Efectos terapéuticos de los gránulos antiespasmódicos Gualou Guizhi sobre la espasticidad y la panoptosis en un modelo de ratas de lesión medular

Resumen

Este estudio evalúa los efectos de los Gránulos Antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ) sobre la espasticidad inducida por lesión medular (LM) utilizando métodos conductuales, biomecánicos, de imagen e histológicos, y explora los mecanismos relacionados con la PANoptosis.

Resumen

La espasticidad muscular tras una lesión medular (LME) afecta gravemente a la calidad de vida, con tratamientos eficaces limitados. Los Gránulos Antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ), una formulación de medicina tradicional china (MTC) desarrollada por hospitales, pueden aliviar los espasmos. Este estudio tenía como objetivo evaluar la eficacia de GLGZ en la espasticidad inducida por LME y su asociación con la PANoptosis (una novedosa muerte celular programada que implica apoptosis, necroptosis y pirooptosis).

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos de peso entre 180 y 200 g. La lesión medular se indujo mediante el método de caída de peso de Allen. Las ratas modelo exitosas fueron asignadas aleatoriamente a un grupo modelo o a uno de los grupos de dosis GLGZ: alta, media o baja. Las ratas falsas se sometieron a laminectomía sin lesión medular. Las intervenciones duraron 4 semanas. Tras la intervención, se evaluó la función motora de las extremidades utilizando la escala de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). La rigidez del músculo femoral se evaluó mediante elastografía de onda de corte por ultrasonido (SWE), mientras que la integridad de la médula espinal se determinó mediante resonancia magnética (RM). Se realizaron tinciones rápidas de azul por hematoxilina-eosina (HE), Nissl y Luxol para observar alteraciones histopatológicas. Se utilizó tinción por inmunofluorescencia multiplex para marcar la proteína moteante asociada a la apoptosis que contiene una CARD (ASC, verde), Caspasa-8 (naranja) y serina/treonina-proteína quinasa 3 (RIPK3, amarillo) interactuante con receptores para evaluar la PANoptosis.

GLGZ mejoró las puntuaciones BBB dependientes de la dosis: sham (21,00 ± 0,00), modelo (5,8 ± 1,1), dosis altas (10,6 ± 1,3), dosis medias (8,5 ± 1,2), dosis bajas (7,1 ± 1,0). La SWE mostró reducción de rigidez muscular: modelo (6,68 ± 0,74 m/s), dosis alta (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), dosis media (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), dosis baja (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) frente al modelo. En comparación con el grupo modelo (3,65 ± 1,03 mm²), GLGZ redujo de forma dependiente del tamaño de la lesión medular en todos los grupos de dosis (todos P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² en dosis altas, 1,94 ± 0,67 mm² en dosis media, 2,50 ± 0,79 mm² en el grupo de dosis baja. La histología reveló que GLGZ preservaba neuronas y promovía la reparación de mielina. GLGZ redujo la expresión de ASC, Caspasa-8 y RIPK3 de forma dependiente de la dosis.

Introducción

El espasmo muscular es una complicación común de la lesión medular (LME), que afecta gravemente a la calidad de vida de los pacientes. Su proceso patológico incluye lesiones mecánicas iniciales, inflamación secundaria, estrés oxidativo, apoptosis y deterioro de la regeneración nerviosa, entre^{otros 1,2}. Los tratamientos actuales (descompresión quirúrgica, farmacoterapia, rehabilitación) tienen eficacia limitada, con la medicación a largo plazo causando efectos secundarios como resistencia^{a los fármacos 3}. Por lo tanto, explorar mecanismos y tratamientos novedosos es fundamental.

Estudios recientes han identificado la panoptosis, una muerte celular programada que integra apoptosis (dependiente de caspasa), necroptosis (dependiente de RIPK3/MLKL) y pirooptosis (dependiente de caspasa-8/GSDMD)⁴ como un mecanismo patológico clave de lesión secundaria en LME. La activación anormal de (ASC, caspasa-8 y RIPK3) induce pérdida neuronal y formación de cicatrices gliales, agravando la^{espasticidad 5}. Por tanto, la selección de la PANoptosis ha surgido como una estrategia prometedora para interrumpir la cascada de lesiones secundarias^{de la LME 4}.

La medicina tradicional china (MTC) ha ganado atención para las enfermedades neurológicas debido a sus efectos multi-objetivo (por ejemplo, antiinflamatorios, estrés antioxidante⁾⁶. Los Gránulos Antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ) derivan de la Sinopsis de la Cámara Dorada de Zhang Zhongjing y están optimizados como preparación^{hospitalaria 7}. Sus componentes incluyen Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), azufaifa y^{jengibre 8}. Estudios preliminares han demostrado que GLGZ alivia los espasmos tras una lesión del sistema nervioso central al regular neurotransmisores e inhibir la^{inflamación 9}. Sin embargo, sus efectos sobre la espasticidad inducida por LME y su posible asociación con la PANoptosis siguen sin esclarecerse.

A diferencia de los fármacos convencionales de un solo objetivo, la naturaleza multicomponente de GLGZ se alinea con la compleja red patológica de LME, abordando simultáneamente inflamación, pérdida neuronal, daño a la mielina y potencialmente PANoptosis. Este estudio plantea la hipótesis de que el GLGZ mejora la espasticidad muscular en ratas con lesión medular al promover la reparación patológica de la médula espinal (reduciendo la inflamación, preservando neuronas, reparando mielina) e inhibiendo la panoptosis. Al verificar esta hipótesis, pretendemos proporcionar evidencia experimental de que el GLGZ es una terapia prometedora que integra el alivio de los síntomas y la reparación patológica central de la LME.

Protocolo

Modelado animal
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Fujian (Aprobación nº FJPSPH-IAEC2024114) y se llevó a cabo en cumplimiento de las directrices de bienestar animal. Los machos de ratas Sprague-Dawley que pesaban entre 180 y 200 g fueron alojadas en condiciones controladas a 22-26°C y una humedad del 40-70%. La LME se indujo mediante el método Allen de caída de peso¹⁰: anestesia inhalada de isoflurano al 3-4%, incisión en la línea media en T10, exposición de los segmentos T9-T11, laminectomía (duramadre intacta) e impacto (punta de 2 mm, velocidad de 0,5 m/s, profundidad de 1,3 mm, duración de 1 s). Las ratas falsas se sometieron a laminectomía sin impacto. Criterios de inclusión: puntuación BBB < 8 a las 24 horas tras la cirugía; Criterios de exclusión: infección, transección de médula espinal. Cuidados postoperatorios: analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg de s.c., cada 12 horas durante 3 días), expresión de vejiga (cada 6 horas durante 1 semana) y cuidado estéril de la herida. Las ratas modelo exitosas fueron asignadas aleatoriamente a un grupo modelo, y grupos de GLGZ de alta dosis (2,32 g/kg, n = 10), media (1,16 g/kg, n = 10), de dosis baja (0,58 g/kg, n = 10).

Análisis de la función motora
La puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) se realizó a ciegas. Se observó a las ratas en un campo abierto durante 5 minutos, evaluando el movimiento de las articulaciones de las extremidades posteriores, la capacidad de carga, la marcha y la coordinación.

Elastografía por onda cortante para medir la rigidez del recto femoral
Se utilizó un sistema de ultrasonido Doppler con una sonda de matriz lineal (18L6). Las ratas fueron colocadas en reclinancia lateral (músculo relajado). La SWE se realizaba con la sonda posicionada en un ángulo de 90° respecto al músculo, a una profundidad de 1-2 cm. La región de interés (ROI) se estableció en 0,5 × 0,5 cm, y se adquirieron diez fotogramas por medición. El valor final de rigidez representaba la media de tres mediciones válidas. Se registró la velocidad de onda de corte (SWV); El control de calidad verde indicó imágenes^{válidas 11}.

Examen de resonancia magnética
La resonancia magnética se realizó utilizando un escáner de 7,0T con una secuencia de supresión de grasa ponderada T2 y una bobina animalespecífica para animales. Los parámetros de adquisición fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR) 3.800 ms, tiempo de eco (TE) 72 ms, grosor de corte 1 mm, tamaño voxel 0,1 × 0,1 × 1 mm, matriz 256 × 256, campo de visión (FOV) 25,6 × 25,6 mm, cuatro promedios de señal y compuertas respiratorias. El área de la lesión se midió mediante software de procesamiento de imágenes.

Tinción histológica
La tinción con HE se realizó mediante desparafinización secuencial, rehidratación, tinción de hematoxilina durante 5 minutos, enjuague con agua corriente, diferenciación en ácido clorhídrico-etanol al 1% durante 30 segundos, tinción con eosina durante 2 minutos, deshidratación, limpieza y montaje. Como punto de control visual, las secciones teñidas mostraron núcleos azules y citoplasma rojo.

La tinción con Nissl se realizó mediante desparafinización, rehidratación, incubación en azul de toluidina al 0,1% a 50-60 °C durante 30 minutos, seguida de un enjuague con agua destilada, diferenciación de etanol, deshidratación, limpieza y montaje. Como punto de control visual, se observaron claramente cuerpos de Nissl azul oscuro en el grupo simulado.

La tinción de Luxol fast blue-cresyl violeta se realizó mediante deparafinización, rehidratación, incubación en Luxol fast blue a 60 °C durante 2 horas, enjuague con etanol al 95%, diferenciación en carbonato de litio durante 30 s, seguida de diferenciación al 70% de etanol, contratinción con cresyl violeta durante 10 minutos, deshidratación, limpieza y montaje. La concentración de trabajo de violeta cresil fue del 0,1%. Como punto de control visual, se observó mielina azul oscuro en el grupo simulado.

Se realizó tinción por inmunofluorescencia multiplex comenzando con la deparafinización, rehidratación y extracción de antígenos utilizando tampón de citrato (pH 6,0) a 95 °C durante 20 minutos. Las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, seguidas de un bloqueo con BSA al 5% a 37 °C durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Tras lavarse con PBS-T (0,1% Tween-20, 3 x 5 min), se incubaron secciones con anticuerpos secundarios marcados por HRP (1:1000) a 37 °C durante 1 hora. Luego se aplicó marcado con fluorocromo: YTR520 Plus para ASC, TYR570 Plus para Caspase8 y TYR690 Plus para RIPK3 (30 min), seguido de tinción nuclear DAPI durante 5 minutos. Se montaron láminas y se realizaron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con 500 ms de exposición, ganancia 1,0, aumento ×200, con filtros que coincidían con los respectivos fluorocromos.

Para xileno y etanol, todas las operaciones se realizaban en una campana extractora, y durante el uso se usaban guantes y gafas de protección. Para los reactivos de tinción, se evitaba estrictamente el contacto directo con la piel. Todos los reactivos de residuos se eliminaron en contenedores designados para residuos peligrosos. Para los materiales de riesgo biológico se realizó una esterilización exhaustiva por autoclave antes de la disposición final para evitar una posible contaminación biológica.

Análisis estadístico
Se utilizó ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de LSD para comparaciones de grupos. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

Resultados

Marcador BBB
La puntuación BBB del grupo falso fue de 21,00 ± 0,00, significativamente superior a la del modelo (5,8 ± 1,1, P < 0,001). Las puntuaciones de BBB aumentaron dependiente de la dosis de GLGZ: dosis alta (10,6 ± 1,3, P < 0,001), dosis media (8,5 ± 1,2, P = 0,003), dosis baja (7,1 ± 1,0, P = 0,028) frente al modelo (Figura 1).

Análisis de la elastografía de onda cortante de la rigidez del rect...

Discusión

Este estudio evaluó sistemáticamente los efectos mejoradores del GLGZ sobre la espasticidad muscular en ratas con LME y exploró su relación con la neuroprotección y la PANoptosis. Los resultados indicaron que el GLGZ podría mejorar las puntuaciones de BBB y reducir la rigidez muscular en ratas con lesión medular de forma dependiente de la dosis. El estudio también encontró que el mecanismo de acción de GLGZ podría estar relacionado con la neuroprotección, la reparación de mielina y la in...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol anhidro	240403A1		Deshidratación
Etanol anhidro	241101A1		Tinción
agente de recubrimiento atenuado por antifluorescencia (que contiene DAPI) y nbsp;	MA0221		Tinción por inmunofluorescencia
Anticuerpo ASC	Bs-6741R		Análisis de PANoptosis (1:300)
Anticuerpo de caspasa-8	13423-1-AP		Análisis de PANoptosis (1:400)
Microscopio de fluorescencia	NIKON		ECLIPSECi-L
Escáner digital de diapositivas de vidrio totalmente automático	GCell-60		Escáner de diapositivas
kit de hematoxilina-eosina	R23718		Tinción por hematoxilina-eosina (HE)
Software de análisis de imágenes	NIH		ImageJ 1.53k
Luxol Fast Blue	R23193		Tinción Luxel Fast Blue-Cresyl Violet
Escáner de resonancia magnética	Bruker		7.0T
Kit de tinción por fluorescencia múltiple	240522		Tinción por inmunofluorescencia
Kit de tinción mieloide	G3245		Tinción mieloide
Neutral  bálsam	MB9899		Montaje tras el tinte
Kit de tinte Nissl	R23093		Tinción Nissl
Anticuerpo RIPK3	Bs-3551R		Análisis de PANoptosis (1:400)
SPSS 22.0			software de análisis estadístico
Ratas Sprague-Dawley...	Empresa biotecnológica Hangyi en Fuzhou
Ácido tartárico, tripolifosfato sódico	10019418		Tinción
Sistema de ultrasonido	SIEMENS Acuson		Sonda de matriz lineal (18L6)
xileno	240904A2		Tinción