Artículo de método

Método estandarizado para detectar nanotubos de túnel en células de piel humana para aplicaciones de ingeniería tisular

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DOI:

10.3791/69883

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13 de enero de 2026

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

En este artículo

Resumen

Aquí se muestra un protocolo estandarizado para visualizar nanotubos de túnel entre queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos utilizando marcaje de membrana y F-actina con imagen confocal z-stack, con co-tinción opcional de α-tubulina, que permite la detección reproducible y la caracterización del citoesqueleto para aplicaciones de ingeniería tisular.

Resumen

Los nanotubos tunelados (TNTs) son conductos intercelulares delgados basados en actina que permiten la transferencia a larga distancia de orgánulos y cargas de señalización. Aunque ampliamente reportada en múltiples tipos celulares, su presencia en células de la piel humana no ha sido bien descrita. Este artículo describe un protocolo estandarizado para detectar y caracterizar las TNTs in vitro entre queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos. El método implica preparar un cocultivo de células primarias, fijación suave para preservar TNTs frágiles, marcaje de membranas con aglutinina germinal de trigo, tinción de F-actina con faloidina e imagen sistemática de pila z mediante microscopía confocal invertida para distinguir los TNTs suspendidos sobre el sustrato de los filopodios adherentes. La inmunotinción opcional para α-tubulina permite evaluar la incorporación de microtúbulos. Las TNT se definen por tres características: protuberancias delgadas y rectas que conectan dos o más células, la presencia de F-actina y la continuidad entre pares celulares en secciones ópticas seriales. Los resultados representativos demuestran TNTs que vinculan pares dermo-dérmico, epidérmico-epidérmico y dérmico-epidérmico, con composición citoesquelética variable (F-actina sola o F-actina más α-tubulina). Los pasos críticos incluyen fijación suave, uso de reactivos frescos y adquisición de suficientes planos z para evitar una clasificación errónea, mientras que los artefactos comunes incluyen la rotura del TNT y la tinción incompleta. En conjunto, estos pasos optimizados permiten la detección reproducible de TNT en sistemas celulares de la piel y ofrecen una base metodológica para futuras investigaciones de la comunicación mediada por TNT en biología y regeneración cutánea.

Introducción

Los nanotubos tunelados (TNTs) son canales a nanoescala basados en actina que permiten la transferencia intercelular directa de orgánulos y moléculas de señalización. Normalmente miden entre 6 y 100 μm de longitud y 50-500 nm de diámetro, algunos alcanzan hasta 700 nm degrosor 1. A diferencia de las protuberancias de membrana vacías, los TNT contienen filamentos del citoesqueleto, los más comúnmente F-actina, que proporcionan rigidez estructural y soportan el transporte mitocondrial 2,3,4. En el cultivo bidimensional, los TNT se definen por tres características: protuberancias delgadas (20-700 nm), rectas suspendidas sobre el sustrato que conectan dos o más células; la presencia de filamentos de F-actina; y la capacidad de transferir carga.

Desde su primera identificación en células PC-12 por Rustom et al.5, las TNTs se han estudiado en múltiples sistemas, incluyendo el cardiovascular6, inmune7 yrespiratorio 8, el epitelio corneal9, los tumores10 y el sistemanervioso 11,12. Contribuyen a procesos fisiológicos y patológicos como la señalización inmune, la apoptosis, el transporte de material y laangiogénesis 13,14,15. Los TNTs pueden mediar la transferencia a larga distancia de diversas cargas, incluyendo mitocondrias, retículo endoplasmático, ácidos nucleicos, iones e inclusovirus 5,16,17.

La piel es un órgano estructuralmente complejo, con la epidermis y la dermis que dependen de la comunicación constante para la homeostasis, la cicatrización de heridas y la regeneracióndel apéndice 18,19,20. Aunque se han descrito TNT en muchos tejidos, incluyendo el sistema inmunitario, el sistema neuronal y el epitelio corneal 7,9,12, su presencia en células de la piel humana no ha sido reportada en la literatura publicada. Basándonos en el marco metodológico descrito por Sáenz-de-Santa-María et al.21, presentamos un protocolo estandarizado y optimizado para detectar TNTs entre queratinocitos epidérmicos y fibroblastosdérmicos 22 mediante tinción por inmunofluorescencia combinada con microscopía confocal invertida.

En comparación con otros enfoques de detección de TNT, este protocolo ofrece un equilibrio práctico entre sensibilidad y accesibilidad. La imagen de células vivas puede capturar la dinámica del TNT, pero está limitada por la fototoxicidad y la naturaleza de corta duración de losTNTs 1,23. La microscopía electrónica proporciona detalles ultraestructurales, pero a menudo no logra preservar largos tramos de TNT y no es práctica para el análisis rutinario de células primarias de la piel24,25. Los sistemas de nanotubos basados en reporteros permiten el seguimiento en tiempo real pero requieren manipulación genética, que suele ser ineficiente en queratinocitos primarios yfibroblastos 24,26. En cambio, el protocolo actual utiliza inmunofluorescencia estándar y microscopía confocal, lo que permite la detección reproducible de TNT en cultivos celulares cutáneos preparados de forma independiente, manteniendo la compatibilidad con células primarias frágiles.

Este método es especialmente adecuado para el análisis de muestras fijas, donde la composición citoesquelética y la prevalencia de TNT son de interés. Como los TNT son muy frágiles, los pasos de fijación y manejo siguen siendo limitaciones clave, y el enfoque no puede capturar dinámicas TNT en tiempo real. No obstante, para los laboratorios que trabajan con células primarias de la piel humana, este flujo de trabajo estandarizado proporciona una forma accesible y consistente de visualizar las TNTs y apoya estudios posteriores sobre sus posibles funciones en ingeniería y regeneración de tejidos.

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Protocolo

Todas las células de la piel utilizadas en este estudio eran previamente células primarias congeladas, aisladas de tejidos cutáneos humanos obtenidas como muestras descartadas del prepucio en procedimientos de circuncisión, y fueron completamentedesidentificadas 22. La adquisición de muestras de piel humana se realizó en el Departamento de Urología del Hospital Popular Afiliado a la Universidad de Ningbo, y el protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética institucional (Protocolo nº 2024104; fecha de aprobación: 30 de octubre de 2024).

1. Identificación de TNTs en queratinocitos epidérmicos y fibroblastos dérmicos primarios de la piel humana

  1. Preparación de la solución
    1. Prepara la solución fijadora 1 (200 μL) añadiendo 4% de PFA (100 μL), 2,5% de glutaraldehído (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) y 1x PBS (56 μL). Prepáralos frescos y precalentar a 37 °C antes de usarlo.
    2. Prepara la solución fijadora 2 (200 μL) añadiendo 8% de PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Prepáralos frescos y precalentar a 37 °C antes de usarlo.
    3. Prepara la solución fijadora 3 (200 μL) añadiendo 8% de PFA (100 μL), 2,5% de glutaraldehído (4 μL), 1x PBS (96 μL). Prepáralos frescos y precalentar a 37 °C antes de usarlo.
  2. Cultivo celular
    1. Descongelar y cultivar queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos en recipientes de 60 mm utilizando el medio de cultivo adecuado. Suplementar los cultivos de queratinocitos con Y-27632 a una concentración final de 5 μM durante la reanimación. Mantener los cultivos a 37 °C en una incubadora humidificada hasta que las células alcancen un ~80% de confluencia.
    2. Retira el medio y lava brevemente las células con 1 mL de PBS 1x (que se usa para mantener el pH fisiológico y la osmolaridad durante el lavado). Aspira el PBS.
    3. Añade 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05%, distribuye de forma uniforme e incuba a 37 °C durante 1,5-2,5 minutos.
    4. Resuspende suavemente las células pipeteando. Añade 2 mL de medio de crecimiento, transfiere a un tubo de 15 mL y centrifuga a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el perdigón en 1-2 mL de medio. Cuenta las celdas usando un contador automático.
    6. Siembra 12.000 fibroblastos dérmicos o 20.000 queratinocitos en cada pozo de una lámina de cámara de 8 pozos en un volumen final de 400 μL. Después de la siembra, agita bien la cámara en cruz para distribuir las células de forma uniforme. Incubar durante ~24 horas a 37 °C.
    7. Tras aproximadamente 24 horas de incubación, observa la confluencia celular bajo un microscopio. Si alcanza el ~80%, procede a los siguientes pasos de fijación.
  3. Fijación
    1. Cuando los cultivos alcancen un ~80% de confluencia, añade suavemente varias gotas de Solución Fijadora 1 directamente al pozo de la cámara para prefijar las células. Incuba durante 4 minutos a temperatura ambiente. Asegúrate de que el fijador se distribuya de forma uniforme sin alterar las células.
      PRECAUCIÓN: Maneja con cuidado para evitar la interrupción de los TNT. Como las soluciones fijadoras contienen componentes tóxicos como PFA y glutaraldehído, siempre lleva guantes protectores, ropa protectora y mascarilla, y manejalas en una campana extractora. Asegúrate de lavarte bien las manos después. Recoge por separado los residuos fijadores de PFA y glutaraldehído en recipientes etiquetados para su eliminación de productos químicos peligrosos.
    2. Aspira el prefijador y reemplácialo por 140 μL de Solución Fijadora 1 fresca, asegurando que todo el pozo esté cubierto. Incuba durante 15 minutos a 37 °C.
    3. Retira la Solución Fijadora 1 y añade 140 μL de Solución Fixativa 2. Incuba durante 15 minutos a 37 °C. Asegúrate de que la solución cubra completamente las células para mantener una fijación uniforme.
    4. Retira el fijador y luego añade 140 μL de 100 mM de NH₄Cl para apagar los aldehídos residuales. Incuba durante 10-30 minutos a temperatura ambiente.
    5. Enjuaga las muestras 3 veces con 1 PBS durante 30 segundos cada una a temperatura ambiente, pipeteando suavemente a lo largo de la pared de la cámara para evitar que las células se laven o rompan las TNTs.
  4. Tinción de membrana y citoesqueleto
    1. Incubar células con 140 μL de 1:300 (v/v) de WGA (Aglutinina de Germen de Trigo)-Alexa Fluor, que etiqueta glicoproteínas de membrana plasmática para visualizar TNTs derivadas de membrana, en 1x PBS durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en un entorno oscuro.
    2. Lava 3 veces con 1 PBS (30 s cada uno). Incubar con 140 μL de conjugado de faloidina diluido 1:250 (v/v) en un 1% de BSA durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
    3. Lava 3 veces con 1 PBS (30 s cada uno). Incubar con 140 μL de solución DAPI durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    4. Lava 3 veces con 1× PBS. Añade 2-3 gotas de medio de montaje, incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente y guarda al menos 20 minutos a 4 °C en la oscuridad hasta la imagen.
  5. Imagen
    1. Obtén imágenes usando un microscopio confocal invertido con un objetivo de 40x. Selecciona campos aleatorios y recoge pilas Z (10-20 capas) desde la parte inferior hasta la parte superior de las celdas. Los parámetros específicos del microscopio utilizados para la adquisición de imágenes se enumeran a continuación:
      Microscopio láser confocal de barrido: ZEISS LSM 900
      Líneas láser: Pista 1 (561 nm, 4,0%), Pista 2 (488 nm, 16,0%), Pista 3 (405 nm, 60,0%)
      Ganancia del detector: 525 V
      Tamaño Z-step: 20 secciones ópticas (profundidad total: 5,32 μm)

2. Cocultivo de células epidérmicas y dérmicas

  1. Prepara queratinocitos y fibroblastos como en los pasos 1.2.1-1.2.5.
  2. Siembra 10.000 queratinocitos y 6.000 fibroblastos por pozo de cámara en 400 μL de medio. Después de la siembra, agita bien la cámara en cruz para distribuir las células de forma uniforme. Incubar durante 24 horas a 37 °C.
  3. Tras aproximadamente 24 horas de incubación, observa la confluencia celular bajo un microscopio. Si alcanza el ~80%, procede a los siguientes pasos de fijación.
  4. Fija y teñe las membranas como se describe en los pasos 1.3-1.4.
  5. Permeabiliza las células con 0,1% de Triton X-100, para permitir el acceso de anticuerpos a objetivos intracelulares, durante 3 minutos a temperatura ambiente, luego lava 3 veces con 1x PBS.
    NOTA: El Triton X-100 al 0,1% debe prepararse fresco antes de su uso.
    PRECAUCIÓN: El Triton X-100, perjudicial para la vida acuática, también debe ser eliminado como residuo químico y nunca vertido por el desagüe.
  6. Bloquear con 140 μL de BSA al 2% en PBS para reducir la unión de anticuerpos inespecíficos durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: El 2% de BSA debe prepararse fresco antes de su uso.
  7. Incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpo anticitoqueratina 5 diluido 1:200 (v/v) en 2% de BSA.
  8. Lava 3 veces con 1 PBS y luego incuba con anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 594 durante 1-2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
  9. Lava 3 veces con 1× PBS. Tinte los núcleos con DAPI e imagen como en los pasos 1.4.5-1.5.2.

3. Identificación de componentes del citoesqueleto de los TNTs

  1. Cultivo celular
    1. Cultiva y fija las células como en los pasos 1.2-1.3. Permeabiliza con un 0,1% de Triton X-100 durante 3 minutos a temperatura ambiente, luego lava con 1x PBS.
    2. Bloque con 2% de BSA durante 20 minutos a temperatura ambiente. Incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-α-tubulina.
    3. Lava 3 veces con 1 PBS y incuba con anticuerpo secundario conjugado con flúor Alexa durante 1-2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en un entorno oscuro.
    4. Lava 3 veces con 1 PBS. Etiqueta la F-actina con faloidina e imagen como en los pasos 1.4.3-1.5
  2. Co-cultivo de células
    1. Prepara los cocultivos como en los pasos 2.1-2.2. Soluciona con solución fijadora 3 durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Sustituye por 140 μL de 100 mM NH4Cl y incuba durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. Lava 3 veces con 1 PBS.
    3. Primero, identificar las células epidérmicas realizando permeabilización, bloqueo e inmunotinción CK5 exactamente como se describe en los pasos 2.4-2.8.
    4. A continuación, realiza la inmunotinción α-tubulina siguiendo los pasos 3.1.2-3.1.4.
    5. Finalmente, teñir F-actina con faloidina y proceder con la imagen como se describe en los pasos 1.4.2-1.5.2.

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Resultados

Utilizando este protocolo estandarizado, se identificaron con éxito nanotubos de túnel (TNTs) en células de piel humana tanto en condiciones de cultivo único como de cocultivo. Para validar la especificidad de anticuerpos, se realizaron tinciones de control tanto positivas como negativas para todos los anticuerpos antes de los análisis experimentales, como se muestra en la Figura Suplementaria 1, la Figura Suplementaria 2, la Figura Suplementaria 3 y la Figura Su...

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Discusión

Un paso fundamental en este protocolo es la preservación de las TNT durante la fijación y la tinción, ya que estas estructuras son extremadamente frágiles y fácilmente alterables. Un manejo suave durante la fijación, el momento adecuado y el uso de fijadores frescos son esenciales para mantener la integridad del TNT. El uso de la imagen confocal Z-stack es igualmente importante para distinguir los TNTs suspendidos sobre el sustrato de filópodos u otras protuberancias adherentes, que de o...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia que declarar.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención nº 82273554). Los autores agradecen al Laboratorio de Ingeniería de Biomateriales y Regeneración de Tejidos del Hospital de Estomatología de Ningbo por su apoyo continuo y agradecen tanto a los miembros actuales como anteriores del equipo por sus valiosas conversaciones. Los autores también agradecen al profesor Feng Li del Centro de Investigación y Experimentación del Colegio Médico de Hangzhou por su generosa ayuda y firme apoyo en facilitar el acceso al microscopio confocal.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 15 mLKIRGENKG2611Estéril, RNasa/Dnase y libre de pirogénicos
37 & deg; Incubadora CTermo Científica51032877La incubadora de CO2 de 37 grados proporciona un entorno ideal in vitro.
Rastreador de actina Roja-RodaminaBeyotimeC2207sLa sonda de Rodamina Roja Actin-Tracker es una faloidina marcada con el tinte fluorescente Rodamina, con una longitud de onda máxima de excitación de 540nm y una longitud de onda máxima de emisión de 565nm.
Alexa Conjugado de Fluor de aglutinina germinal de trigo (WGA)Sondas molecularesW11261  Alexa Fluor 488 Conjugado
Anticuerpo anti-alfa tubulinaAbcamab7291Anticuerpo anti-alfa tubulina - Control de carga (ab7291) es un anticuerpo monoclonal de ratón que detecta la alfa tubulina. Adecuado para humanos, ratones, ratas.
Anticuerpo anticitoqueratina 5  Abcamab52635Anticuerpo anticitoqueratina 5 - Marcador del citoesqueleto (ab52635) es un anticuerpo monoclonal de conejo que detecta la citoqueratina 5. Adecuado para humanos, ratones, ratas.
Aqua-Poly/MountPoliciencias18606Medio de montaje soluble en agua, no fluorescente, formulado para montar secciones a partir de soluciones acuosas. Útil para técnicas inmunofluorescentes, ya que mejora y retiene las tinciones fluorescentes.
Contador automático de celdasCountstarIC1000Contador de celdas automatizado para un conteo rápido y preciso de celdas
Centrífuga de mesaBIORIDGETD5Centrífuga de banco para una separación rápida y eficiente de muestras en entornos de laboratorio
Gabinete de seguridad biológicaTermo Científica1379El Gabinete de Seguridad Biológica es un dispositivo de contención estéril que protege a los operadores, muestras y entornos de riesgos biológicos filtrando patógenos en suspensión aérea y evitando la contaminación cruzada durante trabajos microbiológicos.
Albúmina sérica bovina (BSA)YOBIBIOU5010-10gLa BSA es una globulina en suero bovino que contiene 583 residuos de aminoácidos con un peso molecular de 66,430 kDa y un punto isoeléctrico de 4,7
Plato de cultivo celular (60X15 mm)eppendorf30701119Cultivo de tejidos tratados como estéril, libre de pirogenos detectables, RNasa y DNasa, ADN.
Cámara Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NDiseñado para imágenes de alta resolución como la microscopía confocal.
Solución de tinción DAPIBeyotimeC1006-10 mLLa solución de tinción DAPI es adecuada para la tinción nuclear de todas las células y tejidos comunes.
IgG Anti-Ratón de Cabra y H L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660IgG Anti-Ratón de Cabra y H L (Alexa Fluor 405) es un anticuerpo secundario con una longitud de onda máxima de absorción de 401nm y una longitud de onda máxima de emisión de 421nm.
Cabras Anti-Conejo IgG y L conjugada a Alexa Fluor 405Abcamab175652Cabras Anti-Conejo IgG y L (Alexa Fluor 405) es un anticuerpo secundario con una longitud de onda máxima de absorción de 401nm y una longitud de onda máxima de emisión de 421nm.
Cabras Anti-Conejo IgG y L conjugado a Alexa Fluor 594AbcamAB150080Cabras anti-conejo IgG H & L (Alexa Fluor 594) es un anticuerpo secundario con una longitud de onda máxima de absorción de 590 nm y una longitud de onda máxima de emisión de 617 nm.
Microscopio de fluorescencia confocal invertidaLeicaTCS SP8 XEl microscopio confocal de escaneo láser Leica SP8 X ofrece imágenes de alta resolución inigualables con avanzadas capacidades de detección de fluorescencia y análisis de células vivas.
Microscopio de fluorescencia confocal invertidaAndorAC43El Andor BC43 es un microscopio confocal compacto y de alta velocidad que ofrece imágenes 10 veces más rápidas que los sistemas tradicionales con capacidad de imagen 2D/3D de un solo clic
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Cloruro de amonio como compuesto polar para regular el pH.
Conjugados de Faloidíndicas Oregon GreenTM488Tecnologías de la vidaO7466Color: Verde. Rango de longitudes de onda de excitación: 496/520.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Su función es mantener el pH del medio dentro del rango fisiológico y conservar el equilibrio de presión osmótica tanto dentro como fuera de la célula.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlEs un tensioactivo no iónico versátil utilizado para restaurar componentes de membrana bajo condiciones leves de desnaturalización.
Solución de tripsina-EDTAGIBCO25300054Debido a su fuerza digestiva, la tripsina se utiliza ampliamente para la disociación celular, el paso rutinario de cultivos celulares y la disociación primaria de tejidos.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 es un inhibidor activo por la vía oral y competitivo en ATP de ROCK-I y ROCK-II

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