Artículo de método

Visualización tridimensional de los vasos linfáticos en la piel humana y sus cambios estructurales durante el linfedema

DOI:

10.3791/69972

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13 de febrero de 2026

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1MIRAI Technology Institute, Shiseido Co., Ltd., 2Department of Plastic, Reconstructive, and Aesthetic Surgery, Chiba University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se logró una visualización tridimensional de la estructura de los vasos linfáticos en la piel humana mediante microscopía confocal o de lámina de luz tras la aplicación de tres técnicas distintas de limpieza de tejidos. La combinación de estos métodos con la tinción inmunohistoquímica proporciona información sobre los cambios funcionales en los vasos linfáticos durante la progresión del linfedema.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los vasos linfáticos de la piel, que comprenden capilares y vasos colectores, desempeñan un papel clave en la eliminación de residuos y las respuestas inmunes, y son esenciales para mantener la homeostasis tisular. Sin embargo, la piel humana, con sus tres capas —epidermis, dermis y grasa subcutánea— contiene una matriz extracelular densa rica en colágeno, por lo que visualizar redes linfáticas en tres dimensiones es complicado. Para abordar esta limitación, este artículo presenta tres métodos distintos, cada uno adaptado a moléculas específicas de interés y objetivos experimentales, para la visualización tridimensional de linfáticos cutáneos humanos utilizando reactivos de limpieza tisular en combinación con microscopía confocal o de lámina. Al dirigirse a moléculas de unión adherentes en células endoteliales linfáticas mediante inmunohistoquímica, se evaluaron cambios estructurales con claras implicaciones funcionales, en particular la característica remodelación tipo botón a cremallera de las uniones capilares, en tejidos cutáneos derivados de pacientes con linfedema secundario. Esta técnica de visualización tridimensional revela estructuras vasculares que no son discernibles mediante el análisis convencional de secciones histológicas de tejido, mejorando así la comprensión de la estructura y función de los vasos linfáticos.

Introducción

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Existe un interés creciente en la función de los vasos linfáticos desde el reconocimiento de su papel en el mantenimiento de la homeostasis cutánea, más allá de su implicación bien establecida en la metástasis del cáncer 1,2. Los vasos linfáticos están estructuralmente divididos en capilares y vasos colectores, cada uno con características distintivas. Los capilares linfáticos consisten en una estructura de una sola capa formada por células endoteliales linfáticas y sirven como puntos iniciales de recogida para el líquido intersticial, los productos de desecho y las células inmunitarias. En cambio, los vasos linfáticos colectores tienen una estructura bicapada con células musculares lisas que rodean la capa endotelial linfática, lo que permite el transporte activo del líquido linfático recogido por la red capilar hacia la circulacióncentral 3. Se han utilizado modelos murinos para dilucidar las características estructurales, especialmente de los vasos linfáticos bronquiales, y han demostrado cómo las enfermedades inflamatorias inducen la remodelaciónestructural 4. Trabajos previos demostraron que la inflamación inducida por los ultravioletas causa una dilatación anormal de los capilares linfáticos, lo que compromete su función de recogida de líquidos. Se identificaron los mecanismos moleculares subyacentes a esta disfunción, mostrando específicamente que el aumento de la expresión de VEGF-A junto con una disminución de la expresión de VEGF-C impulsa estas alteraciones estructurales 5,6,7.

Aunque las técnicas de visualización tridimensional han avanzado significativamente la comprensión de la red linfática en modelosmurinos 8,9, el análisis estructural comparable de los vasos linfáticos humanos ha seguido siendo un reto. Esta brecha analítica surge de las dificultades de trabajar con tejidos humanos, incluyendo la limitada disponibilidad de muestras y los problemas técnicos implicados en lograr una imagen tridimensional completa. En particular, la piel, caracterizada por una estructura de tres capas que comprende la epidermis, la dermis y la grasa subcutánea, y que funciona como barrera hacia el entorno externo, presenta mayores desafíos que otros órganos blandos. Además, la piel humana presenta desafíos analíticos distintivos en comparación con los modelos murinos, incluyendo un mayor grosor de tejido, dificultando la penetración profunda por imagen. Además, los abundantes componentes de la matriz extracelular, especialmente el colágeno, junto con sus alteraciones estructurales relacionadas con la edad, crean barreras ópticas que reducen la eficacia de las técnicas emergentes de limpieza tisular que han revolucionado la imagen linfática enratones 10.

Previamente se probaron varios agentes de limpieza de tejidos para visualizar capilares cutáneos humanos, demostrando su compatibilidadtisular 11. Tras ese trabajo, se utilizaron con éxito reactivos de limpieza de tejidos para visualizar los vasos linfáticos de la piel humana en tresdimensiones 12. Al centrarse en las uniones adherentes de las células endoteliales linfáticas, se identificaron cambios estructurales en los vasos linfáticos asociados con la progresión dellinfedema 13. El propósito de este artículo es describir en detalle los procedimientos para la visualización tridimensional de vasos linfáticos de la piel humana utilizando combinaciones de tres técnicas de limpieza cutánea, junto con microscopía confocal y microscopía de lámina, y tinción inmunohistoquímica adaptada a objetivos específicos de investigación. En este estudio, aunque nos centramos únicamente en tejidos cutáneos humanos frescos que fueron fijados el día de la escisión y que no han pasado por ciclos de congelación y deshielo, estas técnicas proporcionan información no solo sobre los cambios estructurales de los vasos linfáticos durante la enfermedad y el envejecimiento, sino también sobre las alteraciones funcionales asociadas.

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Protocolo

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Se obtuvieron muestras de piel de sujetos humanos en el Hospital Universitario de Chiba (Chiba, Japón). Todos los procedimientos que involucraban sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario de Chiba y el Centro Global de Innovación Shiseido, y todos los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Pretratamiento de muestras de piel humana

  1. Retirar el tejido subcutáneo de las muestras extirpadas al adquirirlas.
    NOTA: El intervalo entre la extirpación y la adquisición de la piel fue aproximadamente h. Durante el transporte, el tejido se sumergió en DMEM y se mantuvo en compresas de hielo.
  2. Coloca las muestras con el lado epidérmico hacia abajo sobre una placa caliente a 60 °C durante 45 segundos para separar la epidermis de la dermis.
  3. Sumerge inmediatamente los ejemplares en PBS helado.
  4. Separa la epidermis y la dermis con unas pinzas.
  5. Fija las partes dérmicas con paraformaldehído al 4% a 4°C durante 16 horas y luego lávate con PBS antes de su uso.
    NOTA: Tras la fijación, las muestras se almacenaron en PBS a 4 °C, y los pasos de inmunotinción se iniciaron en cuestión de meses.
    PRECAUCIÓN: La solución PFA es tóxica. Toda la preparación y manipulación deben realizarse en una campana extractora mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.

2. Inmunotinción de montaje completo combinada con reactivos de eliminación

  1. Técnica iDISCO
    1. Recorta los ejemplares a aproximadamente 5 mm × 5 mm × 5 mm de tamaño.
    2. Transfiere las muestras a un 5% de Triton X-100 y al 2,5% Tween 20 en PBS en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 24 °C durante 16 horas para permeabilización.
    3. Lava las muestras con PBS a 24 °C durante 1 hora, repitiendo el proceso tres veces.
    4. Sumergir las muestras en el buffer de bloqueo A recién preparado (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% azida de sodio en PBS) en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 24 °C durante 72 horas.
    5. Incubar las muestras con anticuerpo primario contra la podoplanina (1:100) en un buffer de bloqueo A sobre un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 37 °C durante 72 horas.
    6. Lava las muestras con el tampón de lavado A (0,1% Tween-20 en PBS) a 24 °C durante 1 hora, repitiendo el proceso tres veces. Luego, mantener las muestras en el buffer de lavado A sobre un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 72 horas.
    7. Incubar las muestras con anticuerpo secundario contra IgG de ratón conjugado a Alexa Fluor 647 (1:1000) en un buffer bloqueante A sobre un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 37 °C durante 72 horas.
    8. Repite el paso 1.6.
    9. Incubar las muestras con 50% de MeOH a 24 °C durante 3 horas.
    10. Incubar las muestras con un 70% de MeOH a 24 °C durante 3 horas.
    11. Incubar los ejemplares con MeOH al 100% a 24 °C durante 16 horas.
    12. Incubar las muestras con diclorometano a 24 °C durante 15 minutos, repitiendo el proceso dos veces.
    13. Limpia las muestras con éter dibenzílico a 24 °C durante 16 horas.
      NOTA: Si el tejido no se ha vuelto transparente en este punto, esperar aún más no supondrá una mejora significativa.
    14. Capturar imágenes de las muestras con un microscopio de lámina.
      NOTA: Utiliza una hoja de luz con un objetivo EC Plan-Neofluar 5×/0.16; ajustar la iluminación (excitación) a 63 nm y la detección a 648 nm; adquirir una pila Z con un tamaño de paso de 5,8 μm.
      PRECAUCIÓN: El metanol, diclorometano y éter dibenzílico son peligrosos. Toda la preparación y manipulación deben realizarse en una campana extractora mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.
  2. Reactivo Rapiclear 1.52
    1. Recorta los ejemplares a aproximadamente 5 mm × 5 mm × 2 mm de tamaño.
    2. Transfiere las muestras a un 2% de Triton-X 100 en PBS sobre un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 24 °C durante 16 horas para permeabilización.
    3. Sumergir las muestras en el tampón bloqueador B recién preparado (suero de burro al 5% y 1% Triton-X 100 en PBS) en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 16 horas.
    4. Incubar las muestras con anticuerpos primarios contra la podoplanina y la VE-cadherina (ambas a 1:100) en un buffer bloqueante B sobre un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 72 horas.
    5. Lava las muestras con el tampón B (3% de NaCl y 0,2% de Triton-X 100 en PBS) a 24 °C durante 1 hora, repitiendo el proceso tres veces. Luego, mantener las muestras en el buffer de lavado B sobre un vibrador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 16 horas.
    6. Lava las muestras con PBS a 24 °C durante 1 hora.
    7. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios contra la IgG del ratón y la IgG del conejo, conjugadas a Alexa Fluor 647 y 568, respectivamente (ambas a 1:1000), en el buffer B bloqueador en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 16 horas.
    8. Repite los pasos 1.5. y 1.6.
    9. Limpiar los ejemplares con al menos 5 veces el volumen de muestra de Rapiclear 1,52 a 24 °C durante 16 horas.
      NOTA: Se observó la limpieza de las regiones periféricas del tejido en menos de 1 hora.
    10. Incrustar las muestras despejadas en una cámara de gel de polidimetilsiloxano colocada sobre un abrigo con el reactivo Rapiclear 1.52 fresco.
    11. Fotografía las muestras con un microscopio confocal.
      NOTA: Utilice un microscopio confocal con un objetivo Plan-Apochromat 10×/0,45 M27; establecer la excitación en 633 nm y 561 nm, y el rango de detección 641-754 nm y 566-628 nm, con un detector de GaAsP; adquiere una pila Z con un tamaño de paso de 3,15 μm.
  3. Técnica CUBIC
    1. Recorta los ejemplares a aproximadamente 5 mm × 5 mm × 3 mm de tamaño.
    2. Sumergir las muestras en un 50% de CUBIC-L a 24 °C durante 24 horas como pretratamiento para la delipidación.
    3. Transfiere las muestras al 100% CUBIC-L en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 37 °C durante 7 días para la delipidación.
    4. Lava las muestras con PBS a temperatura ambiente durante 24 horas.
    5. Sumergir las muestras en un buffer de bloqueo A recién preparado en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 24 °C durante 72 horas.
    6. Incubar las muestras con anticuerpo primario contra VE-cadherina, podoplanina y CD31 (1:100, 1:100 y 1:200, respectivamente) en el buffer bloqueador A en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 37 °C durante 72 horas.
    7. Lava las muestras con el tampón de lavado A a 24 °C durante 1 hora. Repite el proceso tres veces y luego mantén las muestras en el buffer de lavado A en un vibrador orbital ajustado a 50 rpm a 4 °C durante 72 horas.
    8. Incubar los ejemplares con anticuerpos secundarios contra la IgG de ratón, la IgG de conejo y la IgG de oveja, conjugados a Alexa Fluor 647, 568 y 488, respectivamente (todos a 1:1000), en un buffer de bloqueo A en un agitador orbital ajustado a 50 rpm a 37 °C durante 72 horas.
    9. Repite el paso 3.7.
    10. Pre-despejar las muestras con 50% CUBIC-R+(M) a 24 °C durante 16 horas.
    11. Limpiar los ejemplares con 100% CUBIC-R+(M) a 24 °C durante 16 horas.
      NOTA: Si el tejido no se ha vuelto transparente en este punto, esperar aún más no supondrá una mejora significativa.
    12. Fotografía las muestras con un microscopio confocal.
      NOTA: Utilice un microscopio confocal con un objetivo Plan-Apochromat 20×/0,8 M27; establecer excitación en 633 nm, 561 nm y 488 nm, y rango de detección 641-754 nm, 566-628 nm y 479-550 nm, con un detector de GaAsP; adquiere una pila Z con un tamaño de paso de 0,78 μm.

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Resultados

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Diferencia en la transmisancia de la luz de tejido cutáneo humano aclarado con y sin epidermis
La Figura 1 muestra fotografías representativas de muestras de piel humana con y sin epidermis, tras permeabilización y limpieza con el reactivo Rapiclear 1.52. La eliminación epidérmica mejora la transparencia tisular al eliminar la melanina, un potente absorbente de luz, como lo confirma la mayor visibilidad de la línea negra bajo las muestra...

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Discusión

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La visualización tridimensional de las redes linfáticas en tejidos biológicos es de vital importancia para comprender sus características estructurales y funciones fisiológicas, así como los cambios patológicos. Este protocolo presenta tres métodos distintos de limpieza de tejidos optimizados para tejido cutáneo humano, cada uno adaptado a objetivos observacionales específicos.

La extirpación epidérmica se considera un paso crítico para eliminar la melanina, q...

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Divulgaciones

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K.T., E.G., N.I. y K.K. son empleados de Shiseido Co., Ltd.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-CD31R& Sistemas DAF806dilución a 1:200
Anticuerpo anti-PodoplaninaDakoM3619dilución a 1:100
Anticuerpo anti-VE-cadherinaTecnología de señalización celular#2500dilución a 1:100
CUBIC-LIndustria Química de TokioT3740
CUBIC-R+(M)Industria Química de TokioT3741
DMEM, glucosa baja, piruvatoThermo Fisher SCIENTIFIC11885084
Anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo Secundario Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa Fluor 647Thermo Fisher SCIENTIFICA-31571dilución a 1:1000
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 568Thermo Fisher SCIENTIFICA10042dilución a 1:1000
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado contra IgG de Oveja (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher SCIENTIFICA-11015dilución a 1:1000
Rapiclear 1.52Laboratorio SunjinRC152001
Microscopio ZEISS Lightsheet Z.1Carl Zeiss
Microscopio láser confocal ZEISS LSM 880Carl Zeiss

Referencias

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