Hidrogeles de poliacrilamida ZrOH para muestreo espacialmente resuelto de carboxilatos exsudados de raíces que crecen en el suelo

Summary

En este protocolo, detallamos el uso de hidrogeles de hidróxido de circonio de poliacrilamida (hidrogeles ZrOH) como un método no destructivo e in situ para muestrear carboxilatos exudados de raíces de raíces intactas en el suelo en diferentes etapas de desarrollo del cultivo. También describe el mapeo localizado y cuantificación posteriores de estos carboxilatos mediante Cromatografía Iónica-Espectrometría de Masas (IC-MS).

Abstract

El muestreo y la cuantificación fiable de exudados radiculares de raíces vegetales no perturbadas en el suelo siguen siendo un reto. Desarrollamos además un método no destructivo para el muestreo, mapeo 2D y cuantificación de siete carboxilatos (acónito, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato, succinato) exudados de raíces cultivadas en rizobox. El método descrito aquí emplea hidrogeles de hidróxido de circonio de poliacrilamida (hidrogeles ZrOH) que absorben todos los carboxilatos probados y pueden eluirse con una eficiencia que va del 95,3% ± 3,12% al 111% ± 1,99%. Los hidrogeles ZrOH tienen una alta capacidad de unión para carboxilatos, hasta 1,82 μmol ^cm-2, dependiendo del pH de la solución y las especies de carboxilatos, una concentración superior a la habitualmente disponible en la rizosfera. Además, los carboxilatos unidos a los hidrogeles ZrOH permanecen estables y pueden almacenarse durante varias semanas a 4 °C antes del análisis. Para la aplicación, las plantas se cultivan en rizocajas llenas de suelo que permiten un fácil acceso con mínima alteración del sistema radicular. Para muestrear carboxilatos liberados por raíces, se aplican cuidadosamente hidrogeles ZrOH en la región de interés durante 24 horas. Tras recuperar los hidrogeles ZrOH, se cortan para fines de mapeo y las piezas de gel se eluen para un análisis carboxilato posterior (por ejemplo, mediante Cromatografía Iónica-Espectrometría de Masas). Nuestros hallazgos indican que los hidrogeles ZrOH son eficaces para capturar y determinar concentraciones de carboxilados en la rizosfera. La novedad de este método radica en su capacidad para muestrear exudados radiculares de raíces vegetales intactas cultivadas en suelo, así como en la posibilidad de muestreo con resolución temporal, en comparación con los métodos tradicionales (enfoque híbrido suelo-hidropónico) que suelen ser destructivos y permiten muestreo único. Lo más importante es que permite la generación de imágenes 2D cuantitativas, de alta resolución y escala milimétrica, facilitando la visualización de la exudación carboxilada a lo largo del eje radicular y su distribución espacial dentro de la rizosfera. Además, este método facilita el muestreo de exudados radiculares en diversas etapas de crecimiento durante el ciclo de crecimiento.

Introduction

Las raíces de las plantas exudan diversos compuestos hacia la rizosfera, moldeando sus propiedades físicas, químicas y^biológicas. Cuando las plantas se exponen a condiciones de estrés abiótico y biótico, se desencadena especialmente la exudación de las raíces. De hecho, los exudados radiculares pueden influir en la disponibilidad y movilización de nutrientes y metales, las comunidades y actividad microbianas, la estabilidad de los agregados del suelo y las defensas de las plantas frente a patógenos directa o^{indirectamente 1,2,3}. Entre los exudados radiculares más importantes se encuentran los carboxilatos debido a su papel en la solubilización de nutrientes (incluyendo fósforo (P), hierro (Fe), cobre (Cu) y zinc (Zn)), tolerancia a metales pesados y mejora de microorganismos beneficiosos en la^rizosfera 2,3,4,5.

Cabe destacar que los carboxilatos exudados incluyen citrato, lactato, oxalato, malato, succinato y^{fumarato 6,7,8}. Por ejemplo, el citrato desempeña un papel vital en la adquisición de P al movilizar el P unido a Fe o a los óxidos de aluminio (Al) (hidr)^{óxidos 7,9}. Sin embargo, muestrear y cuantificar con precisión los exudados radiculares de plantas cultivadas en el suelo sigue siendo un desafío experimental, principalmente debido a la dificultad para acceder físicamente a sistemas radiculares no alterados en el suelo y para obtener muestras de exudado^{radicular 10,11}. Además, los compuestos exudados sufren rápidamente una degradación microbiana (en minutos a horas)¹² y se adsorben fuertemente a las superficies minerales del^suelo. Otro desafío en los estudios de exudación radicular es el seguimiento de la exudación a lo largo del tiempo, ya que la mayoría de los métodos de recogida perturban las raíces o requieren la tala de plantas cultivadas en tierra, dificultando evaluar la misma raíz de nuevo ^1,11. Por lo tanto, el muestreo, cuantificación y monitoreo precisos de los exudados radiculares requieren una técnica que capture la variación espacial y facilite el muestreo repetido durante el crecimiento de^{la planta 11}.

En el estudio actual, presentamos un método no destructivo e in situ desarrollado inicialmente para citrato por Tiziani et ^al.12, que ahora ha sido refinado y aplicado para muestreo, localización espacial precisa y cuantificación de seis carboxilatos adicionales (acónito, fumarato, lactato, malato, oxalato y succinato) exudados de raíces vegetales intactas cultivadas en suelo en rizoboxes. El método utiliza hidrogeles de poliacrilamida basados en hidróxido de circonio (hidrogeles ZrOH) para muestrear exudados^{radiculares 13}. Los hidrogeles ZrOH presentan una fuerte capacidad de unión para aniones (incluidos carboxilatos) que pueden eluir^fácilmente 12,13,14. Los hidrogeles ZrOH (1) permiten muestrear carboxilatos radiculares de raíces vegetales cultivadas en tierra simplemente colocando el hidrogel sobre el sistema radicular con mínima perturbación, (2) ofrecen una protección eficaz de los carboxilatos unidos contra mineralización microbiana durante al menos 6 semanas, (3) la distribución espacial de carboxilatos en la rizosfera se preserva al unirse al gel, y (4) permiten un mapeo 2D a escala mm de carboxilatos¹².

Los métodos existentes para muestrear exudados radiculares se clasifican en técnicas basadas en suelo de plantas cultivadas en tierra (es decir, lavado de raíces o híbrido tierra-hidropónico, dispositivos colectores de exudatos tierra-raíz (SOIL-REC), microventosas, papel de filtro/láminas de agar, trampas de exudación y la técnica de prueba RHIZO) o métodos hidropónicos de muestreo de exudados. El lavado de raíces o el enfoque híbrido suelo-hidropónico implica la retirada cuidadosa de toda la planta del suelo, el lavado del sistema radicular y luego sumergirlo en la solución de muestreo para recoger exudados^{de raíz 15}. Es el método más utilizado para muestrear exudados de plantas cultivadas en tierra debido a su simplicidad. Sin embargo, extraer las raíces del suelo conlleva el riesgo de perder pelos radiculares y raíces más finas. Además, se requiere una limpieza exhaustiva de las raíces, lo que puede dañar las raíces, comprometer la calidad y cantidad de los exudados radiculares e impedir muestreos con resolución temporal ^8,11. El método SOIL-REC consiste en cultivar plantas en un sistema de rizocajas especialmente diseñadas, con raíces creciendo entre dos mallas porosas de nailon (≤ 30 μm) y recoger exudados radiculares utilizando una herramienta de recogida de exudatos^{radiculares 16,17}. Este enfoque preserva el sistema radicular, minimiza la contaminación del suelo y permite la recogida repetida de exudados radiculares. Sin embargo, tiene una configuración complicada (con pocos réplicados solo), una mayor dilución de exudados de volúmenes mayores usados para muestreo y aún requiere optimización, ya que su replicabilidad es un reto y existen enormes variaciones entre^{réplicas 8}.

La aplicación de pequeños fragmentos de resinas, láminas de gel de agar o papel de filtro capaces de equilibrarse con la solución circundante o adsorbir exudados en los segmentos de raíz de interés de raíces intactas y accesibles en tierra (es decir, usando rizocajas o ventanas de raíces)^18,19. Este método permite muestreo con resolución temporal y medición parcial de la composición localizada de exudados, aunque con baja resolución espacial. Por otro lado, es susceptible a artefactos derivados de mineralización microbiana y difícil de manejar. De manera similar, las trampas de exudados se utilizan para muestrear exudados de raíces de segmentos individuales, donde una sola raíz queda atrapada en cámaras laterales horizontales, con anillos sellados de metacrilado que contienen la solución de muestreo, que están posicionados^{localmente 8}. El método es aplicable tanto a raíces hidropónicas como cultivadas en suelo y permite muestreo^{localizado 12}. Sin embargo, se recogen bajos volúmenes, el muestreo con resolución temporal es casi imposible y aislar raíces individuales es susceptible a estrés mecánico, que podría afectar el metabolismo y la exudación^{radicular 8}. Se utilizan microventosas para recoger soluciones de suelo en la rizosfera, permitiendo muestreo in situ de raíces cultivadas en^{tierra 20}. Sin embargo, se recogen pequeños volúmenes, el muestreo es parcialmente resolto en el tiempo y los exudados son propensos a la adsorción y degradación^{microbiana 16}. La técnica de prueba RHIZOtest consiste en cultivar raíces hidroponicamente en pequeños cilindros con el fondo cubierto por una malla de nylon de 30 μm y luego transferirlas a un disco de suelo, permitiendo el intercambio de solutos entre la raíz y el^{suelo 8,21,22}. Los exudados se recogen sumergiendo la alfombra radicular en una solución de muestreo. Este método mantiene el contacto con raíces y suelo, pero emplea condiciones de crecimiento artificiales. Está limitado a experimentos a corto plazo y carece de muestreo con resolución temporal. Entre estos métodos, solo se pueden emplear resinas, láminas de gel de agar, papel de filtro, trampas de exudación y microventosas para determinar patrones de exudación espacial.

Los métodos de muestreo hidropónico de exudatos abarcan técnicas hidroponías y semi-hidroponías. La hidroponía es un método frecuentemente utilizado y sencillo para recoger exudados radiculares, en el que las plantas se cultivan en una solución nutritiva, que luego se sustituye por una solución de muestreo (H₂O, CaSO₄,_{CaCl 2}, micropur) para obtener muestras de exudado^15,23. El método es sencillo y impone un esfuerzo mecánico mínimo sobre las raíces. Es altamente reproducible y estéril si es necesario, lo que aumenta la calidad de los exudados radiculares y permite un muestreo con resolución temporal ^5,16. No obstante, es un sistema altamente artificial que puede alterar la fisiología vegetal, la morfología (por ejemplo, el desarrollo del vello radicular) y los procesos de exudación^{radicular 6,15}. En semihidroponía, las plantas se cultivan sobre perlas de vidrio, arena o vermiculita con una solución nutritiva de percolación continua, y los exudados se recogen en la solución^{de percolación 8,18}. Este enfoque es ligeramente menos artificial en comparación con la hidroponía y permite muestreo con resolución temporal. Sin embargo, el sistema está casi completamente saturado de agua y, por tanto, requiere plantas tolerantes a condiciones parcialmente anaeróbicas.

En comparación con otros enfoques, el método de hidrogel ZrOH ofrece varias ventajas. Los hidrogeles ZrOH permiten muestrear exudados radiculares en cultivo de suelo (cerca de condiciones naturales) con mínima alteración del sistema radicular, muestreo resuelto en el tiempo durante el ciclo de vida de la planta y es posible la recogida de exudados radiculares durante más de 24 horas debido a la disminución de la degradación microbiana y la alta capacidad de unión^{carboxilada 12}. Además, no se requiere ningún biocida (por ejemplo, micropur,_{NaN 3}) para muestrear o preservar los hidrogeles, que pueden afectar al instrumento analítico a largo plazo e interfieren con el análisis químico. Esto se debe a que los carboxilatos están químicamente unidos al hidrogel ZrOH. Además, las muestras pueden almacenarse durante varias semanas o meses antes del análisis, por lo que muchas pueden recogerse de un solo montaje experimental¹², lo que puede atribuirse a las propiedades antimicrobianas del Zr en el hidrogel^24,25. Además, los hidrogeles ZrOH permiten el mapeo a resolución milimétrica 2D de compuestos exudados y otros aniones en la rizosfera, con la posibilidad de muestrear todo el sistema^radicular 12,14,26. Los hidrogeles ZrOH ocupan menos espacio de almacenamiento en la nevera (4 °C) en comparación con los grandes volúmenes requeridos por los métodos clásicos, que normalmente se almacenan en el congelador (-20 °C). La principal limitación es acostumbrarse a producir hidrogeles ZrOH de alta calidad con burbujas mínimas o nulas de aire, así como el hecho de que los rizoboxes siguen siendo sistemas artificiales de cultivo. Otra limitación es que el método solo se ha desarrollado para siete carboxilatos (aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, succinato y oxalato⁾¹², sulfonamidas (sulfadiazina, sulfametazina, sulfacloropiriazina y clindamicina⁾²⁷ y aniones inorgánicos (sulfuros y oxianiones de P, V-vanadio, As-arsénico, Se-selenio, Mo-molibdeno, Sb-antimonio^)14,26,28,29. El hidrogel ZrOH también se ha utilizado en combinación con reactivo de partículas en suspensión – ácido iminodiaacético para muestreo in situ y mapeo de cationes (Al, Fe, Ca-calcio, Mg-magnesio, Mn-manganeso, Ni-Níquel y Zn-Zinc) en la^rizosfera 28,29,30.

Aquí ofrecemos un método basado en hidrogel ZrOH para permitir muestreo in situ y resuelto en tiempo y espacio de carboxilatos de sistemas radiculares cultivados en suelo. Ofrecemos una descripción detallada de cómo realizar un experimento con rizobox, incluyendo muestreo y mapeo 2D de exudados radiculares utilizando la técnica de hidrogel ZrOH. Incluye la preparación de hidrogel, el llenado del rizobox, el cultivo de plantas, la aplicación, recuperación y corte de hidrogel, la elución de carboxilados desde el hidrogel y su análisis, y es seguido por la generación de imágenes 2D. Además, proporciona notas sobre pasos críticos, como el análisis de carboxilatos mediante cromatografía iónica-espectrometría de masas (IC-MS).

Protocol

1. Preparación de hidrogel ZrOH

NOTA: Se requiere un ambiente y materiales limpios para la preparación del gel y evitar contaminaciones. Solo se utiliza agua de grado I de laboratorio (≤18 MΩ·cm) al preparar las soluciones, enjuague con gel e hidratación para garantizar la calidad. Asegúrate de que los contenedores de residuos tóxicos (líquidos y sólidos) ya estén colocados en la campana extractora antes de comenzar la preparación con hidrogel. Precalienta el horno a unos 42─45 °C durante 1 hora antes de comenzar a preparar los geles. Los detalles sobre los materiales y productos químicos se encuentran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del ensamblaje de vidrio
   1. Prepara un baño ácido de HNO₃ al 10% (p/v) añadiendo 153,8 mL de 65% de HNO₃ a 846,2 mL de agua de laboratorio grado I en una campana extractora.
   2. Remojas las placas de vidrio (6,1 x 17 cm), las pinzas, los separadores en forma de U de teflón (0,25 mm o 0,4 mm) y los clips de plástico en el baño de ácido durante al menos 4 horas.
   3. Retira las placas de cristal, pinzas, clips de plástico y separadores de teflón del baño de ácido y luego lávalos al menos tres veces con agua de laboratorio de grado I. Después déjalos secar bien al aire en un banco laminar o limpio.
      NOTA: Las placas de vidrio deben prepararse el mismo día que la preparación del gel y evitar secarlas con papel para minimizar la contaminación.
   4. Coloca el separador en forma de "U" sobre la placa de vidrio seco, añade la segunda y fíjalos juntos con pinzas. Desplace las placas de vidrio aproximadamente ~1 mm para facilitar el pipeteado (véase la Figura 1A).
   5. Coloca el conjunto de placas de vidrio sobre un papel de plástico limpio bajo la capa de película antes de fundir la solución de gel.
2. Preparación en gel de^{poliacrilamida 31}
   1. Solución en gel: Prepara una solución de gel de 100 mL mezclando 15 mL de gel de reticulador de Gradientes Difusivos en Películas Finas (DGT) con 47,5 mL de agua de laboratorio grado I en un frasco de plástico limpio, y luego añade 37,5 mL de solución de acrilamida (40%). Remueve la mezcla cuidadosamente al añadir cada solución. La solución en gel puede almacenarse en un frigorífico (4 °C) durante al menos tres meses.
      NOTA: Asegúrese de pipetear/pesar las cantidades correctas de cada solución y utilice solo solución de acrilamida sin bisacrilamida, ya que esto produce geles blandos cuando se coloca en un tampón de ácido 2-(N-morfolino)-etanolsulfónico (MES).
   2. Prepara una solución de persulfato de amonio (APS) al 10% (p/v) disolviendo 0,1 g de APS en 1 g de_H2O. Prepara la solución fresca cada día y asegúrate de que esté completamente disuelta antes de su uso.
   3. Prepara un cóctel en gel mezclando 4 mL de solución de gel con 28 μL de APS al 10%, y luego añade 10 μL de tetrametiletilendiamina (TEMED) al 99% de N,N,N'N'-tetrametilendiamina (TEMED) en viales plásticos limpios. Mezcla después de añadir cada solución. La solución puede prepararse hasta 3 geles a medida que la mezcla polimeriza rápidamente. El volumen de un cóctel puede ajustarse según el tamaño de las placas y separadores que se vayan a utilizar.
      NOTA: Evita burbujas y espuma al mezclar los distintos reactivos.
   4. Pica lentamente la mezcla de gel entre el conjunto de placas de vidrio desde el centro, como se muestra en las Figuras 1B, C²⁶. En caso de que haya burbujas de aire, elimínalas inclinando suavemente el conjunto de vidrio o golpeando las placas de vidrio con un bolígrafo.
      NOTA: Para obtener geles sin burbujas, evita usar platos de cristal rayados y guárdalos en un baño ácido después de usarlos, lavándolos solo antes del siguiente uso en lugar de guardarlos en bolsas de polietileno. Utiliza una pipeta de 1 mL o 5 mL con una punta pequeña para fundir el gel y añade el cóctel de gel lentamente desde el centro para que se extienda uniformemente mientras inclinas los platos en un ángulo de 45°.
   5. Coloca el conjunto en el horno precalentado y mantén la temperatura a 42─46 °C durante al menos 1 hora para asegurarte de que el gel se fija completamente (sin goteos de líquido).
   6. Haz una palanca suave del conjunto con la ayuda de una cuchilla limpia y sin óxido desde las esquinas y lava los geles de las placas de cristal usando agua de grado I de laboratorio en una botella de lavado (Figuras 1D–F). Para facilitar la extracción del gel, déjalo en remojo con agua durante unos minutos y luego lávalo en un vaso de precipitados de 1-L que contenga agua de laboratorio de grado I.
      NOTA: Evita tirar del gel con una pinza por si se adhiere a la placa, ya que esto puede provocar deformación del gel. Tras la polimerización, las burbujas aparentes suelen estar entre el gel y la placa de vidrio en lugar de dentro del gel en sí, que se despejan una vez que se retira la placa.
   7. Cambiar el agua al menos 3–4 veces dentro de las 24 horas previas a la hidratación (preferiblemente en intervalos de 2 horas tras la preparación) para eliminar los productos químicos de polimerización restantes. Al reemplazar repetidamente el agua durante la hidratación, impurezas como los reactivos no reaccionados se difunden y el pH se reduce, evitando la acumulación de carga dentro del gel.
   8. Almacenar los geles en agua de laboratorio de grado I (durante un corto periodo de aproximadamente 24 horas) o en la nevera con 0,01 mol de ^{NaCl L-1} o_{NaNO 3} (4 °C) si las láminas de gel no se usan inmediatamente para la precipitación de ZrOH. Estos geles pueden almacenarse en NaCl hasta 1 mes antes de la precipitación.
      NOTA: Recomendamos precipitar los geles inmediatamente después de la polimerización para minimizar la contaminación que pueda introducirse durante el lavado.
3. Precipitación de geles ZrOH¹⁴
   1. Disolver 3,22 g de octahidrato de óxido de dicloruro de circonio (ZrOCl_{2,8H 2}O) en 40 mL de agua de laboratorio grado I en un vaso de precipitados de plástico de 250 mL.
   2. Coloca hasta 4 láminas de gel y rellena hasta 100 mL. Alternativamente, disuelve 1,66 g de ZrOCl_{2,8H 2}O en 20 mL de agua de laboratorio de grado I, pon 2 geles y llena hasta 50 mL.
   3. Remoja las láminas de gel durante al menos 2 horas para asegurar una distribución uniforme del Zr en los geles.
   4. Transfiere cada gel a 100 mL de 0,05 mol de ácido etanosulfónico (MES) ^L-1 2-(N-morfolino)-etanol (MES) amortiguado a pH 6,7 (el pH se ajusta con 1 mol ^L-1 NaOH) para la precipitación. Remueve suavemente el gel con una pinza durante los primeros 30-60 segundos para obtener una precipitación homogénea.
   5. Agita suavemente en un agitador de platos a ≤100 rpm durante 40 minutos para obtener una precipitación completa de Zr(OH)₄ en el gel.
      NOTA: Se prefiere una velocidad de agitación más lenta para evitar que los geles se peguen entre sí.
   6. Colocar los geles en agua de laboratorio de grado I en un vaso de precipitados de 1─2 L durante 24 horas para ^{eliminar los iones} Cl- y cambiar el agua al menos 3 veces a intervalos de^{2 horas y 32}. La eliminación exhaustiva de los iones Cl^- puede comprobarse midiendo la conductividad de la solución de enjuague o realizando una prueba de cloruro.
   7. Almacenar el gel en 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3} o NaCl, pero el NaCl es preferido para experimentos en el suelo, ya que el nitrato mejora rápidamente la actividad microbiana del suelo y también es un nutriente importante para^{las plantas.}
   8. Los hidrogeles ZrOH han sido probados hasta 60 semanas (almacenados en frigorífico a 4 °C) y se ha demostrado mantener sus características y buen rendimiento (±10% de los valores objetivo⁾³².
4. Corte en gel
   1. Limpia la placa de metacrilás sin arañazos, las pinzas y una cuchilla afilada y sin óxido. En ausencia de una placa de plexiglás, se puede usar cualquier placa de vidrio gruesa y resistente.
   2. Humece la placa de plexiglás con agua de laboratorio de grado I para ayudar a extender las láminas de hidrogel ZrOH.
   3. Extiende la lámina de hidrogel ZrOH sobre la placa de plexiglás usando pinzas, asegurándote de que quede plana y sin burbujas. Identifica las zonas con agujeros en las láminas; estas zonas deben evitarse al cortar.
   4. Corta con precisión las láminas de hidrogel ZrOH con una cuchilla afilada al tamaño deseado. Retirar el agua de la placa después de cortar ayuda a ver claramente las secciones recortadas.
      NOTA: Para facilitar la identificación de los lados para el mapeo 2D, recomendamos cortar piezas de hidrogel ZrOH en un trapecio en ángulo recto con el lado más largo situado en la parte superior izquierda.
   5. Almacenar los hidrogeles ZrOH en agua de laboratorio de grado I (para almacenamiento a corto plazo y justo antes de la aplicación del gel) o en 0,03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl para almacenamiento a largo plazo (>24 h).

2. Montaje del experimento Rhizobox

NOTA: Las plantas se cultivan en rizocajas rellenas de tierra, cuyo diseño varía en distinto. Recomendamos utilizar rizocajas equipadas con un agujero o agujeros en el fondo o en la parte trasera para facilitar el riego y asegurar una distribución uniforme del agua (véase la Figura Suplementaria 1). Los detalles sobre los materiales y productos químicos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Determinación del llenado y capacidad de retención de agua de la caja de^{rizos 26}
   1. Tamizar el suelo secado al aire usando un tamiz de 2 mm y homogeneizar el suelo. Recomendamos usar suelo de textura media, pero también se puede emplear suelo arenoso o arcilloso, siempre que se empleen técnicas específicas de manipulación (por ejemplo, tipo rizoca, relleno, apertura y riego).
   2. Pesa todos los componentes de la caja de rizos (vacía) junto con las abrazaderas y el papel de aluminio y anota el peso (véase la Figura Suplementaria 2C). Añade 2–3 cajas de rizocajas extra al número requerido para determinar la capacidad de retención de agua (WHC).
   3. Estima la masa de suelo seco necesaria para llenar la caja de rizos. Generalmente, la caja de rizos se rellena hasta 2 cm por debajo de la parte superior. La densidad volumétrica recomendada es aproximadamente de 1,0 a 1,4 g ^cm-3.
   4. Dependiendo del tipo de rizocaja y de la comodidad de su manipulación, rellena cuidadosamente la rizocaja con el suelo seco. Durante y después del relleno, el suelo puede nivelarse usando una placa plana sin compactarlo. También se puede usar suelo ligeramente humedecido para rellenar el rizocajón, manteniendo la estructura del suelo, especialmente en suelos de textura fina o arcilloso pesado (véase Wagner et ^al.26 para una descripción detallada).
   5. Alternativamente, si la caja de rizos se llena por arriba, fijar el papel de aluminio de plástico sobre la caja de rizo, cubrirla con la placa frontal y luego sujetar (véase la Figura Suplementaria 2A–D).
   6. Por comodidad, instala una membrana nucleporal durante el proceso de llenado y asegúrate de que quede plana en la superficie. Se necesita una membrana nucleporal al muestrear exudados radiculares.
   7. Anota el peso de las rizocajas llenas de tierra junto con las pinzas. Calcula la masa de suelo seco (m_{suelo seco}) para cada rizocaja restando el peso de las rizocajas vacías de las rellenas de tierra y registra el peso.
   8. La capacidad de retención de agua se determina primero saturando las rizocajas con agua desionizada y luego dejando que drenen durante ~8 horas. Pesa las rizocajas y calcula la masa de agua (_{m w}) restando el peso de las rizocajas llenas de tierra registradas en el paso 2.1.7 del peso actual. Luego determina WHC (g ^g-1) dividiendo _{m w} por_{m suelo seco}, el resultado es una razón.
      NOTA: No utilice rizocajas utilizadas para la determinación del WHC para el mapeo real, ya que la saturación de agua puede provocar anaerobia y, por tanto, artefactos redox.
   9. El contenido óptimo de agua para la mayoría de las plantas durante el crecimiento debe mantenerse en un 50%─60% WHC (es decir, factor WHC, f_WHC = 0,5─0,6), dependiendo del tipo de suelo y la especie de planta. Estimar la cantidad de agua a añadir (m_{w añadir}) a cada rizocaja de la siguiente manera: m_{w añadir} = WHC x f_{WHC x m suelo seco}.
   10. Riega el rizobox antes de plantar con m_{w add}. Si se riega a través de los agujeros, añade entre 5 y 10 mL de agua a la superficie.
   11. Registra la masa de las rizocajas regadas, que son necesarias para regar las plantas durante el crecimiento.
2. Cultivo y gestión de plantas^12,26
   1. Esteriliza las semillas antes de germinar o plantarlas. Una práctica habitual es colocarlas en etanol al 70% durante 3 minutos y luego en NaClO al 1% durante 15 minutos para evitar el crecimiento de hongos. Después enjuagar las semillas con agua desionizada (aproximadamente 6─7 veces).
   2. Pregerminar las semillas entre papeles filtrantes o rollos de germinación humedecidos con agua o 0,05 mmol L⁻¹ _{CaSO 4} hasta que la radícula emerja.
   3. Transfiere una plántula a cada rhizobox, colócalas cerca de la placa frontal, cúbrela con un poco de tierra y luego añade un poco de agua.
   4. Envuelva las rizocajas en papel de aluminio para evitar la reducción fotoquímica en la rizosfera, evitar el crecimiento de algas y otros microorganismos fotosintéticos, así como evitar estresar las raíces cuando se exponen a la luz. Alternativamente, hay placas frontales negras que no permiten el paso de la luz que pueden usarse en lugar de lámina de Al.
   5. Coloca las cajas de rizos en una rejilla para inclinarlas en la cámara de crecimiento o invernadero con temperatura, humedad relativa e intensidad de luz controladas. Recomendamos una inclinación de 25°─35°.
   6. Riega las rizocajas gravimétricamente al menos 2─3 veces por semana, dependiendo de las necesidades de la planta. Esto se hace pesando las rizocajas y añadiendo agua para compensar la diferencia respecto al peso registrado en el paso 1.2.11. Sin embargo, cuando la biomasa de la planta es significativa y la demanda de agua aumenta, la biomasa debe tenerse en cuenta y ajustar el volumen de riego en consecuencia.
   7. Las prácticas específicas de manejo de cultivos (por ejemplo, fertilización) se realizan según el montaje experimental, las características del suelo, las especies vegetales cultivadas y las necesidades predominantes de control de enfermedades y plagas durante el crecimiento de la planta.
   8. El periodo de crecimiento y el muestreo de exudados radiculares dependen en gran medida del tamaño de los rizoboxes, las especies vegetales y los objetivos del estudio.

3. Muestreo de exudado de raíz^12,26

NOTA: Aquí proporcionamos detalles sobre el muestreo no destructivo de exudados radiculares. Asegúrese de que todos los materiales requeridos estén preparados antes del muestreo y que los materiales experimentales se incluyan durante la muestreo. Los detalles sobre los materiales y los productos químicos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Reducir lentamente el contenido de agua de las rizocajas al 90%─95% WHC (80% para cultivos muy sensibles al estrés por oxígeno) un día o al menos 2 horas antes de la muestra. Esto se puede lograr con precisión calculando primero la cantidad de agua a añadir (m_{w add}) en el paso 2.1.9 usando el 90%─95% WHC, luego recalculando el peso total del rizocajón, el suelo húmedo y una estimación del peso de la planta. Usando un equilibrio, añade agua desionizada hasta que el rizocaja alcance el peso recalculado.
2. Desenrolla el papel de aluminio del rizocajo, identifica y dibuja la región de interés en la placa frontal. Este paso solo es necesario si solo se van a muestrear los segmentos de raíces o las plantas jóvenes.
3. Corta un papel de aluminio y un hidrogel ZrOH (véase el paso 1.3) en las dimensiones especificadas según la región de interés y el tamaño del rizocajo. Si la membrana nucleófora no se instaló durante el proceso de llenado, córtala a las dimensiones deseadas, ligeramente más grande que el hidrogel ZrOH.
4. Coloca las cajas de rizos sobre un soporte plano con la placa frontal extraíble hacia arriba y ábrelas con cuidado (véase la Figura 2A). Retira lentamente el papel de aluminio de plástico asegurándote de que las raíces y la tierra no se alteren.
5. Coloca una regla en el área de interés y captura imágenes de alta resolución, que serán necesarias para el procesamiento posterior de los datos. Una regla sirve como referencia para determinar el tamaño con precisión directamente a partir de la imagen durante el procesado, especialmente si es necesario muestrear muchas cajas de rizo.
6. Añadir una pequeña cantidad de agua al área radicular objetivo hasta que aparezca una fina película de agua en la superficie (véase Figura 2B). Un contenido de humedad más alto (preferiblemente entre un 90% y un 95% de WHC o un 80% para cultivos muy sensibles al estrés por osígeno) del suelo facilita un buen contacto suelo-gel durante el muestreo. Es necesario un mayor contenido de humedad para mantener un flujo constante de moléculas sobre el hidrogel.
7. Coloque la membrana nuclepora precortada directamente sobre la superficie del suelo/región radicular de interés y asegúrese de que quede plana en la interfaz suelo-raíz (véase la Figura 2C).
8. Colocar el hidrogel ZrOH directamente y lo más plano posible sobre la membrana nuclepora en la región de interés y hacer una foto junto con la regla colocada en el lado izquierdo del hidrogel ZrOH (véase la Figura 2D). La regla puede ayudar a determinar el tamaño del hidrogel ZrOH y, en caso de cambios en las propiedades durante el muestreo, el área muestreada, e identificar los lados durante un almacenamiento prolongado (>1 año).
9. Protege el hidrogel ZrOH de la placa frontal colocando un papel de plástico sobre el hidrogel ZrOH (véase la Figura 2D).
10. Cierra suavemente la caja de rizos para reducir el movimiento del hidrogel ZrOH. El movimiento mínimo del hidrogel de ZrOH al cerrar la caja de rizos también puede lograrse uniendo el sándwich de gel (membrana nuclepora + hidrogel de ZrOH + lámina de plástico) a una placa frontal limpia de la caja de rizos con cinta aislante de vinilo, como describen Wagner et^{al 26}.
11. Envuelva la rizocaja en papel de aluminio de nuevo y colócala de nuevo en la cámara de crecimiento/invernadero durante 24 horas. Los exudados de las raíces pueden recogerse durante periodos más o menos largos, siempre que el gel no se seque, y dependiendo del montaje experimental y los objetivos del estudio.
12. Tras el periodo de aplicación, abre suavemente la caja de rizo, retira con cuidado la cinta y la membrana, y recupera el hidrogel. Coloca el hidrogel en una bolsa hermética estéril, añade unas gotas de agua antes de cerrar y luego guárdalo en la nevera (4 °C) hasta el análisis. Guarda los geles en blanco de forma similar a un control de control. Para fines de mapeo 2D, levanta el hidrogel ZrOH junto con una lámina de plástico y marca la parte superior.
13. Retirar las raíces y determinar los parámetros morfológicos de la raíz, el peso fresco y el peso seco para la normalización de los datos de exudados si no se realizan experimentos de resolución temporal.
14. Cierra la caja de rizos y vuelve a colocarla en la cámara climática o en el invernadero si se realizan estudios con resolución temporal.

4. Elución y medición de los^{carboxilatos 12}

NOTA: Se requieren agua fresca de laboratorio de grado I y estándares analíticos de alta pureza para preparar los cimientos en blanco y los estándares. Como garantía de calidad, deben utilizarse estándares certificados de control de calidad. Asegúrese de que las soluciones (muestras y normas) estén libres de partículas filtrando las muestras mediante filtros de nailon de 0,2 μm o 0,45 μm antes del análisis para evitar obstrucciones de tubos. Los detalles sobre los materiales y productos químicos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Retira los hidrogeles ZrOH cargados y en blanco de la nevera, mide las dimensiones con una regla y luego calcula el volumen de cada uno usando un grosor de 0,4 mm para un espaciador de 0,25 mm y 0,64 para un espaciador de 0,4 mm. Para el mapeo 2D, corta los hidrogeles ZrOH al tamaño deseado usando una cuchilla limpia. Ten en cuenta que el límite inferior es de unos 2 x 2 mm debido a las dificultades para cortar piezas más pequeñas y manejar los volúmenes de elución adecuados.
   NOTA: En lugar de una regla, se utiliza papel milimétrico (papel milimétrico) en un lado de la placa de plexiglás usada para cortar, facilitando el corte de los hidrogeles ZrOH en piezas casi perfectas. El grosor de los hidrogeles ZrOH se confirmó usando un calibre vernier.
2. Coloca los hidrogeles de ZrOH o piezas de hidrogel ZrOH en viales de plástico, eluílos añadiendo 0,5 mol de ^L-1 NaOH siguiendo la proporción de 1 mL de eluente por 0,196 cm 3 hidrogel ZrOH y agita en un agitador de plato durante 24 horas a 150 rpm.
3. En caso de que el volumen de elución sea bajo en el caso de una pieza muy pequeña (por ejemplo, 2 x 2 mm) de hidrogel ZrOH, añade agua de laboratorio I en peso para alcanzar 45-60 μL, dependiendo del volumen mínimo necesario para el método analítico utilizado para la cuantificación de carboxilatos (por ejemplo, IC-MS necesita al menos 45 μL de muestra para el automuestreador, dependiendo del instrumento). Registrar la cantidad exacta de agua añadida para llevar el volumen a 45-60 μL, ya que esto será necesario para el cálculo del factor de dilución y concentración real.
4. Filtra las muestras (filtros de nailon de 0,2 μm o 0,45 μm) y transfiere a viales. Recomendamos usar viales de plástico IC de 1,5 mL, ya que pueden congelarse sin romperse. También se pueden usar viales de 330 μL para volúmenes más pequeños, pero hay que tener cuidado de que no haya burbujas de aire.
5. Cuantificar los carboxilatos en la solución de elución mediante el método analítico preferido (por ejemplo, IC-MS, HPLC). Recomendamos su separación mediante CI acoplado a la detección de MS. Alternativamente, la cromatografía líquida de alto o ultra rendimiento (HPLC o UHPLC) puede emplearse en combinación con varios detectores, incluyendo detectores avanzados de MS (por ejemplo, tiempo de vuelo o Orbitrap) o espectrofotométricos.
6. Al final de la medición, las muestras, junto con los estándares, pueden almacenarse en el congelador. Recomendamos almacenar todas las soluciones que contengan carboxilatos a -20 °C durante un periodo máximo de 1 año. Para periodos de almacenamiento superiores a 1 año, se pueden preparar y medir nuevos estándares como control de calidad.
7. Calcular la cantidad total de cada carboxilato en el volumen total de eluato (es decir, volumen de NaOH + volumen de hidrogel + agua añadida) y normalizar por el peso radicular o área radicular y multiplicar por los factores de eficiencia de elución: 0,94 para acónito, 1,00 para citrato, 0,90 para fumarato, 1,02 para lactato, 1,05 para malato, 0,91 para oxalato y 1,00 para succinato (véase Tabla Suplementaria 1). Asegúrese de que se tengan en cuenta los factores de dilución si se han realizado durante la elución y la medición.

5. Mapeo 2D

NOTA: No existe un software específico para crear imágenes 2D de los datos de exudación. El mapeo puede hacerse con Microsoft Excel y Python.

1. Inserta los datos obtenidos en el paso 4.7 de cada pieza de gel en su celda correspondiente dentro de la cuadrícula 2D (filas x columnas). La cuadrícula se genera sobre las fotos tomadas de las raíces durante el muestreo (véase el paso 4.1).
2. Define el tamaño de las cuadrículas y verifica que los datos coincidan.
3. Selecciona la escala de colores y especifica códigos de colores que representen los valores más bajos y más altos.
4. Especifica el rango numérico de datos para la leyenda para asegurarte de que coincide con precisión con la escala seleccionada.
5. Crea un mapa de calor y asegúrate de que no tenga etiquetas ni líneas de cuadrícula. El mapa de calor puede crearse fácilmente en R Software usando el script R de ejemplo proporcionado en el Archivo Suplementario 1.
6. Procesa la imagen y colócala junto a la fotografía de las raíces obtenida durante el muestreo para poder interpretar la distribución espacial de los carboxilatos.
   NOTA: Hoy en día, el mapeo también puede realizarse utilizando herramientas de inteligencia artificial. El procedimiento es sencillo: simplemente copia y pega la cuadrícula numérica de Excel en el chat, y luego solicita un mapa de calor con las dimensiones deseadas de la pieza de gel y la escala de color para la leyenda. Ten en cuenta que el resultado puede no ser siempre perfecto en el primer intento, pero repetir el proceso suele dar resultados precisos. Este enfoque ofrece la ventaja de ser considerablemente más rápido que los métodos manuales.

Results

El método de hidrogel ZrOH se desarrolló inicialmente para muestrear citrato de raíces vegetales cultivadas en tierra y se utilizó con éxito para resolver la distribución espacial de la^{exudación 11}. Antes de adoptar este método para otros carboxilatos, caracterizamos hidrogeles ZrOH para asegurar que fueran adecuados para su uso con otros carboxilatos (véase Tabla Suplementaria 1). Además, eluímos y analizamos hidrogeles ZrOH almacenados cargados de un experimento de rhizobox realizado en 2019. Los hidrogeles ZrOH pueden absorber el 100% de la cantidad cargada en 5 h (~0,2 μmol, 10 mL) para aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato y succinato utilizando los mismos parámetros de elución establecidos por Tiziani et ^al.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). Los hidrogeles ZrOH pueden unirse hasta 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 de carboxilatos (véase la Tabla Suplementaria 1), mucho más altas que las concentraciones (a menudo en el rango de nmol) que suelen encontrarse en la rizosfera. Además, los hidrogeles ZrOH cargados en carboxilato permanecen estables y pueden almacenarse durante varias semanas antes del análisis, minimizando así la degradación microbiana durante y después del muestreo.

Los resultados de la Figura 3 muestran una visualización 2D de la distribución espacial de la exudación de citrato a lo largo de una raíz en racimo de una planta Lupinus albus L (lupino) cultivada en suelo en un suelo con deficiencia en P. El mapa comprende 48 mediciones individuales realizadas en 5 piezas de gel de 2 mm, en las que el gel de ZrOH fue seccionado en agosto de 2025 tras un muestreo de citrato en agosto de 2019. Está claro que los hidrogeles ZrOH absorbieron eficazmente citrato exudado, con resultados cuantificables incluso en un gel pequeño (0,10^{cm 2}), sin necesidad de preconcentración del eluato. Las tasas más altas de exudación de citrato se encontraron en las regiones radiculares del racimo (hasta 2,8 nmol ^cm-2 gel ^h-1), lo que se traduce en 67,2 nmol ^cm-2 en gel el ^día-1, mientras que las tasas más bajas se observaron solo en las piezas de gel en contacto con el suelo. Las raíces del racimo variaban en longitud entre 0,2 mm y 15,6 mm, con una longitud total de 250 mm. Estos resultados confirman la idoneidad de los hidrogeles para el muestreo de carboxilato liberado por raíces durante 24 horas. Los hidrogeles ZrOH también pudieron unirse a otros carboxilatos, como lactato, fumarato, malato y oxalato, además del citrato (Tabla 1). La detección de la mayoría de los carboxilatos de los hidrogeles ZrOH, que se almacenaron a 4 °C durante 6 años, sugiere una degradación mínima de los carboxilatos. Sin embargo, se están realizando experimentos para recopilar mucha más información sobre los siete carboxilatos probados de diferentes especies vegetales.

Figura 1: Pasos críticos para la preparación del gel de poliacrilamida. (A) Alineación del conjunto de la placa de vidrio con un desplazamiento de ~1 mm. (B) Colado en gel y (C) distribución uniforme de la solución de gel en la placa desde el centro de la placa. (D) Hacer palanca con la placa de vidrio usando una cuchilla de afeitar desde la esquina. (E) Remojar los geles para ayudar a separarlos de la placa de vidrio. (F) Lavar el gel en un vaso de precipitados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Muestreo de exudado radicular de un segmento del sistema radicular de plantas cultivado en rizocaja usando hidrogeles ZrOH. (A) Abrir el rizocaja tras retirar la placa frontal y el plástico. (B) Mojar adecuado la interfaz suelo-raíz usando agua desionizada en una botella de lavado. (C) Membrana de grabado de núcleoporo adherida a una interfaz húmeda tierra-raíz. (D) Rizocaja con un hidrogel ZrOH aplicado en la región de interés, cubierto con papel plástico para protección en gel contra la placa frontal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Muestreo de exudado radicular usando hidrogel ZrOH e imagen 2D a escala milimétrica de la exudación de citrato. (A) Foto del hidrogel ZrOH superpuesto sobre la región radicular de interés durante el muestreo para generar rejillas utilizadas para el mapeo. (B) Imagen 2D a escala milimétrica que muestra la distribución de la tasa de exudación de citrato (nmol cm^–2 gel h^–1) una raíz en racimo blanca de Lupinus albus L. (lupino) cultivada en un suelo pobre en fósforo. Cada cuadrícula representa una pieza de gel de 5 x 2 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Planta	Tratamiento	Aconitate	Citrato	Fumarato	Lactato	Malate	Oxalato	Succinato
	mg P kg-1 suelo	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Arroz (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabla 1: Tasas de exudación de acónito, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato y succinato de plantas cultivadas en suelo de Lupinus albus L. (lupino) y Oryza sativa L. (arroz) sometidas a suelo de 0, 50 y 250 mg de P ^kg-1 . LOQ es el límite de cuantificación

Tabla suplementaria 1: Parámetros de elución de NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) (eficiencia de elución y factor de corrección) y capacidad del hidrogel ZrOH para siete carboxilatos. Los datos son medias ± desviaciones estándar de la media (n = 4 para eficiencia de elución y capacidad de carboxilatos individuales y n = 40 para mezcla carboxilada). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Representación esquemática de la caja de rizos recomendada para un riego más fácil. La caja de rizocaja consta de un marco de caja de rizos equipado con agujeros de agua espaciados uniformemente en la parte inferior y trasera para facilitar una distribución uniforme del agua durante el riego, y una placa frontal transparente extraíble para monitorizar el crecimiento de las raíces durante el experimento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Montaje de la caja de rizos y proceso de relleno de tierra. (A) Cubrir los orificios en la parte trasera del marco de la caja de rizos con cinta adhesiva. (B) Colocar una membrana de núcleo y luego colocar papel de aluminio en la parte frontal o al lado abierto del marco de la caja de rizos (asegurarse de que esté lo suficientemente apretado y plano). (C) Colocar la placa frontal y sujetar la caja de rizos. (D) Llenar la caja de rizocaja inclinándola hacia adelante para que las partículas más finas caigan sobre la superficie extraíble y obtener una superficie lisa, como en la imagen. (E) Alternativamente, rellenar el marco cubierto del rizobox (A) desde el lado abierto, nivelarlo con la placa extraíble y luego cubrirlo con membrana nucleófora, papel de plástico y la placa frontal. (F) Montaje final del Rhizobox, regado y plantado. Un procedimiento alternativo de llenado se muestra en Wagner et al. (2020). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: El archivo incluye detalles sobre el script R utilizado para generar un mapa de calor. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El método de muestreo carboxilado descrito aquí emplea hidrogeles ZrOH, para los cuales la preparación y manipulación adecuadas del gel son fundamentales. Para manipular hidrogeles ZrOH, recomendamos mantenerlos húmedos con unas gotas de agua de laboratorio. Durante la preparación, es importante fundir el gel rápidamente tras preparar la mezcla en gel (paso 1.1.3) y asegurarse de que no se formen burbujas entre las placas de vidrio. Las burbujas situadas en el centro del hidrogel ZrOH son especialmente críticas, ya que pueden interferir con la muestra. En cambio, las burbujas en los bordes pueden eliminarse recortando el gel antes de aplicarlo. Además, los carboxilatos liberados por raíces se unen al ZrOH precipitado en los hidrogeles, haciendo esencial una distribución uniforme de Zr durante la precipitación. Una distribución desigual de Zr dentro del gel puede provocar una difusión lateral de carboxilatos, lo que distorsiona su distribución espacial y compromete la fiabilidad de la localización^{2D 26}. Se puede lograr una distribución uniforme de Zr sumergiendo los geles de poliacrilamida en una solución ZrOCl_{2.8H 2O}durante más de 2 h en un vaso más ancho y colocando menos geles¹² (paso 1.2.3). Además, la distribución Zr puede verificarse mediante una microscopía electrónica de barrido (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japón) como recomendaron Guan et ^al.14, quienes desarrollaron los hidrogeles ZrOH. Sin embargo, el SEM no es viable como procedimiento estándar para muestras enormes.

Otro paso fundamental es el relleno del rhizobox, la aplicación de la membrana nuclepora y el riego antes de la aplicación del gel para el muestreo carboxilado. Se debe tener especial cuidado al rellenar y manipular suelos arenosos o arcillosos pesados para asegurar una superficie uniformemente lisa, esencial para un contacto adecuado con el gel, manteniendo además condiciones bien drenadas. Una superficie lisa también es esencial para una correcta fijación de la membrana nucleporo. Es fundamental establecer un buen contacto entre la raíz y el hidrogel ZrOH asegurando que la membrana nuclepore se adhiera correctamente a la superficie del suelo con el mínimo de burbujas de aire. Antes de la aplicación del gel ZrOH también es crucial saturar correctamente el suelo para que el hidrogel ZrOH pueda adherirse firmemente, plano y mantenerse húmedo para preservar su integridad durante el muestreo. Al cortar el gel para mapeo carboxilado 2D, lograr cortes milimétricos puede ser complicado; por ello, recomendamos no bajar de una resolución de 2 x 2 mm. Además, dado que los geles se encogen al secarse, es esencial mantenerlos húmedos tras la muestra para preservar su integridad (paso 3.12). El método actual fue adaptado de Tiziani et ^al.12 , quienes recomendaron el uso de_{NaN 3} como inhibidor microbiano para prevenir la degradación de carboxilatos. En este protocolo, no utilizamos inhibidores microbianos, que se emplean comúnmente para muestrear exudados radiculares (_{NaN 3} o micropur, un material basado en_{AgCl 3})²³, debido a su interferencia con los métodos analíticos y sus posibles efectos sobre el sistema IC-MS.

Hasta la fecha, el método ha sido validado únicamente para siete carboxilatos (acónito, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato, succinato), mientras que el exúdomo radicular comprende una mezcla compleja de compuestos (por ejemplo, fenólicos, aminoácidos, carbohidratos y carboxilatos). Estos otros compuestos importantes no están actualmente contabilizados en el método, ni los hidrogeles ZrOH han sido caracterizados para su muestreo. La presencia de otros oxianiones en el suelo (como fosfato, nitrato) puede afectar la absorción, capacidad y elución de carboxilatos, así como la cuantificación de carboxilatos en IC o HPLC. Además, muestrear sistemas radiculares completos muy grandes de plantas más grandes (por ejemplo, árboles o arbustos) puede ser muy complicado debido a las dificultades para producir hidrogeles de ZrOH muy grandes (>30 cm). Sin embargo, esto es un problema en todas las técnicas actuales de muestreo^{de exudatos 8}. Otra limitación es el uso de rizoboxes. Aunque el crecimiento de plantas en rizocajas es mucho más realista que en sistemas^{hidropónicos 8}, sigue siendo un montaje artificial, con espacio tridimensional limitado para el desarrollo^{radicular 33}. Además, el muestreo se realiza en una superficie 2D, lo que teóricamente podría resultar en la pérdida de carboxilatos exhalados en otras direcciones que no están en contacto con los geles. Sin embargo, esta limitación podría mitigarse mediante difusión, una mayor capacidad de unión de hidrogeles ZrOH para los carboxilatos y el alto contenido de agua del suelo de rizosfera durante la aplicación. Sin embargo, se necesitan validaciones adicionales para determinar estos aspectos.

El método hidrogel ZrOH para muestrear carboxilatos liberados de raíces ofrece varias ventajas sobre los métodos comúnmente utilizados (es decir, híbridos suelo-hidropónica y enfoques hidropónicos). Este enfoque novedoso permite muestreo in situ de carboxilatos de sistemas radiculares no alterados en el suelo, muestreo con resolución temporal (Santner, Mühlbacher y otros, datos no publicados) y mapeo 2D a escala mm. Además, los hidrogeles ZrOH pueden emplearse en raíces durante al menos 24 h¹². Además, debería ser posible muestrear repetidamente el mismo segmento radicular durante períodos más largos con resolución temporal. Este método está mucho mejor desarrollado y caracterizado que métodos similares, como la aplicación de papeles de filtro⁸. Es posible muestrear durante un largo periodo de tiempo con los hidrogeles ZrOH debido a una alta capacidad de gel para carboxilatos, por ejemplo, la menor de 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² para el malato hasta la máxima de 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² para succinato a pH 4,00, con un total de 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² cuando se mezclan los carboxilatos (véase la Tabla Suplementaria 1). Omitir el paso de lavado de raíces (que normalmente tarda entre 20 y 30 minutos por planta) en el método híbrido suelo-hidropónico reduce significativamente el daño al sistema radicular y el sesgo asociado, lo que da lugar a datos más realistas y representativos.

Cabe destacar que los hidrogeles ZrOH cargados no requieren condiciones especiales de almacenamiento, solo refrigeración, y no encontramos preconcentración necesaria tras la elusión en nuestras aplicaciones hasta ahora. Los hidrogeles ZrOH también se une a otros aniones, que se eluyen bajo las mismas condiciones y pueden analizarse mediante IC ^14,34. Esto permite vincular la exudación carboxilada con la distribución espacial de nutrientes en la^{rizosfera 29}.

En conclusión, este novedoso enfoque de muestreo de carboxilatos liberados por raíces es un paso fundamental para la investigación en la rizosfera. Dado que los carboxilatos desempeñan un papel crucial en la movilización y adquisición de nutrientes vegetales (por ejemplo, P, Fe)^35,36, así como en el reclutamiento de microorganismos beneficiosos, este método podría utilizarse para evaluar variedades en cuanto a rasgos radiculares y mejora genética de plantas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol	Sigma-Aldrich		70%
Ácido oxálico	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
ácido transacónico	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Octahidrato de óxido de dicloruro de circonio (ZrOCl2 y multiplicados por 8H2O, 98%)	Termo Científica	A12342.22	98%
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Nitrato de sodio	VWR Chemicals	Número de lote: 19H224150	100%
Ácido nítrico (HNO3)	Sigma-Aldrich	CAS-No: 7697-37-2	>65% para análisis EMSURE® Reag. Ph Eur, ISO
Ácido fúmático	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Persulfato de amonio (APS_(NH4)2S2O8)	Termo Científica	201531000	≥ 98,0%, extra puro, para electroforesis
Ácido succínico	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
Amortiguador de ácido 2-(N-morfolino)-etanolsulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Reticulador	DGT Research Ltd (Lancaster, Reino Unido)	na	2%, derivada de la agarosa
Agitador de placa u horizontal			Any
Cromatografía iónica o IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	Cualquier cromatografía líquida de alto o ultra rendimiento (HPLC o UHPLC) puede emplearse en combinación con varios detectores, incluyendo detectores avanzados de MS (por ejemplo, tiempo de vuelo o Orbitrap) o detectores espectrofotométricos
Medidor de pH			Se puede usar cualquier electrodo de pH de laboratorio
Horno	Carpeta	na	Se puede usar cualquier horno pequeño que mantenga una temperatura determinada, preferiblemente uno más pequeño.
Nylon filters_13 mm 0,45 & micro; M	Tecnología de filtros GVS	Parcela nº: 7135431	También se pueden usar filtros de nylon más grandes, pero se prefieren los más pequeños ya que el volumen eluado es pequeño.
Dihidrato de sulfato de calcio	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	También se puede usar CaSO4.
Solución de acrilamida, 40%	G-Biociencias	786-508	No uses solución de acrilamida mezclada con   Bisacrilamida. Compuesto tóxico que debe manipularse con cuidado en una campana de humos.
Rhizoboxes	https://www.rhizosphere.com/	na	Nuestras cajas de rizos están hechas a medida según el diseño de la Rhizosphere.com
Kit de vial de polipropileno, 1,5 mL	Termo Científica	79812	Se prefieren los viales de plástico IC porque pueden congelarse sin romperse. 330 & micro; L también puede usarse, pero hay que tener cuidado para que no haya burbujas de aire
ácido cis-acónico	Termo Científica	A16010.06	Tech. 85%
N,N,N',N'- tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma-Aldrich	Parcela nº: BCBN1173V	Compuesto tóxico que debe manejarse con cuidado
250 mL viales PP	Sarstedt	Lote nº:2406082
Papel de aluminio	Supermercado local	na
Beakers_1 L/ 2 L
Abrazaderas	Almacén local	na
Placa de vidrio (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Almacén local	na
Ácido L-(-)-Málico	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Estándar de lactato para CI	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Banco de flujo laminar
Ácido L-láctico anhidro	Termo Científica	L13242.14
Grabado de Seguimiento de Nucleporo Membrane_0.2 & micro; m	Cytiva	Lote nº: A29983896
Papel de aluminio de plástico/bolsas de plástico	Almacén local	na
Pinzas de plástico	Semadeni	602
Placa de plexiglás	Almacén local	na
Frascos PP de 30 mL	Spa Aptaca	Parcela nº: 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Cuchillas de afeitar	Almacén local	na
Gobernante	Librería local	na
Hipoclorito de sodio (NaClO)	Reactivos CARLO ERBA	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Lote nº: 22A17C8
Cinta aislante de vinilo	Almacén local	na