Este protocolo presenta la ruptura de Rayleigh como un proceso leve para aerosolizar vectores de ARNm no virales. La deposición regional de vectores de ARNm aerosolizados se evalúa mediante el modelo de Entrada Nasal Idealizada de Alberta (AINI). La expresión de proteínas de fluorescencia verde (GFP) en células pulmonares humanas representa el mantenimiento de las funciones fisicoquímicas y biológicas de los vectores de ARNm postaerosolizados.
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Artículo de método
Administración intranasal de poliplexos de ARNm mediante aerosoles de ruptura de Rayleigh: un método in vitro para deposición nasal y pruebas funcionales
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Resumen
Resumen
La administración intranasal de terapias con ARNm es una estrategia prometedora para la vacunación y el tratamiento de enfermedades respiratorias, ofreciendo activación inmune directa en el lugar de entrada del patógeno. Sin embargo, los métodos convencionales de aerosolización (por ejemplo, nebulizadores ultrasónicos o de alta presión) deterioran los vectores de ARNm no virales mediante fuerzas de corte excesivas, lo que provoca que los ARNm pierdan su integridad estructural y actividades biológicas. Se utilizó un atomizador nasal de ruptura de Rayleigh para aerosolizar suavemente vectores de ARNm de polietilenemina (PEI) en gotas uniformes. El ARNm codificante de Proteína Fluorescente Verde (GFP) se formuló en poliplexos catiónicos y se caracterizó antes y después de la aerosolización. El proceso de ruptura de Rayleigh forma un microchorro continuo de gotas con un corte mínimo de corte, preservando así las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas. Se observó un tamaño de partícula consistente, un bajo índice de polidispersión y un potencial zeta estable antes y después de la aerosolización, lo que confirma que las propiedades fisicoquímicas de los poliplexos de ARNm se conservaron bien mediante la descomposición de Rayleigh para aerosolización. Utilizando un modelo de Entrada Nasal Idealizada de Alberta (AINI) de la vía aérea nasal, se administraron los aerosoles PEI-ARNm. Los ARNm aerosolizados se depositaron principalmente en las regiones de cornetes. Se encontraron fracciones insignificantes en la nasofaringe o en secciones equivalentes a los pulmones. Además, los poliplexos de ARNm postaerosolizados se administraron con éxito a células epiteliales pulmonares humanas A549 y produjeron una expresión detectable de GFP. Este protocolo demuestra un método no destructivo de administración intranasal de ARNm utilizando aerosolización de ruptura de Rayleigh. Mantiene eficazmente las propiedades fisicoquímicas y las funciones biológicas de los vectores de ARNm no virales, atomizando la fase acuosa en gotas de tamaños adecuados para la deposición nasal dirigida. Este protocolo revela un enfoque novedoso para aerosolizar eficazmente los ARNm y evaluar su deposición regional en la cavidad nasal.
Introducción
La administración de vacunas en la mucosa nasal (el portal de entrada de muchos patógenos respiratorios) puede provocar una fuerte inmunidad local y bloquear las infecciones en su origen. El éxito de las vacunas intranasales contra la gripe y la reciente aprobación de las vacunas intranasales contra la COVID-19 subrayan la eficacia de la vía nasal para inducir respuestas inmunitarias tanto mucosas comosistémicas. Por ello, la administración intranasal de vacunas de ARNm está atrayendo gran interés como estrategia para prevenir infecciones virales respiratorias. Sin embargo, un gran desafío técnico es convertir ....
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Protocolo
NOTA: Cultivar líneas celulares HEK293T y A549 en un medio completo que consiste en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 2% de penicilina-estreptomicina antes de la transfección de ARNm PEI. Pasar ambas líneas celulares aproximadamente cada 48 horas al alcanzar la confluencia. Células semilla con una densidad de 40.000 células por cm² y cultivadas durante ~48 horas. Retirar el medio de cultivo y lavar las células con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) inmediatamente antes de la transfección para eliminar el suero residual y estandarizar las condiciones de ....
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Resultados
Como manuscrito centrado en métodos, los resultados detallados no son el objetivo principal; Sin embargo, se presentan hallazgos representativos para ilustrar los resultados esperados de cada parte del protocolo. Las figuras mencionadas a continuación muestran datos de ejemplo (por ejemplo, gráficos o imágenes) que respaldan la validez del método, pero no se incluyen nuevos análisis cuantitativos más allá de la demostración.
Tamaño de la gota y patrón .......
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Discusión
En este protocolo, antes de aerosolizar la formulación, el ARNm se ramifica con PEI para potenciar la absorción celular. Esto actúa como sustituto para la administración de LNP-ARNm durante la validación in vitro 10,15. PEI-ARNm conserva la mayoría de las funciones de las formulaciones LNP, incluyendo características biológicas y funcionales importantes10. Los grupos amina cargados positivamente e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocieron el apoyo financiero de la Beca de Investigación de Pregrado King's (KURF) y el Fondo de Oportunidad para Estudiantes proporcionado por King's College London.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos centrífugos de 50 mL | Sigma-Aldrich Company Limited | CLS430829-500EA | |
| 50– 1000 y mu; Puntas de la pipeta en L | Sigma-Aldrich Company Limited | Z740031-1000EA | |
| Línea celular A549 | Colección de Cultura de Tipo Americano | ATCC CRM-CCL-185 | |
| Medidor de caudal de aire | N/A | N/A | Se puede usar un caudalímetro de aire genérico. |
| Modelo de Entrada Nasal Idealizada de Alberta (AINI) | TSI Incorporated (a través de Copley Scientific, Reino Unido) | 0001-01-8540 | |
| Cinta indicadora de autoclave | Sigma-Aldrich Company Limited | Z744090 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich Company Limited | D1306 | |
| DMEM (Eagle Medium modificado de Dulbecco) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
| Alcohol etílico, puro | Sigma-Aldrich Company Limited | 32221-M | Comprado a través de Merck |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | A5256701 | |
| Formaldehído | Sigma-Aldrich Company Limited | F8775 | |
| HEK293T Línea Celular | Colección de Cultura de Tipo Americano | ATCC CRL-3216 | |
| Armario de Bioseguridad Heraeus HERAsafe HS 12 | Heraeus | N/A | |
| Impactor de nueva generación | MSP, una división de TSI | 0170-01-1000 | Este producto también aparece en el catálogo Copley, con el número de parte 5201. |
| Cámara Nikon DS-Qi2 Monocroma Microscopio | Nikon | N/A | |
| Multiplatos tratados con cultura celular Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| Frascos tratados con cultivo celular Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156340 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich Company Limited | P7793-1EA | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Cloruro de polietilenimina | Sigma-Aldrich Company Limited | 764965-1G | Comprado a través de SLS |
| Atomizador nasal Rayleigh Jet | Resyca BV Enschede | Adaptador de spray nasal blando | |
| Agua libre de ARNAsa | Thermo Fisher Scientific | J60610. EQC | |
| Cuveta de tallas | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| La célula capilar plegada | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Zetasizer Pro | Malvern Panalytical | Zetasizer Pro | |
| Software Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer | Malvern Panalytical | N/A |
Referencias
- Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
- Van Hoeve, W., et al.
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Reimpresiones y permisos
