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Artículo de método

Recuperación postoperatoria y estabilidad del registro cronónico de electroencefalografía intracraneal multielectrodo en ratas

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DOI:

10.3791/69937

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24 de abril de 2026

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1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un marco estandarizado para la evaluación postquirúrgica tras la implantación crónica de EEG con múltiples electrodos en ratas, incluyendo el seguimiento secuencial de la calidad de la señal, la recuperación conductual y marcadores neuroinflamatorios para determinar el inicio adecuado de registros estables a largo plazo.

Resumen

La implantación intracraneal de múltiples electrodos permite la adquisición simultánea de señales neuronales en las regiones cerebrales, pero introduce perturbaciones postquirúrgicas que pueden afectar la calidad de los datos y el tiempo experimental. Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado para la implantación crónica de electrodos EEG intracraneales multi-sitio y una evaluación estructurada postimplantación en ratas Sprague–Dawley. Los electrodos de alambre de tungsteno se implantan estereotácticamente en tres sitios intracraneales predefinidos (corteza cingulada anterior, hipocampo CA1 y corteza entorrinal) utilizando una estrategia quirúrgica diseñada para minimizar la alteración tisular.

Tras la implantación, el protocolo especifica una evaluación longitudinal en cinco dominios: precisión de localización de electrodos, integridad del potencial local del campo, comportamiento relacionado con el dolor, comportamiento de alimentación y marcadores neuroinflamatorios. Las evaluaciones electrofisiológicas y conductuales se realizan en los momentos predefinidos de la postoperatoria (días basales y postoperatorios 1, 4, 7, 10 y 13) para apoyar un seguimiento consistente de los efectos postquirúrgicos tempranos (n = 3). Se utilizan análisis histológicos para caracterizar las respuestas locales del tejido al final del estudio (n = 3 por punto temporal).

Se proporcionan criterios operativos e intervalos de evaluación para guiar las decisiones sobre la preparación experimental y el inicio de registros a largo plazo. Este protocolo proporciona un enfoque estructurado para la monitorización postimplantación e informa el momento adecuado de los experimentos neurofisiológicos posteriores.

Introducción

La electroencefalografía intracraneal (EEG) permite la medición de alta resolución de la actividad neuronal mediante la grabación de señales directamente del tejido cerebral 1,2, lo que ofrece ventajas en especificidad espacial y fidelidad de señales frente a los enfoques EEG del cuerocabelludo 3. Los registros intracraneales de múltiples regiones ofrecen información sobre las interacciones a nivel de red, que se utilizan ampliamente para investigar la dinámica neuronal subyacente a la cognición y la enfermedad y se implementan comúnmente en modelos de roedores para estudios mecanicistas ylongitudinales 4,5.

Los electrodos de hilo de tungsteno se emplean comúnmente para grabaciones crónicas debido a su estabilidad mecánica ybiocompatibilidad 6,7,8. Sin embargo, la implantación requiere cirugía invasiva que puede alterar temporalmente la fisiología neural, la integridad tisular y el comportamientoanimal 9,10,11. Desafíos como el estrés quirúrgico agudo, la inflamación local, las respuestas gliales y cambios en el comportamiento alimenticio o nociceptivo pueden influir en la calidad de la señal y la interpretación experimental durante el periodo inicial posteriora la implantación 12,13,14. Sin embargo, este periodo de recuperación sigue siendo en gran medida empírico, con ventanas de recuperación reportadas que oscilan entre 5 y 7 días15,16. Los retrasos prolongados, por el contrario, pueden introducir confusiones adicionales relacionadas con la remodelación tisular o el desplazamientode electrodos 17.

A pesar del uso generalizado del EEG intracraneal crónico, no existe un marco estandarizado para el monitoreo postimplantación que integre evaluaciones electrofisiológicas, conductuales, inflamatorias e histológicas para informar el tiempo experimental. Por ello, el protocolo actual aborda esta carencia describiendo un enfoque estructurado para evaluar el estado postimplantación en un modelo crónico de implantación intracraneal multielectrodo en ratas Sprague–Dawley (SD) anestesiadas (6 semanas). Utilizando electrodos de hilo de tungsteno implantados en la corteza cingulada anterior (Cg1), hipocampo CA1 y corteza entorhinal (CE), el protocolo especifica una evaluación longitudinal de la estabilidad de los electrodos, características de la señal EEG, indicadores conductuales y marcadores inflamatorios durante un periodo de dos semanas. Aunque las evaluaciones se realizan bajo anestesia general por conveniencia práctica, este enfoque no afecta al objetivo principal de establecer un marco para la implantación y estabilidad de electrodos. Este protocolo está destinado a guiar el monitoreo postquirúrgico y apoyar la determinación consistente de los momentos adecuados para iniciar estudios neurofisiológicos posteriores.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales se realizaron conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Capital Medical University (ID de aprobación: AEEI-2024-391).

1. Preparación animal

  1. Conseguir ratas SD macho de 6 semanas (peso corporal 220–230 g). Alojar a los animales en un entorno específico libre de patógenos (24 ± 2 °C, 50 ± 10% de humedad, 12 horas de ciclo luz/oscuridad). Proporcionar comida y agua ad libitum. Aclimatar las ratas durante 7 días antes de la cirugía.
  2. Tras la implantación del electrodo, las ratas domésticas individualmente bajo las mismas condiciones ambientales para evitar daños en la cabeza de la cabeza.
    NOTA: El diagrama de flujo del estudio y las mediciones correspondientes se presentan en la Figura 1A. Los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

2. Cirugía de implantación multielectrodo

  1. Anestesiar ratas con isoflurano (inducción 3–4%, 2% mantenimiento) administradas con oxígeno a 2 L/min.
  2. Coloca a la rata en un marco estereotáxico y mantén la temperatura corporal a 37 °C usando una almohadilla térmica controlada termostáticamente. Aplica pomada oftálmica de eritromicina para evitar el resecamiento corneal.
  3. Afeita el cuero cabelludo y desinfecta con una solución de iodóforo al 0,5%.
  4. Realizar una incisión en la línea media del cuero cabelludo (1 × 2 cm) para exponer el cráneo y retirar suavemente el periosteo con hisopos de algodón estériles.
  5. Preparación y perforación del cráneo
    1. Identificar bregma y lambda y nivelar el cráneo tanto en los planos antero-posterior como medial-lateral.
    2. Perfora los agujeros de muelas (≤2 mm de diámetro) en las coordenadas objetivo usando un taladro dental de baja velocidad con riego salino intermitente.
  6. Preparación e inserción de electrodos
    1. Utilice electrodos de alambre de tungsteno aislados con poliimida (diámetro del vástago: 300 μm) con una longitud de punta expuesta de 4–8 mm (extremo al ras). Medir la impedancia del electrodo (| Z|) a 1 kHz; los valores aceptables varían de 7–10 kΩ con un ángulo de fase de 1° a 2°.
    2. Insertar lentamente electrodos en las siguientes regiones: Cg1 (corteza cingulada anterior): AP +1,2 mm, ML −0,2 mm, DV −2,4 mm; CA1 (hipocampo): AP −3,3 mm, ML −1,8 mm, DV −3,0 mm; EC (corteza entorrinal): AP −6,7 mm, ML −4,0 mm, DV −8,0 mm.
    3. Implanta un tornillo de cráneo de acero inoxidable sobre la región contralateral CA1 y úsalo como electrodo de tierra.
  7. Fijación y cierre de electrodos
    1. Verificar la profundidad y la orientación correctas del electrodo utilizando coordenadas estereotaxicas durante la implantación; confirmar la localización del electrodo a posteriori mediante la identificación histológica de las pistas de electrodos.
    2. Asegura electrodos y tornillos usando resina dental (curar 30–60 s por capa).
    3. Conecta los cables del electrodo a un conector de cabeza y sutura la piel circundante.
  8. Registrar la actividad EEG de referencia durante 30 minutos en el momento correspondiente (Figura 1A) mientras se mantiene la anestesia.

3. Cuidados y manejo postoperatorios

  1. Permite que las ratas se recuperen en una almohadilla térmica hasta que estén completamente en marcha.
  2. Ratas domésticas bajo temperatura y humedad controladas, con ropa de cama blanda y acceso improvisado a comida y agua para mitigar el estrés.
  3. Inspecciona diariamente los sitios de incisión, la estabilidad de los electrodos y la integridad de la cabeza de la etapa.
  4. Los animales domésticos de forma individual, proporcionan cuidados de heridas diarios (solución de iodóforo al 0,5%) y monitorizan el bienestar sin agentes farmacológicos para evitar efectos de confusión, según estudiosprevios 6,18.

4. Registro longitudinal del EEG

  1. Realiza grabaciones de EEG en los días 1, 4, 7, 10 y 13 tras la implantación.
  2. Anestesiar ratas con isoflurano (inducción 3–4%, 1,5% mantenimiento).
  3. Estabiliza los cables de grabación para minimizar artefactos de movimiento y ruido electromagnético.
  4. Graba EEG durante 30 minutos a partir de las 9:00 a.m. para controlar la variabilidad circadiana.
  5. Utilice los siguientes parámetros de adquisición: tasa de muestreo: 1.000 Hz; filtro pasa banda hardware: 0,5–40 Hz; ganancia: 8–10. Realizar filtrado adicional y rechazo de artefactos fuera de línea.
  6. Las señales EEG aceptables muestran líneas base estables, ruido o deriva mínimos y contenido fisiológicamente plausible de amplitud y frecuencia; excluyan las grabaciones que no cumplen estos criterios.

5. Análisis de señales EEG

  1. Analizar señales EEG utilizando el software de referencia.
  2. Inspecciona visualmente las señales y elimina segmentos con movimiento o artefactos eléctricos.
  3. Calcular la densidad espectral de potencia (PSD) usando FFT (función pwelch).
  4. Cuantifique la actividad oscilatoria calculando el área bajo la curva PSD (AUCpsd) para bandas de frecuencia predefinidas.
  5. Calcular la relación señal-ruido (SNR) como la relación de potencia en la banda de señal objetivo (0,5–40 Hz) respecto a la banda de ruido de fondo (40–80 Hz).
    NOTA: Las señales estables muestran perfiles PSD consistentes a lo largo de días consecutivos de registro.

6. Evaluación del dolor

  1. Evalúa el dolor usando la Escala de Mueca de Rata 19,20 un día antes de la cirugía (línea base) y en todos los días de registro.
  2. Utiliza una cámara de observación (25 cm × 15 cm × 15 cm) y coloca la cámara en la esquina superior izquierda en un ángulo de 45°.
  3. Captura imágenes faciales, aleatoriza el orden de las imágenes y marca el estrechamiento orbital, el aplanamiento de nariz/mejillas, cambios de bigotes y la posición de las orejas (escala 0–2).
  4. Suma las puntuaciones para generar una puntuación total de dolor por animal y por punto temporal.

7. Comportamiento alimenticio y peso corporal

  1. Pesa ratas y mide la ingesta diaria. Calcula la ingesta restando el resto de comida de la comida prepesada después de 24 horas.
  2. Grabar el comportamiento de las ratas de forma continua durante 24 horas usando un sistema de grabación de vídeo. Analizar el comportamiento de alimentación fuera de línea por experimentadores cegados ante las condiciones experimentales.
  3. Monitoriza la alimentación de forma continua. Define un episodio de alimentación como ≥1 evento que dura 5 s–15 min21.
  4. Calcular la ingesta ajustada al peso corporal (g × 100/g de peso corporal); la ingesta media por comida (g/número de eventos de comida); y la tasa de ingesta (g/duración total de la alimentación en mínimo).

8. Evaluación de la neuroinflamación

  1. Eutanasiar ratas con una sobredosis de isoflurano seguida de decapitación.
  2. Recoger tejido cerebral de hemisferios implantados en los días iniciales y postoperatorios 1, 4, 7, 10 y 13 (n = 3 por punto temporal).
  3. Western blot
    1. Extrae la proteína total del tejido cerebral y cuantifica la concentración de proteínas usando un ensayo de ácido bicincónico (BCA). Ajusta todas las muestras a una concentración final de 2 μg/μL y desnaturaliza a 100 °C durante 5 minutos.
    2. Separa las proteínas en un 10% de SDS-PAGE a 120 V durante 90 minutos, cargando 20 μg de proteína por carril.
    3. Transfiere proteínas a una membrana PVDF a 300 mA durante 1 hora.
    4. Bloquear membranas e incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) (1:1.000).
    5. Incubar con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:20.000, 2 h, temperatura ambiente).
    6. Visualiza las bandas usando ECL e imagen con un sistema de imagen quimioluminiscencia usando el modo de exposición automática.
    7. Realiza densitometría usando ImageJ.

9. Seguridad y eliminación de residuos

  1. Manipula el isoflurano usando un sistema activo de recogida.
  2. Desecha los objetos punzantes y tejidos biológicos en recipientes designados para riesgos biológicos.
  3. Eliminar los reactivos químicos conforme a las normativas de seguridad institucionales.

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Resultados

Las 21 ratas SD toleraron la implantación de electrodos intracraneales y completaron el protocolo del estudio. Se recogieron medidas longitudinales (EEG, peso corporal, comportamiento alimenticio y puntuaciones de dolor) de los mismos animales en diferentes momentos (n = 3), mientras que las evaluaciones neuroinflamatorias fueron medidas terminales en cada momento (n = 3 ratas por día: referencia, 1, 4, 7, 10, 13). Los datos se evaluaron para determinar su normalidad mediante pruebas de ...

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Discusión

La implantación crónica de electrodos intracraneales para monitorización EEG en roedores sigue siendo una técnica fundamental para investigar la dinámica neural a alta resolución temporal. Establecer una ventana adecuada de monitorización y recuperación postoperatoria es fundamental para garantizar tanto la fiabilidad de la señal como el bienestar animal. Este estudio proporciona un marco estructurado para evaluar la estabilidad electrofisiológica, los resultados conductuales y las respu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Jóvenes Talentos Excelentes de la Universidad Médica Capital (A2308).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema activo de eliminación de isofluoranoRDWR510-31-6
AnimalesRío Charles
Kit de ensayo BCASolarbioPC0020
Sistema de Imagen ChemiDocBio-Rad17001401
Resina dentalVérticeXG473P03
Reactivo de detección ECLSolarbioPE0010
Pomada ocular con eritromicinaRenhe1.00E+11
Anticuerpo secundario anticonejo de cabraProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0GraphPad SoftwareSoftware de análisis estadístico
Amplificador de headstageBIOPAC Systems IncEEG100C
Almohadilla térmicaTecnología YuYanS-100
ImageJInstitutos Nacionales de SaludSoftware de análisis de imágenes
Anticuerpo policlonal IL-6Proteintech21865-1-AP
IodóforoCleanboom430-DFXDY100
IsofluranoRWDR510 y guiño; 31
Dispositivo de grabación neurológica con NeuroExplorer (v 5.012)PlexónOPX-A1600-128-16CSoftware de análisis de datos electrofisiológicos
Membrana PVDFCytivaRPN303F
Sistema SDS-PAGEBio-Rad1658004
Aparato estereotáxicoTecnología científica ZhongShiZS-PDC
TNF-& alfa; Anticuerpo policlonalProteintech17590-1-AP
Aparato de transferenciaBio-Rad1703937
Alambre de tungstenoSistemas A-M785500
Sistema de grabación de vídeoBasleracA1920
Anticuerpo monoclonal de β-actinaProteintech2D4H5

Referencias

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