal, consistencia de heces y sangrado rectal. Cada parámetro se puntuó de forma independiente en una escala de 0 a 4 según la gravedad de las manifestaciones clínicas, siendo puntuaciones más altas indicar una actividad de enfermedad más grave. El DAI final se calculó como la media de las tres puntuaciones individuales, dando un total que iba de 0 a 4. En resumen, una puntuación de 0 no indicó anomalía, mientras que las puntuaciones de 1–4 reflejaron una pérdida de peso progresivamente mayor, una mayor consistencia de heces y sangrado rectal más severo. Los criterios detallados de puntuación se presentan en la Tabla 1.

Rendimiento de la tinción H&E y cálculo del índice de actividad histológica

Para la evaluación histológica, los tejidos del colon se fijaron con un 4% de paraformaldehído, se deshidrataron mediante etanol graduado, se incrustaron en parafina y se seccionaron con un grosor de 4 μm. Las secciones se desparafinizaron, rehidrataron, se teñieron con hematoxilina, se contra-tintaron con eosina, se deshidrataron, se limpiaron y se montaron. Las imágenes histológicas se observaron usando un microscopio de campo claro y se escanearon mediante un sistema de escaneo de portaobjetos. La información específica sobre el equipo se enumera en la Tabla de Materiales. La lesión histopatológica se evaluó en función de tres parámetros, incluyendo la disminución de células del cáliz, el daño arquitectónico de la cripta y la infiltración de células inflamatorias. Cada parámetro se puntuó según el grado de lesión tisular, y la suma de las puntuaciones de los tres parámetros se definió como el índice de actividad histológica (IAI), que va de 0 a 10, como se resume en la Tabla 2. Para la cuantificación de la celda de cáliz, se analizaron cinco campos no solapados seleccionados al azar por sección con un aumento del 400×. El número de células de cáliz por campo se contaba manualmente de forma cega, y se calculaba el conteo medio por campo para cada sección de colon representativa.

Rendimiento de la tinción inmunohistoquímica

Tras la deparafinización y rehidratación, las secciones tisulares fueron sometidas a una extracción de antígenos con 0,1% de tripsina a 37 °C durante 30 minutos, seguida de incubación con peróxido de hidrógeno al 3% para bloquear la actividad endógena de la peroxidasa. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios de conejo contra STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP) y HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177), diluidos en 1% de BSA. Los detalles de los anticuerpos y sus fuentes se proporcionan en la Tabla de Materiales. Tras el lavado con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente (1:2000) a temperatura ambiente durante 1,5 h. La inmunorreactividad se visualizó mediante un reactivo de detección cromogénica y los núcleos se contracoloraron con hematoxilina. El análisis cuantitativo de imágenes se realizó utilizando software de análisis de imágenes que aparece en la Tabla de Materiales.

Rendimiento del análisis qRT-PCR

El ARN total se extrajo utilizando un reactivo de extracción de ARN basado en fenol y se transcribió inversamente con un kit de síntesis de ADNc de primera hebra. La transcripción inversa se realizó a 25 °C durante 10 minutos, 55 °C durante 15 minutos y 85 °C durante 5 minutos. Posteriormente se realizó qRT-PCR utilizando un sistema de PCR en tiempo real y una mezcla SYBR Green qPCR. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 60 s, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 45 s. Las secuencias de cebadores fueron diseñadas utilizando software de diseño de cebadores y se enumeran en la Tabla 3. Se utilizó GAPDH como referencia interna, y los niveles relativos de expresión de ARNm se calcularon mediante el método 2^-ΔΔCt . Cada muestra se analizó en triplicado y cada experimento se repitió al menos tres veces. Los detalles de los reactivos, instrumentos y software se proporcionan en la Tabla de Materiales.

Desempeño del análisis de western blot

Los tejidos del colon se homogeneizaron en un tampón de lisis que contenía inhibidor de proteasa sobre hielo y se lisaron completamente durante 2 horas. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un kit de ensayo proteico. Se mezclaron cantidades iguales de proteína con tampón de carga, se desnaturalizaron antes de la electroforesis, se separaron con un 10% de SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas PVDF a 100 V durante 1 hora. Tras bloquear con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios de conejo contra STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP), HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177) y GAPDH a la correspondiente dilución de trabajo. Tras lavarse con TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20; pH 7,4), las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario correspondiente (1:5000) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un reactivo quimioluminiscente de detección. Las intensidades de las bandas se analizaron mediante software de análisis de imágenes, y los niveles de expresión de las proteínas objetivo se normalizaron a GAPDH. Los pesos moleculares esperados de las proteínas detectadas fueron aproximadamente 88 kDa para STAT3, 21 kDa para TIMP1, 28 kDa para SPHK2, 70 kDa para HSPA5 y 36 kDa para GAPDH. Los detalles de los anticuerpos, membranas, reactivos y software se proporcionan en la Tabla de Materiales. Nombres específicos de productos, fabricantes, números de catálogo, modelos de instrumentos y detalles de software se proporcionan en la Tabla de Materiales, mientras que en el texto principal se utilizan descripciones genéricas para mejorar la neutralidad y la aplicabilidad general.

Rendimiento del análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando software estadístico. Se utilizó ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones multigrupos. Se consideró estadísticamente significativo un valor P ≤ 0,05.

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Resultados

Adquisición de conjuntos de datos GEO e identificación génica relacionada con UC

Para investigar los cambios en la expresión génica en la CU, se obtuvieron dos conjuntos de datos transcriptómicos —GSE87466 y GSE92415— de la base de datos GEO utilizando "colitis ulcerosa" como término de búsqueda, con criterios de selección que incluyen el tipo de conjunto de datos, anotación clara de enfermedad/control y tamaño suficiente de la muestra. Estos ...

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Discusión

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria intestinal crónica e idiopática que afecta principalmente a la mucosa del colon, caracterizada por una inflamación persistente o episódica. La enfermedad disminuye significativamente la calidad de vida del paciente y aumenta el riesgo de desarrollar carcinoma colorrectal. Aunque su prevalencia global está aumentando de forma constante, la etiología precisa y los mecanismos subyacentes solo se comprenden parcialmente. Las opciones de...

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Divulgaciones

Los autores afirman que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

Los autores también agradecen a la base de datos GEO el acceso abierto a los datos y a los revisores por sus comentarios constructivos.

FINANCIACIÓN: Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973684, 82174358), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Sichuan (2023NSFSC1760, 2025ZNSFSC1834), el Proyecto Especial de Investigación en Medicina Tradicional China de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan (2023MS365, 2020JC0094), y el Fondo Conjunto de Innovación de la Comisión de Salud de Chengdu y la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (WXLH202402019, WXLH202403012, WXLH202501238, WXLH202501201).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Puerariae Lobatae RadixMedicina Tradicional China de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-001Material herbal para la preparación de GQD
Scutellariae RadixMedicina Tradicional China de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-002Material herbal para la preparación de GQD
Rizoma de coptidisMedicina Tradicional China de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-003Material herbal para la preparación de GQD
Glycyrrhizae Radix et RhizomaMedicina Tradicional China de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-004Material herbal para la preparación de GQD
Ratones BALB/c, macho, 8 semanasBeijing HFK Bioscience Co., Ltd.N/AAnimales experimentales
Dextrán sulfato sódico (DSS), MW 36-50 kDaMP Biomedicina160110Reactivo que induce colitis
Carboximetíla celulosa sódicaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.C5678Vehículo para la gavage oral
ParaformaldehídoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.158127Fijador tisular
HematoxilinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.H9627Tinte nuclear
EosinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.E4009Contratinción para histología
Microscopio de campo claroNikonEclipse 80iObservación histológica
Sistema de escaneo de diapositivas3DHISTECH Ltd.Panoramic 250Adquisición digital de imágenes completas de diapositivas
TripsinaGibco, Carlsbad, CA, EE. UU.25200-056Reactivo de recuperación de antígenos
Peróxido de hidrógenoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.H1009Bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.A7906Diluyente de anticuerpos / reactivo bloqueante
Anticuerpo primario anti-STAT3, conejoTecnología de señalización celular9139Anticuerpo primario para IHC/WB
Anticuerpo primario anti-TIMP1, conejoAbcamab211925Anticuerpo primario para IHC/WB
Anticuerpo primario anti-SPHK2, conejoAbcamab187030Anticuerpo primario para IHC/WB
Anticuerpo primario anti-HSPA5, conejoTecnología de señalización celular3177Anticuerpo primario para IHC/WB
Anticuerpo primario anti-GAPDH, conejoAbcamab9485Control de carga para WB
Anticuerpo secundario anticonejo de cabraYeasen Biotechnology33201Anticuerpo secundario para IHC/WB
Reactivo de detección cromogénicaBeyotime Biotechnology [Shanghai] Co., Ltd., Shanghái, ChinaP0202Desarrollo de señales para inmunohistoquímica
Software de análisis de imágenesCibernética de los mediosImage-Pro Plus 7.0Cuantificación de la tinción e intensidad de la banda
Reactivo de extracción de ARN basado en fenolInvitrogenReactivo Trizol 15596026Extracción total de ARN
Kit de síntesis de ADNc de primera cadenaBeyotime BiotecnologíaDRR047ATranscripción inversa
Sistema de PCR en tiempo realBiosistemas AplicadosABI Prism 7300Amplificación cuantitativa por PCR
SYBR Mezcla verde qPCRBeyotime BiotecnologíaDRR420AReactivo de detección qPCR
Software de diseño de imprimaciónPremier Biosoft International, Palo Alto, CA, EE. UU.Primer 5.0Diseño de cebadores
Búfer de lisis RIPABeyotime BiotecnologíaP0013BReactivo de extracción de proteínas
Inhibidor de la proteasa (PMSF)Beyotime BiotecnologíaST506Protección de proteínas durante la lisis
Kit de ensayo de proteínas BCABeyotime BiotecnologíaP0010Cuantificación de proteínas
Membrana PVDFMerck MilliporeIPVH00010Membrana de transferencia de proteínas
Reactivo / sistema de detección quimioluminiscenteThermo Fisher Scientific32106Detección de señales para western blot
Software estadísticoIBMSPSS 23.0Análisis estadístico

Referencias

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