Gastrectomía en manga en ratones usando pinzas desechables para ligaduras

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que utiliza una pinza de ligadura desechable para crear un modelo de gastrectomía con manga de ratón. Este modelo demuestra baja mortalidad postoperatoria, menor tiempo operatorio y resultados terapéuticos comparables a las técnicas tradicionales de sutura.

Resumen

Los modelos actuales de gastrectomía en manga (SG) dependen en gran medida de la sutura manual, un procedimiento técnicamente exigente con tiempos quirúrgicos prolongados, alta mortalidad perioperatoria y una curva de aprendizaje pronunciada. Esto limita su acceso a investigadores no quirúrgicos. Para abordar este cuello de botella, desarrollamos un protocolo SG simplificado utilizando pinzas de ligadura desechables, comúnmente empleadas en cirugía gastrointestinal clínica. En ratones C57BL/6J obesos inducidos por la dieta, el enfoque basado en clips redujo el tiempo medio operatorio en un >50% (20,9 ± 3,2 frente a 43,9 ± 3,0 min) y mejoró significativamente la supervivencia a 12 semanas en comparación con la sutura tradicional. El método logró resultados metabólicos equivalentes, incluyendo pérdida de peso sostenida, mejor tolerancia a la glucosa, mayor sensibilidad a la insulina y reducción de la esteatosis hepática. Cabe destacar que el modelo no requiere conocimientos microquirúrgicos especializados ni dispositivos de grapado, que a menudo no están disponibles para aplicaciones murinas. Recomendamos este método basado en clips para los investigadores, especialmente aquellos sin formación quirúrgica avanzada, que priorizan la eficiencia y reproducibilidad del procedimiento en estudios mecanicistas de cirugía bariátrica. Para los cirujanos que buscan la traducción clínica directa, las técnicas basadas en sutura siguen siendo preferibles, aunque con un manejo perioperatorio más riguroso.

Introducción

La cirugía bariátrica es ampliamente reconocida como la intervención más eficaz para la obesidad extrema y sus complicaciones^{asociadas 1}. El modelo de gastrectomía en manga del ratón (SG) es una herramienta valiosa para estudiar los cambios fisiopatológicos y los posibles mecanismos asociados a la cirugía bariátrica. Este modelo es ventajoso porque permite el uso de cepas de ratones genéticamente modificadas, como aquellas con knockouts génicos o sobreexpresión. Los modelos murinos que sean fáciles de replicar, permitan un control estricto de las condiciones experimentales y faciliten la manipulación experimental son esenciales para la traducción^{clínica 2}.

El modelo SG murino convencional utiliza técnicas basadas en suturas para fabricar una bolsa gástrica tubular. Esta metodología implica varios pasos quirúrgicos precisos y normalmente requiere una gran competencia técnica. Las técnicas representativas incluyen SG-capa^{única 3,4} y SG-Lembert ^5,6, con un tiempo medio quirúrgico de aproximadamente 30 a 45^{min 7}. Por tanto, realizar la SG en una cohorte de diez ratones generalmente requiere entre 5 y 7,5 horas de tiempo quirúrgico. En estudios que involucran múltiples cohortes experimentales, las sesiones quirúrgicas acumulativas pueden extenderse durante 2-3 días consecutivos. Los plazos prolongados de los procedimientos pueden introducir restricciones logísticas y variabilidad en las condiciones perioperatorias, lo que afecta a la consistencia experimental y al seguimiento postoperatorio. Los investigadores han explorado enfoques alternativos para desarrollar modelos de ratón-SG más accesibles. Los enfoques asistidos por grapadora (SG-stapler^)7,8 y basados en clips (SG-clip^)9,10,11 representan mejoras notables. Estos métodos simplifican aspectos específicos de la formación de bolsas gástricas y reducen las exigencias técnicas asociadas a la sutura manual, apoyando así una adopción más amplia en entornos de investigación con distintos niveles de experiencia quirúrgica. La técnica de engrapadora SG se enfrenta a limitaciones prácticas en aplicaciones murinas debido a la limitada disponibilidad de dispositivos de grapado de tamaño adecuado, lo que lleva a su uso más frecuente en modelos de ratas. En cuanto al enfoque de clips SG, estudios previos solían emplear uno o dos clips de titanio complementados con suturas^{adjuntas 9,10,11}. La superficie interna lisa de los clips de titanio estándar proporciona una aposición tisular subóptima, lo que requiere fijación suplementaria para garantizar la fiabilidad del procedimiento y la integridad gástrica.

Basándose en las características de los modelos SG-grapadora y clip SG, este protocolo presenta un modelo SG murino desarrollado usando clips ligados desechables. Estas pinzas se emplean habitualmente en colecistectomía, apendicectomía y otras cirugías gastrointestinales. En estos procedimientos, pinzan de forma segura tejidos como el conducto quístico residual, la raíz apéndice y los vasos sanguíneos, eliminando la necesidad de reforzar la sutura adicional. Existen tamaños adecuados para la longitud del estómago de un ratón. Este nuevo modelo SG-clip es sencillo, fiable y demuestra una eficacia terapéutica comparable a la del modelo tradicional de sutura.

Cabe destacar que la SG basada en suturas sigue siendo preferible cuando la investigación busca replicar técnicas quirúrgicas clínicas, investigar efectos biomecánicos o biológicos específicos de sutura, o requerir la máxima precisión anatómica. Para investigadores con habilidades microquirúrgicas avanzadas, los métodos de costura a mano reflejan los procedimientos humanos y, por tanto, son más adecuados para la fidelidad traslacional. En cambio, el modelo de clip de ligadura ofrece una alternativa ágil, eficiente y accesible que mantiene el rigor experimental y amplía la aplicabilidad de la SG murina en diversos entornos de investigación, especialmente cuando la experiencia quirúrgica es limitada.

Protocolo

Este protocolo cumple con las Directrices Éticas Internacionales de Bienestar Animal y ha sido aprobado por el Comité de Bienestar Experimental y Ética Animal de la Universidad de Jinan (Número de aprobación: 20240227-0073).

NOTA: Treinta ratones machos C57BL/6J de tipo salvaje (ocho semanas), que pesaban entre 22 y 25 g, fueron alojados en un entorno específico libre de patógenos (SPF) con una temperatura ambiente de 20-26 °C y 12/12 h alternando día y noche. Tras aclimatarse a una dieta alta en grasas durante 4 semanas, los ratones fueron asignados aleatoriamente a los grupos SC (SG con clip), SS (SG con sutura) y SH (sham) con 10 ratones en cada grupo.

1. Preparación preoperatoria

1. Cambia a una dieta líquida durante 2 días y no ayunas antes de la cirugía.
   NOTA: La transición preoperatoria a una dieta líquida puede facilitar el vaciado de alimentos sólidos del estómago de ratones, reduciendo así la contaminación intraoperatoria. Además, favorece una mejor adaptación a la nutrición líquida postoperatoria, asegurando una ingesta energética adecuada.
2. Fija la almohadilla eléctrica sobre la mesa de operaciones equipada con una mascarilla anestésica y ajusta la temperatura a ~37 °C.
3. Limpia la mesa con alcohol al 75%.
4. Extrae 1 mL de 100 mL de suero fisiológico normal para disolver el polvo de penicilina. Luego, inyecta toda la solución disuelta de penicilina en los 99 mL restantes de solución salina normal para preparar una solución de penicilina con una concentración de 800.000 UI/100 mL.
5. Anestesiar a los ratones con un 3% de isoflurano y 0,5 l/min de oxígeno durante aproximadamente 30 segundos y luego colocar la cabeza en una mascarilla anestésica manteniendo la concentración de isoflurano en el 1,5%.
6. Esteriliza la piel del pecho y abdomen con solución de Anerdian y cúbrela con una toalla estéril.

2. Procedimientos quirúrgicos

1. Laparotomía media: Levantar la piel unos 2 cm por debajo del proceso xifoides y hacer una incisión de 1,5 cm a lo largo de la línea media. Abre la zona libre de músculos a lo largo de la línea alba lo justo para que el separador quepa (aproximadamente 1,5 cm).
2. Externalización estomacal: Con un hisopo húmedo, empuja el colon y parte del intestino delgado hacia la cavidad pélvica. Levanta suavemente el estómago hasta la incisión abdominal con unas pinzas de punta roma y cúbrelo con una toalla nueva cortada con gasa húmeda. Disecar cuidadosamente el ligamento hepatogástrico, el ligamento gastroesplénico y la conexión vascular parcial del seno gástrico al páncreas y cortar con un electrocoagulador.
   NOTA: La colocación oportuna de cortinas nuevas adicionales o bolas de algodón humedecidas durante la externalización gástrica y la incisión puede reducir eficazmente la contaminación por el contenido gástrico.
3. Determinar la extensión de la resección a lo largo de la mayor curvatura del estómago, con el fondo de ojo 3 mm distal al esófago y el antro 3 mm proximal al piloro.
4. Para el grupo SC:
   1. Coloca el clip de ligadura desechable con un aplicador a lo largo del alcance predeterminado de la resección; Redetermina cuidadosamente la distancia de la posición de la pinza entre el esófago y el piloro, y luego clampea.
      NOTA: Antes del recorte, la línea de resección debe ser confirmada de forma colaborativa tanto por el asistente como por el operador para asegurar márgenes precisos de resección.
   2. Preposicionar una bola de algodón humedecida alrededor del estómago para evitar la contaminación de la cavidad abdominal con derrames de contenido gástrico; luego corta rápidamente aproximadamente el 80% del tejido gástrico en el lado de mayor curvatura de la pinza de ligadura.
   3. Esteriliza la incisión tres veces con hisopos anerdianos y limpia una vez con un hisopo salino (Figura 1).
5. Para el grupo SS:
   1. Pinza el cuerpo gástrico a lo largo de la extensión predeterminada de la resección.
   2. Preposicionar una bola de algodón humedecida alrededor del estómago para evitar la contaminación de la cavidad abdominal con derrames de contenido gástrico; Luego utiliza tijeras oftálmicas para cortar rápidamente aproximadamente el 80% del tejido gástrico en el lado de mayor curvatura.
   3. Abre las pinzas y limpia el contenido gástrico con suero salino.
   4. Sutura la incisión dos veces usando suturas quirúrgicas absorbibles 6-0 con una técnica continua de una sola capa. Realizar la primera sutura continua insertando la aguja perpendicular al borde de la incisión, a una distancia de 2-3 mm, atravesando todo el grosor de la pared gástrica y saliendo en un punto equidistante en el lado contralateral. Asegura la puntada inicial con un nudo quirúrgico, continúa la sutura usando mordidas alternas de 2 mm bajo tensión uniforme para evitar que el tejido se arrugue o se haga huecos, y termina con un nudo cuadrado (3-4 pasadas).
   5. Realiza la segunda sutura continua paralela a la primera utilizando un patrón desplazado para mejorar la cobertura y mantener un espaciamiento y tensión consistentes de la mordida, evitando solapamientos o torsiones.
      NOTA: El enrojecimiento de bolas de algodón o gasas indica un sangrado significativo, especialmente en el sitio de la incisión gástrica; Se requiere una electrocoagulación adecuada de la incisión antes de suturar para lograr la hemostasia.
   6. Esteriliza la incisión tres veces con hisopos anerdianos y limpia una vez con un hisopo salino (Figura 2).
6. Para el grupo SH:
   1. Realiza solo la operación de pinzamiento del estómago y libera después de 10 minutos.
   2. Vuelve a colocar el estómago en la cavidad abdominal en la posición correcta y sutura la propia parte de la musculatura propia y la piel con suturas quirúrgicas 5-0, esteriliza y finaliza el procedimiento.
      NOTA: Todos los ratones fueron operados en un plazo de una semana para facilitar un control efectivo del peso y la ingesta de alimentos postoperatorios.

3. Cuidados postoperatorios

1. Coloca a los ratones en una caja de inducción con oxígeno puro. Se pueden despertar después de unos 2 minutos. Quita los ratones y colócalos sobre una almohadilla térmica. Observa detenidamente el estado de conciencia y la respiración, y luego devuélvelos a la jaula cuando puedan moverse.
2. Administrar una única inyección subcutánea de solución salina de glucosa (5% de glucosa y 4,5% de cloruro de sodio) a una dosis de 20 mL/kg.
3. Administrar una inyección subcutánea de meloxicam a una dosis de 4 mg/kg (concentración: 0,4 mg/mL) justo antes de que los ratones recuperen la conciencia tras la cirugía. Repite esta inyección cada 24 horas durante tres días consecutivos.
4. Proporcionar solución nutricional a Abbott y una dieta alta en grasas durante los tres primeros días tras la cirugía; Sustituye la solución nutricional por agua potable el cuarto día postoperatorio.
5. Administrar penicilina (30.000 U/kg) por vía intramuscular durante 3 días consecutivos tras la operación para prevenir infecciones.
6. Observa a los ratones diariamente para detectar condiciones generales y proporciona tratamiento sintomático rápido según sea necesario.

4. Indicadores de detección

NOTA: La supervivencia durante 4 semanas sin complicaciones postoperatorias significativas en ratones se considera cirugía exitosa.

1. Registrar el peso y la duración de la cirugía en el momento de la operación, y monitorizar el peso, la ingesta de alimentos, la tasa de mortalidad y la aparición de complicaciones graves cada semana en cada grupo durante 12 semanas postoperatorias.
2. Realizar evaluaciones metabólicas e intestinales como la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT), la prueba de tolerancia a la insulina (ITT) y la prueba de tránsito del intestino delgado en la semana 12.
   1. Para ipGTT: ratones rápidos durante 12 horas. Corta un segmento de 1 mm de la punta de la cola y mide la glucosa en ayunas (tiempo 0). Administrar una solución de glucosa al 20% por vía intraperitoneal con una dosis de 2 g/kg de peso corporal. Mide los niveles de glucosa en sangre a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos tras la administración.
   2. Para ITT: ratones rápidos durante 6 horas. Mide los niveles de glucosa en ayunas. Administrar solución de insulina (0,075 U/mL) mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 0,5 U/kg de peso corporal. Mide los niveles de glucosa en sangre a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección.
   3. Para el tránsito intestinal delgado: ratones rápidos durante 12 horas. Administrar una suspensión de polvo de carbono al 10% mediante gavage oral a una dosis de 10 mL/kg de peso corporal. Después de 30 minutos, eutanasia a los ratones. Extirpe el intestino delgado intacto desde el piloro hasta el extremo proximal del ceco. Mide la razón de tránsito intestinal como la distancia desde el piloro hasta el borde de ataque de la suspensión de carbono dividida por la longitud total del intestino delgado.
3. Sacrificar a los ratones para observar la estructura anatómica del estómago manguito y la morfología del intestino delgado.
4. Tinte las muestras de hígado con tinción de hematoxilina-eosina (HE) y tinción de aceite rojo O, y recoge las muestras de sangre para la detección del colesterol total sérico (TC), triglicéridos (TG) y ácidos grasos libres (FFA).

5. Análisis estadístico

1. Expresa todas las variables continuas (peso corporal, ingesta de alimentos, razón de tránsito del intestino delgado, niveles de glucosa en sangre y parámetros serológicos) como media ± desviación estándar.
2. Analizar los datos longitudinales de peso corporal y ingesta de alimentos utilizando medidas repetidas bidireccionales (ANOVA) (factores: grupo y tiempo).
3. Analizar las relaciones de tránsito del intestino delgado y los parámetros serológicos utilizando ANOVA unidireccional.
4. Para datos de pruebas de tolerancia a glucosa intraperitoneal (ipGTT) y pruebas de tolerancia a la insulina (ITT), calcular el área bajo la curva (AUC) de cada sujeto y comparar los valores de AUC de grupo usando ANOVA unidireccional.
5. Realizar comparaciones post-hoc por pares con corrección de Bonferroni tras resultados significativos de ANOVA.
6. Define la significación estadística como p < 0,05. Realizar todos los análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

Resultados

El criterio de éxito quirúrgico se definió como que los ratones sobrevivieran más de 4 semanas tras la cirugía sin experimentar complicaciones graves. Las muertes ocurridas después de la cuarta semana postoperatoria se atribuyen a complicaciones. Durante 12 semanas consecutivas de observación postoperatoria, se registró una muerte en el grupo SC el día 24 postoperatorio debido a una herida y infección abdominal causada por suturas, mientras que los nueve ratones restantes sobrevivieron h...

Discusión

Se estableció un modelo SG murino utilizando pinzas de ligadura desechables, lo que resultó en un procedimiento quirúrgico sencillo, eficiente y reproducible. La técnica basada en clip demostró de forma consistente una eficacia terapéutica comparable a la del modelo convencional de sutura con sutura, mientras reducía significativamente el tiempo operatorio y mejoraba las tasas de supervivencia postoperatoria.

La técnica quirúrgica para el modelo de sutura SG e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución anerdiana	Prosperich	HC-3566	Esterilizar la piel del pecho y del abdomen
75% de alcohol	Macklin	E885996-500 ml	Limpia la mesa quirúrgica
Máquina de anestesia animal	YuyanBio	Yuyan-ABS	Equipo de anestesia para ratones
Aplicador	HangzhouKangji	Φ 10 mm y tiempos; 330 mm	Aplicador desechable para pinzas de ligaduras
Pinza desechable para ligaduras	HangzhouKangji	KJ-JZJ02XL	Crea una manga gástrica
Lápiz electroquirúrgico	YuyanBio	Gemini (alimentado por batería)	Hemostasis electrocoagulante durante la operación.
Asegúrate	Laboratorios Abbott	H20181147	Dieta líquida
Glucómetro y tiras reactivas	ACCU-CHEK	Guíame	Monitorización de la glucosa en sangre
Software GraphPad	San Diego, CA, EE. UU.	GraphPad Prism 9	Estadísticas y análisis de datos
Almohadilla térmica	RTtech	RT-jr01	Mantener una temperatura corporal cálida para el ratón durante la cirugía
Dieta alta en grasas	Investigar Dietas, Inc	D12492	60 kcal% de grasa
Isoflurano	RWD	R510-22	Fármacos anestésicos
Meloxicam	Aladdín	M129228-25g	Fármacos analgésicos postoperatorios
Instrumentos microquirúrgicos	Beyotime	FS500	Realizar cirugía animal
Retractor de ratón	CHIU POK	CP-ckq	Retracción quirúrgica abdominal en ratones
Suturas quirúrgicas	Jinhuan Medical	CR537/KCR631	Suturas quirúrgicas