Evaluación del efecto de la electroacupuntura en el flujo sanguíneo cerebral en ratones APP/PS1 mediante la técnica de speckle láser

Resumen

Aquí presentamos un protocolo centrado en la imagen con contraste láser de motas para cuantificar el flujo sanguíneo cerebral, combinado con el Laberinto de Agua Morris, para evaluar los efectos de la electroacupuntura en ratones APP/PS1 (modelo de EA), valiosos para la investigación cerebrovascular de la EA.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por un deterioro cognitivo progresivo y disfunción cerebrovascular, incluyendo reducción del flujo sanguíneo cerebral (CBF) y deterioro de las unidades neurovasculares. La electroacupuntura (EA) ha demostrado potencial para mejorar las funciones neurológicas, aunque su mecanismo puede estar relacionado con la regulación de la CBF. La imagen láser de speckles es un método de campo amplio para la evaluación en tiempo real de la CFB y puede evaluar con precisión los cambios en la perfusión sanguínea cerebral. En este experimento, observamos los efectos de la electroacupuntura sobre la CBF y la capacidad cognitiva en ratones modelo de EA (ratones transgénicos APP/PS1). La perfusión sanguínea de la arteria cerebral media y sus vasos ramales en ratones fue observada mediante imagen láser de manchas. La función cognitiva espacial de los ratones fue evaluada utilizando el laberinto acuático Morris. Los resultados mostraron que la EA podía mejorar la función cognitiva de los ratones APP/PS1, y la latencia de escape se redujo significativamente en la prueba del laberinto de agua Morris (P<0,05). Además, la imagen láser con contraste moteado (LSCI) confirmó una hipoperfusión cerebral significativa en ratones modelo de EA en comparación con controles salvajes (P < 0,05), y, de forma importante, el tratamiento con EA indujo un aumento estadísticamente significativo en la CBF (P < 0,05), invirtiendo la hipoperfusión cerebral en ratones con EA. La imagen láser de moteados es una técnica de visualización para evaluar mejoras cerebrovasculares inducidas por EA. Estos hallazgos apoyan la EA como una posible terapia complementaria para la EA al dirigirse a la disfunción cerebrovascular.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo y un deterioro de la memoria. Procesa las características patológicas de la deposición de placas extracelulares de beta-amiloide (Aβ), el enredo neurofibrilario intracelular (NFTs) y la pérdida^{neuronal 1}. Aunque estas características clásicas han sido el foco principal de la investigación terapéutica, la creciente evidencia subraya el papel crítico de la disminución del flujo sanguíneo cerebral (CBF) en la patogénesis y progresión de la^{EA 2}. La reducción del CBF ocurre en la etapa temprana del inicio del EA y se asocia con la gravedad de la disfunción^{cognitiva 3}. Por lo tanto, la estrategia de tratamiento para mejorar el daño cerebrovascular es una forma eficaz de aliviar los síntomas de la EA y mejorar el curso de la enfermedad.

La electroacupuntura (EA), una técnica moderna que integra la acupuntura tradicional con la estimulación eléctrica, ha demostrado potencial para mejorar la función cognitiva en la EA. Los estudios sugieren que la EA puede ejercer sus efectos beneficiosos a través de múltiples mecanismos, como reducir la deposición de Aβ, atenuar la neuroinflamación y promover la plasticidad^{sináptica 4}. Cabe destacar que cada vez se especula más que los efectos neuroprotectores de la EA podrían estar estrechamente relacionados con su capacidad para modular la^{CBF 5}. Sin embargo, la evidencia directa y en tiempo real que demuestra el impacto de la EA en la hemodinámica cerebral en modelos de EA sigue siendo limitada. La falta de tales pruebas dificulta una comprensión integral de cómo la EA mejora la función cerebral.

Los avances tecnológicos en imagen óptica han proporcionado herramientas poderosas para investigar la hemodinámica cerebral. Como técnica óptica rápida y de campo amplio, la LSCI ofrece una alta resolución espaciotemporal para visualizar mapas de flujo sanguíneo integrado en volumen⁶, permitiendo el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la perfusión inducida por electroacupuntura. Aunque la exposición del cráneo es necesaria para un acceso óptico óptimo, la LSCI evita la penetración invasiva del tejido. La LSCI se introdujo en los años 90 y se ha aplicado ampliamente en neurociencia en las últimas^{décadas 7}. Como todas las técnicas de imagen, el LSCI tiene limitaciones inherentes: su profundidad de penetración óptica es limitada, favoreciendo la vasculatura cortical superficial y limitando el acceso a regiones cerebrales profundas (por ejemplo, hipocampo, ganglios basales), y cuantifica el flujo sanguíneo relativo (unidades de perfusión) en lugar de los valores absolutos de CBF, con una precisión sutilmente influenciada por la morfología vascular y la dispersión óptica^{tisular 8,9}. Sin embargo, estas limitaciones no debilitan la utilidad de la LSCI, sino que definen su aplicación especializada en la evaluación en tiempo real del flujo sanguíneo cortical superficial. Para nuestro estudio centrado en los cambios de perfusión cortical inducidos por EA, LSCI proporciona datos fiables y accionables. Concretamente, establecimos un protocolo LSCI estandarizado con delimitación específica del ROI y parámetros optimizados para cuantificar el CBF en ratones APP/PS1, complementado por pruebas Morris Water Maze para vincular mejoras cerebrovasculares con resultados cognitivos.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín (BUCM20250708-005), y estaba en conformidad con todas las directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio en China.

1. Preparación

1. En este experimento se utilizaron doce ratones machos APP/PS1 de 6 meses y seis ratones machos C57bl/6 de 6 meses.
2. Todos los ratones estaban alojados en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín, con tres ratones por jaula. Tenían acceso libre a agua potable estéril y a una dieta estándar de pellets.
3. El entorno de vivienda se mantenía en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad, con la temperatura ambiente controlada a 23 ± 2 °C.

2. Agrupación e intervenciones de animales

1. Asignar aleatoriamente doce ratones machos APP/PS1 de 6 meses (peso 27,88 g ± 0,48 g) a dos grupos experimentales (grupo n = 6/): el grupo modelo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y el grupo de tratamiento por electroacupuntura (EA).
2. Utiliza seis ratones machos C57BL/6 de 6 meses (peso 29,90 g ± 0,81 g) como grupo de tipo salvaje (WT).
3. Para los grupos de control WT y modelos de AD, sujetar suavemente a los ratones en los restrictores bien ventilados y no administrar intervenciones experimentales.
4. Para el grupo de tratamiento EA, sujeta suavemente a los ratones con el mismo restricción de ratones que se usa en los grupos de control WT y modelo AD, lo que limita el movimiento excesivo y garantiza una respiración sin obstrucciones. Bajo esta condición de sujeción estandarizada, inserta las agujas estériles de acupuntura desechables (0,25 mm × 13 mm) en los puntos de acupuntura Baihui (GV20) y Yintang (GV29) (Figura 1A) en la cabeza, dirigidos hacia la región nasal, con una profundidad constante de 2-3 mm. Conecta los terminales positivo y negativo del dispositivo EA a estos dos puntos de acupuntura, respectivamente, y proporciona estimulación durante 15 minutos (Figura 1B). Configura los parámetros de estimulación como un patrón de ondas densas en dispersión, con una intensidad de 0,1 mA y una frecuencia de 2 Hz.
5. Administrar las intervenciones a cada grupo cada 48 horas, con una duración de 15 minutos por sesión, para un total de 30 días.
   NOTA: Realizar procedimientos de selección de puntos de acupuntura, localización y punción conforme a T/CAAM 0002-2020: Nombres y ubicaciones de puntos de acupuntura comúnmente usados para animales de laboratorio Parte 3:^{Ratones 10}, una norma emitida por la Asociación China de Acupuntura y Moxibustión el 15 de mayo de 2020.

3. Prueba MWM

NOTA: 24 horas después del periodo de intervención de 30 días, todos los ratones de los tres grupos experimentales se sometieron a la prueba del Laberinto de Agua Morris (MWM), que incluyó tanto el ensayo de plataforma oculta (navegación de lugar) como el ensayo de^{sonda 11,12}. Implementar un periodo de aclimatación de 1 día antes de las pruebas formales para minimizar el estrés, permitiendo que los ratones se adapten a la sala experimental, al aparato MWM y a los procedimientos de manipulación.

1. Procedimientos preparatorios
   1. Colocar el aparato MWM y su sistema asociado de adquisición/procesamiento de señales en una sala experimental con sonido atenuado. Mantener la temperatura ambiente del entorno de prueba en aproximadamente 25 °C y estandarizar las condiciones de iluminación de la siguiente manera: montar cuatro tubos LED de 60 W sobre los cuatro cuadrantes del laberinto a una altura suficiente para evitar ser capturados por la cámara del techo. Cortinas opacas rodeaban toda la zona de pruebas para bloquear interferencias ambientales externas y evitar que señales espaciales no intencionadas afectaran a la navegación de los ratones.
   2. Coloque un tanque blanco circular (90 cm de diámetro × 50 cm de altura) en el centro del montaje MWM. Conecta una cámara de vídeo montada en el techo a un sistema de seguimiento automatizado y a un grabador para una captura continua de datos durante las pruebas.
   3. Dividir el tanque en cuatro regiones iguales, marcadas como norte (N), sur (S), este (E) y oeste (W), y segmentar el tanque en cuatro cuadrantes congruentes, incluyendo noreste (NE), noroeste (NO), suroeste (SW) y sureste (SE).
   4. Fijar formas visuales de formas distintivas (cuadrado, triángulo y círculo) a la pared exterior de cada cuadrante, situadas dentro de la línea de visión del ratón para servir como puntos de referencia espaciales.
   5. Llenar el depósito con 30 cm de agua mantenida a 24 ± 1 °C con un calentador eléctrico; Añade pigmento blanco comestible para que el agua quede opaca.
2. Prueba de plataforma oculta
   1. Fijar una plataforma sumergida en el cuadrante sureste durante la duración de esta prueba.
   2. Libera aleatoriamente cada ratón en la piscina desde tres cuadrantes alternativos (NE, NW, SO), con la orientación inicial hacia la pared del tanque para mayor consistencia.
   3. Permite que cada ratón tenga un máximo de 60 s para localizar la plataforma oculta de forma independiente.
   4. Registrar la latencia de escape (el tiempo desde el lanzamiento hasta el ascenso de la plataforma) para cada ensayo para evaluar el aprendizaje espacial.
      NOTA: Cada ratón completó tres pruebas al día durante cinco días consecutivos. Si un ratón no encontraba la plataforma en un plazo de 60 s, se le guiaba suavemente hasta ella y se le permitía permanecer allí durante 10 s para reforzar la memoria espacial antes de concluir la prueba.
3. Juicio de la sonda
   1. Quita la plataforma.
   2. Libera cada ratón una vez que se coloque en la piscina frente a la pared del tanque y permite 60 segundos de natación sin restricciones.
   3. Registrar medidas clave de resultado: velocidad media de nado y número de cruces sobre la antigua ubicación del andén.
4. Cuidados post-prueba
   1. Después de cada sesión de Domingo de Noche, seca bien los ratones con toallas suaves y caliéntalos suavemente con un calentador eléctrico para evitar la hipotermia.

4. Imagen con contraste de motas láser

1. Selecciona aleatoriamente tres ratones de cada grupo y monitoriza su CBF en tiempo real y en campo completo usando el sistema LSCI.
2. Preparación animal: Realizar todas las operaciones animales bajo anestesia. Anestesiar ratones con inyección de tribromoetanol al 1,25% (0,02 mL/g) intraperitonealmente para asegurar una respiración espontánea continua y colocarlos sobre una placa de operación horizontal. Coloca ratones anestesiados en una almohadilla térmica controlada termostáticamente mantenida a 37 °C para estabilizar la temperatura corporal central. Afeitar el cuero cabelludo y diseccionar cuidadosamente los músculos o meninges subyacentes para exponer el cráneo; Mantener la superficie craneal expuesta húmeda con un 0,9% de solución fisiológica estéril durante todo el procedimiento para evitar la desecación.
3. Configuración de imagen: Colocar la cabeza de escaneo del sistema perpendicular a la ventana craneal expuesta a una distancia fija de 20 cm. Habilitar las funciones de autoenfoque y autoganancia para optimizar la claridad y contraste de la imagen, manteniendo automáticamente los valores de ganancia dentro de un rango de 140-160 en todos los experimentos. Configura parámetros de imagen estandarizados adicionales de la siguiente manera: tiempo de exposición = 20 ms, constante de tiempo = 1,0 s, modo de funcionamiento = temporal, filtro = 250 fotogramas, intervalo de muestreo = 5000 ms y resolución de imagen = 1032 × 772.
4. Adquisición de datos: Adquirir imágenes de speckle continuas a una frecuencia de muestreo de 25 Hz y sincronizar la recogida con los parámetros temporales y de filtro preconfigurados.
5. Análisis de ROI: Utiliza el software de análisis para definir regiones de interés (ROI) sobre la corteza prefrontal, dirigiéndose específicamente a los territorios de las arterias cerebrales anteriores y medias dentro de esta área cortical. Delimitar los ROI sobre estas regiones vasculares y extraer valores medios de flujo (expresados en unidades de perfusión) de cada ROI para una comparación estadística posterior.

5. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando SPSS 27.0.
2. Se analizaron las diferencias de grupo en la plataforma oculta, los resultados de los ensayos de sonda y el CBF utilizando la prueba t del Estudiante. Defina la significación estadística como P < 0,05 y fije alta significación estadística en P < 0,01.

Resultados

Efectos de la EA en el aprendizaje espacial y la memoria en ratones modelo de EA

Los resultados de la prueba del laberinto acuático de Morris se muestran en la Figura 2. La Figura 2A muestra la latencia de escape durante la prueba de la plataforma oculta durante cinco días. La latencia de escape del grupo AD mostró una tendencia fluctuante, mientras que los grupos WT y EA disminuyeron...

Discusión

El presente estudio demuestra que la intervención a largo plazo de EA en los puntos de acupuntura Baihui (GV20) y Yintang (GV29) mejora significativamente los déficits de aprendizaje espacial en ratones transgénicos APP/PS1, como se refleja en la latencia de escape reducida en la prueba de plataforma oculta Morris Water Maze. Este hallazgo es coherente con informes previos de que la EA mejora la función cognitiva en varios modelos de EA mediante mecanismos como la reducción de la deposic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de acupuntura	(Beijing Zhongyan Taihe Medicine Company, Ltd., China	0,25 mm y tiempos; 13 mm	Aguja de acupuntura
Sistema de imagen por contraste de moteado láser	Gene& Soy científico. Ltd.	MoorFLPI-2
Restricción de ratones	Centro de Equipos de Laboratorio Hengtai	HT-A2
Tribromoetanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd. & nbsp;	M2910	Anestesia