Artículo de método

Desarrollo de un modelo eficiente de expansión de tejido murino para la investigación en regeneración cutánea

DOI:

10.3791/69865

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6 de marzo de 2026

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Tenth People's Hospital, Tongji University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación presenta un protocolo práctico y eficiente para establecer un modelo de expansión continua de tejidos en ratas, facilitando así la investigación de mecanismos y el avance técnico en la regeneración cutánea.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La regeneración de la piel es esencial para la curación de diversas heridas superficiales y puede ser promovida mediante estimulación mecánica. La expansión tisular es una estrategia ampliamente utilizada para acelerar la regeneración de la piel mediante un estiramiento mecánico controlado; sin embargo, su eficacia clínica suele estar limitada por una discrepancia entre la carga mecánica y la capacidad regenerativa de la piel. Para abordar esta limitación, es urgentemente necesario desarrollar un modelo animal estandarizado de expansión tisular. En este estudio, establecimos un modelo de expansión tisular en ratas de Sprague-Dawley. Tras la implantación dorsal de un expansor tisular de 10 mL, se inyectaron 5 mL de suero fisiológico inmediatamente después de la cirugía. Tras un periodo de recuperación de dos semanas, los animales se sometieron a un régimen de inyecciones de solución salina dos veces por semana (10 mL por sesión). La cinética de expansión mostró una tendencia característica de crecimiento rápido de la piel seguida de una desaceleración gradual. En las etapas avanzadas se observaron complicaciones graves como necrosis cutánea, descomposición tisular y exposición a expansores. Este trabajo establece un marco preclínico reproducible que imita estrechamente los procesos fisiológicos y patológicos de expansión del tejido humano, proporcionando un modelo fundamental para investigar mecanismos regenerativos y optimizar los protocolos clínicos.

Introducción

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La piel actúa como primera línea de defensa del cuerpo, proporcionando protección mecánica y previniendo la pérdida de agua, además de desempeñar papeles cruciales en la regulación de la temperatura, la respuesta a estímulos externos y la regulacióninmunitaria 1. Las heridas cutáneas son comunes en la práctica clínica, resultantes de traumatismos, infecciones microbianas, daños químicos y resecciónquirúrgica 2. Aunque las heridas pequeñas pueden cicatrizar con un aspecto normal, las lesiones grandes suelen dejar cicatrices fibróticas severas que afectan la función tisular e incluso pueden llegar a ser potencialmentemortales 3. El injerto autólogo de piel de grosor completo es ampliamente considerado el estándar de oro para el manejo de heridas grandes y la prevención decicatrices 4. Sin embargo, conseguir suficiente piel injertable sigue siendo un desafío clínico crítico. En consecuencia, el desarrollo de tecnologías innovadoras de regeneración de la piel se ha convertido en un foco central en los campos de la medicina regenerativa y losbiomateriales 5.

Desde que Neumann introdujo por primera vez el principio de expansión tisular en 1957 implantando un balón de polietileno en la región mastoides postauricular para reconstruir una deformidad deloído 6, esta técnica ha evolucionado significativamente. Hoy en día, es uno de los métodos más adoptados en cirugía reconstructiva y sigue siendo un enfoque vital para abordar defectos cutáneos extensos. Específicamente, la expansión tisular genera tejido autólogo adicional al reclutar piel adyacente y estimular la regeneración7. Impulsada por estimulación mecánica, la piel recién formada se parece mucho a la piel nativa tanto en apariencia como en estructura, lo que la hace ideal para su aplicaciónclínica. Sin embargo, debido a una discrepancia entre la magnitud de la fuerza de carga y la tasa de crecimiento de la piel en la fase avanzada, la cantidad de piel cosechada resulta insuficiente para una cobertura de heridas a granescala 9. Además, el avance de la tecnología de expansión tisular se ve obstaculizado por una eficacia de expansión subóptima, complicaciones graves, métricas cuantitativas incompletas de evaluación y mecanismos moleculares pococaracterizados 10. Dada la complejidad de las redes reguladoras in vivo, los modelos animales adecuados de expansión tisular son esenciales para recapitular fielmente las respuestas fisiológicas y patológicas de los tejidos cutáneos a la estimulación mecánica.

Actualmente, los modelos murinos (ratón y rata) y porcinos son la opción predominante para los estudios in vivo. Los modelos de expansión dorsal o del cuero cabelludo en ratón se utilizan ampliamente debido a su facilidad de uso; sin embargo, la piel es demasiado fina para tolerar una expansión prolongadao continua 12. El modelo de expansión dorsal de la rata es adecuado para la expansión continua debido a su extenso espacio subcutáneo, pero la falta de un protocolo definitivo para terminar la expansión limita su aplicabilidadclínica 13,14. Aunque la piel porcina comparte el mayor grado de homología con la piel humana, su menor elasticidad provoca respuestas tardías al estiramiento mecánico, y la necesidad de sedación profunda durante el proceso hace que la manipulación experimental sea considerablemente másdesafiante 15. Por lo tanto, desarrollar un modelo adecuado de expansión continua que imite el proceso clínico sigue siendo un desafío científico.

El propósito de este estudio fue desarrollar un modelo de expansión continua de la piel en ratas. Brevemente, se insertó un expansor de silicona de 10 mL en la región dorsal de ratas Sprague-Dawley (SD), y se inyectó 5 mL de solución fisiológica inmediatamente después de la cirugía. Tras un periodo de recuperación de dos semanas, se administraban 10 mL de solución salina dos veces por semana hasta alcanzar un volumen acumulado de 155 mL, momento en el que se observó un descenso significativo en la generación de piel, lo que sugiere el agotamiento de la capacidad regenerativa. El agotamiento regenerativo indica un declive crítico en la capacidad regenerativa de la piel, caracterizado a nivel celular por una disminución del potencial proliferativo y la descomposición de la matrizextracelular 16. Macroscópicamente, esto se manifiesta como un marcado deterioro de la textura de la piel, que se manifesta como adelgazamiento cutáneo, isquemia y estrías distensas, que pueden progresar hacia necrosis y descomposicióntisular 17. Además de su simplicidad técnica, este modelo preclínico replica con éxito la expansión continua de la piel, permitiendo a los investigadores investigar diferentes etapas de expansión adaptadas a objetivos específicos de investigación. Este método de modelado también puede aplicarse a ratas genéticamente modificadas, facilitando la elucidación de funciones génicas clave y así descubriendo los mecanismos subyacentes. Además, la amplia superficie de la piel dorsal facilita un diseño de estudio autocontrolado, permitiendo aplicar tanto tratamientos experimentales como de control en el mismoanimal 18. En conjunto, este modelo proporciona una herramienta útil para investigar mecanismos específicos implicados en la expansión tisular y contribuye a superar las limitaciones tecnológicas actuales.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular Noveno de Shanghái (Nº SH9H-2025-A1673-1) y se lleva a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Preparación

  1. Aclimata a todas las ratas SD durante 7 días antes del estudio. Ratas de SD de casa en una instalación animal con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Proporciona una dieta estándar a base de trigo y soja y agua ad libitum durante todo el experimento.
  2. Diseña expansores tisulares semicirculares de 10 mL para uso experimental (Figura 1A), que comprenden un globo expansil, un puerto de inyección y un catéter conectivo. Esteriliza los expansores mediante irradiación por haz de electrones (25 kGy). Antes de la cirugía, comprueba la integridad de cada expansor para garantizar su seguridad. Inyecta 10 mL de suero salino por el puerto de inyección, luego observa la permeabilidad del catéter conectivo y la expansión para confirmar la ausencia de fugas de agua.
    NOTA: Drena la solución fisiológica normal preinyectada.

2. Cuidado animal preoperatorio e intraoperatorio

  1. Adquiere ratas machos de SD de 6-8 semanas de edad, con un peso de 240-260 g.
  2. Anestesiar a las ratas SD inhalando isoflurano. Coloca a las ratas en la cámara de inducción e induce anestesia usando isoflurano al 5% a un caudal de 3 L/min. Mantener la anestesia durante la operación usando isoflurano al 2% a un caudal de 1,5 L/min.
  3. Coloca a las ratas SD anestesiadas en un algodón para mantener el calor durante la cirugía, y colócalas sobre una compresa eléctrica (aproximadamente 28 °C) durante 20 minutos tras la recuperación de la anestesia para evitar la hipotermia.
  4. Utiliza el reflejo de retirada de pellizcos en el dedo del pie para evaluar la profundidad de la anestesia.
    NOTA: Monitoriza la frecuencia y el patrón respiratorio, la temperatura corporal y el color de la piel de los dedos de las ratas SD anestesiadas.

3. Implantación de expansores tisulares

  1. Afeita la piel dorsal de las ratas SD con una máquina de cortar. Evalúa el color de la piel, la textura y la presencia de cualquier lesión para determinar la idoneidad para la expansión.
  2. Dibuja una línea de puntos horizontal en el centro de la espalda para marcar la ubicación de la incisión. Desinfecta la zona afeitada con alcohol al 75% y cúbrela con una cortina de apertura estéril.
  3. Administrar solución fisiológica normal por vía subcutánea a lo largo de la línea marcada usando una jeringuilla de 1 mL con una aguja de 30 g (0,31 mm de diámetro), y luego realizar una incisión horizontal con bisturí. Realizar una disección extensa del tejido subcutáneo por encima y por debajo de la incisión a lo largo de la fascia muscular dorsal. Crea un bolsillo lo suficientemente grande para alojar el globo de expansión y el puerto de inyección usando pinzas mosquito. Coloca el polo inferior del globo de expansión a 3-5 cm de la incisión, con el ápice mirando hacia la capa de piel y la placa base apoyada en el músculo. Además, sutura la fascia a ambos lados adyacentes a la unión del catéter conectivo y el puerto de inyección para estabilizar el puerto. Ajusta las posiciones del globo y del puerto de inyección para asegurarte de que el tubo de conexión esté libre de curvas o dobleces pronunciadas (Figura 1B).
    NOTA: La inyección normal de solución salina facilita la incisión cutánea y la identificación del plano anatómico. Orienta el puerto de inyección con el lado blando hacia la capa de piel para permitir las inyecciones de solución posteriores.
  4. Cierra las incisiones usando suturas 4-0 interrumpidas. Posteriormente, inyecta 5 mL iniciales de suero fisiológico con una aguja para el cuero cabelludo de 25 g (0,5 mm de diámetro).
    NOTA: Sutura la incisión con cuidado para evitar perforar el expansor con la punta de la aguja. Inserta la aguja del cuero cabelludo verticalmente en el puerto de inyección y sírvela verticalmente.
  5. Deja que la rata SD se recupere de la anestesia y colócala en una jaula individual.

4. Proceso de expansión continua

  1. Permite que las ratas SD portadoras de expansores se recuperen durante 2 semanas, asegurando la cicatrización completa de la incisión. Marque una caja de línea discontinua de 2,5 × 2,5 cm en el área de expansión para facilitar la visualización de los cambios en la piel (Figura 2A).
  2. Anestesiar ratas SD usando el método descrito en los pasos 2.2 a 2.4. Afeita la región de expansión para facilitar la observación. Termina el proceso de expansión inmediatamente si la expansión cutánea se ve complicada por una infección, equimosis o necrosis.
    NOTA: Afeita la zona en expansión al menos una vez por semana para permitir el crecimiento rápido del vello.
  3. Afeita la zona alrededor del puerto de inyección y desinfecta usando alcohol al 75%. Fija el puerto y luego inyecta lentamente 10 mL de solución fisiológica normal con una aguja de 25 g para el cuero cabelludo. Presiona el punto de inyección con gasa aséptica durante 2 minutos para confirmar la hemostasia.
  4. Deja que las ratas SD se recuperen de la anestesia, colócalas sobre una almohadilla caliente durante 20 minutos y luego transfíralas a jaulas individuales.
  5. Inyecta solución fisiológica normal dos veces por semana. Monitorizar complicaciones relacionadas con la expansión durante el seguimiento, incluyendo fugas del expansor, curvatura del tubo de conexión, exposición al expandido, equimosis cutánea, necrosis, infección y deterioro (Figura 2E). Investiga posibles curvas de catéter si se encuentra resistencia durante la inyección de solución salina. Sospecha que hay una fuga del expansor si el globo de expansión se ablanda. Identifica la equimosis localizada como signo de perfusión comprometida, y el oscurecamiento de la piel como necrosis. Se sospecha infección al observar un enrojecimiento localizado marcado, hinchazón y una temperatura local elevada de la piel. Clasifica las heridas que no cicatrizan como descomposición cutánea y examina la posible exposición a los expansores.
    NOTA: Examina la piel expandida antes y después de cada inyección para facilitar la detección temprana de eventos adversos. Terminar inmediatamente el procedimiento de expansión si surgen complicaciones graves, como fugas de expansores, descomposición o necrosis de la piel, y exposición a expansores, para maximizar la recuperación de piel viable.

5. Medición del área de expansión y recolección de piel regenerada

  1. Mide el área de expansión usando un escáner 3D de alta precisión. Al escanear la piel sobre el expansor, se calcula automáticamente el área superficial de la región escaneada (Figura 2B).
    NOTA: Realiza escaneos en ratas SD anestesiadas antes de cada inyección.
  2. Fotografía la piel expandida con una cámara digital; medir y pesar el área delimitada por la caja de línea discontinua y registrar los cambios en la superficie (Figura 2C) y en la masa (Figura 2D).
  3. Eutanasiar ratas SD por exposición a un exceso de dióxido de carbono al final del experimento.
    NOTA: En esta investigación, defina el punto final como un volumen total de inyección de 155 mL para replicar todo el proceso de expansión en la práctica clínica.
  4. En la autopsia, marca las áreas de muestreo tanto en la piel expandida como en la piel normal adyacente. Después de aspirar la mitad del volumen total del expansor, incisa horizontalmente la piel que cubre el puerto de inyección con unas tijeras. Disecciona extensamente el plano entre el expansor y la piel expandida usando pinzas mosquito para permitir la retirada completa e intacta del expansor. Extrae muestras de piel con tijeras y divide el tejido por la mitad. Fíjalas en una solución de paraformaldehído al 4% y proceso para la tinción histológica.
    NOTA: Delimitar las áreas de interés para muestreo antes de la retirada del expansor para evitar errores de identificación debido a la retracción cutánea, asegurando la identificación precisa de las regiones de tratamiento localizadas (Figura 3A).
  5. Coloca los cadáveres recogidos por separado en bolsas amarillas de residuos médicos. Desecha los expansores, jeringuillas y gasas usadas en bolsas amarillas de residuos médicos. Descarta las hojas, agujas y otros objetos punzantes en recipientes designados para ellos.
    NOTA: Toda la disposición de residuos en este estudio cumple con las normativas de gestión del Centro de Animales Experimentales del Hospital Popular Noveno de Shanghái.

6. Tinción histológica de la piel

  1. Incrusta muestras de piel en parafina, córtalas en secciones de 5 μm y colócalas sobre portaobjetos adhesivos.
  2. Utilizar tinción por hematoxilina y eosina (tinción HE) para evaluar el grosor de la piel (Figuras 3B,C), y tinción Masson tricroma para evaluar la deposición de colágeno (Figuras 3D,E). Escanea las secciones usando un escáner de diapositivas completo y análisa con el software ImageJ versión 1.54.
  3. Utiliza tinción por inmunofluorescencia CD31 para evaluar la vascularización. Aplicar anticuerpos primarios e incubar durante la noche a 4 °C, utilizar anticuerpos secundarios conjugados con FITC y luego examinar bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3F,G).
  4. Analizar datos cuantitativos utilizando el software GraphPad Prism versión 10.0 y presentar los resultados como media ± desviación estándar (SD). Realizar comparaciones estadísticas usando el test t de Student, definiendo la significación estadística como *p < 0,05.

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Resultados

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En este estudio, establecimos un protocolo estándar para un modelo de expansión continua de tejido. Tras confirmar la seguridad del expansor (Figura 1A), se implantó quirúrgicamente de forma subcutánea en la región dorsal de ratas SD. Su superficie inflable estaba situada hacia la piel. Para evitar el desplazamiento del expansor, el punto de conexión entre el catéter y el puerto de inyección se aseguró a la fascia muscular (Figura 1B). Tras las inyecciones de so...

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Discusión

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La expansión tisular ha surgido como una técnica ampliamente utilizada para generar piel adicional que se asemeja mucho a la piel sana vecina en cuanto a textura ycolor. Se ha aplicado en diversas condiciones clínicas, incluyendo reparación de cicatrices, reconstrucción mamaria y reconstrucción tras la resección de tumores de la superficiecorporal 20. Sin embargo, la expansión tisular a largo plazo sigue siendo un desafío crítico, principal...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este estudio está patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones nº 82372536, 82572898, 82472543), el Centro de Investigación En Cirugía Plástica de Shanghái del Centro Prioritario de Investigación de Shanghái (2023ZZ02023), el Programa de Desarrollo Juvenil "Estrellas Emergentes de Talentos Médicos" de Shanghái (Programa de Especialistas en Jóvenes Talentos Médicos), y el Programa Especial de Investigación Clínica de la Industria de la Salud de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (Subvención nº 20244Y0031).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo CD31Abcam Shanghai Trading Co., Ltda. 182981Tinción IHC
Instrumento de irradiación por haz de electronesTongwei Xinda Technology (Jiangsu) Co,. LtdAcelerador de electrones de alta energía (10 MeV, 24 kW)Esterilización
Anticuerpo secundario conjugado con FITCProteintech Group, IncSA0003-2Tinción IHC
Graghpad Prism software & nbsp;GraphPad SoftwareVersión 10.0Análisis estadístico
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaBeyotime Biotech IncC0105STinción histológica
Escáner 3D de Alta Precisión3D BRILLANTEEinScan Pro 2X V2Medición de área  
Software Image JInstitutos Nacionales de SaludVersión 1.54Análisis estadístico
Kit de tinción tricroma de MassonBeyotime Biotech IncC0189STinción histológica
Expansores tisularesShanghai Winner Plastic Surgery Products Co., Ltd.N/APersonalización especial

Referencias

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