Método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para capturar las interacciones ADN-ADN de cromatina asociadas al ARN para mapear la organización del genoma tridimensional relacionada con el ARN.

Resumen

El Método de Interacción ADN-ADN (RDD) con Cromatina Asociada al ARN es una estrategia dirigida para mapear las interacciones de cromatina ancladas por un ARN específico. Simultáneamente, identifica loci genómicos asociados al ARN de interés y resuelve los contactos ADN-ADN a largo alcance entre estos loci, permitiendo inferir la organización espacial y las relaciones regulatorias. En la RDD, se utilizan sondas antisentido biotiniladas complementarias al ARN objetivo para enriquecer complejos ARN-cromatina. Las células se entrecruzan, la cromatina se fragmenta y se repara al extremo, y la ligadura por proximidad se realiza utilizando un enlace diseñado para unir fragmentos de ADN que están espacialmente adyacentes dentro de los complejos capturados. Los productos de la ligación se purifican, se convierten en bibliotecas de secuenciación y se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento para generar mapas de interacción anclados en ARN. La RDD es aplicable tanto a ARN endógenos como a ARN exógenos derivados de microorganismos y virus infectantes del huésped, y es compatible con diversos tipos celulares y condiciones experimentales. El método produce perfiles de contacto específicos de locus, de alta resolución, adecuados para diseccionar el emparejamiento potenciador-promotor, la regulación a largo alcance y la arquitectura genómica tridimensional asociada con ARN codificantes y no codificantes regulatorios. Al integrar el enriquecimiento bioquímico con la ligación por proximidad y la secuenciación de nueva generación, RDD proporciona un flujo de trabajo robusto y reproducible para revelar cómo los ARN organizan la cromatina e influyen en la expresión génica.

Introducción

Hi-C y ChIA-PET han transformado estudios de organización genómica tridimensional (3D) al convertir la proximidad espacial entre fragmentos de cromatina en uniones covalentes de ADN que pueden secuenciarse para inferir contactos físicos a través de escalas desde lazos hasta^{compartimentos 1,2}. Más allá de las proteínas, numerosos ARN participan en las interacciones de cromatina, influyendo en la comunicación potenciador/promotor de represores y en la organización de la cromatina^{de orden superior 3}; sin embargo, a pesar de los avances en ensayos anclados en proteínas, sigue siendo difícil determinar directamente cómo un ARN específico organiza las interacciones ADN-ADN a largo alcance entre sus loci unidos. El objetivo general del Método de Interacción ADN-ADN (RDD) de Cromatina Asociada ^ARN4 es generar mapas de interacción de cromatina anclados en ARN de alta resolución que revelen cómo una especie de ARN definida se asocia con la cromatina y orquesta los contactos ADN-ADN dentro de su vecindad local, permitiendo inferir mecanicamente sobre la comunicación potenciador/promotor-represor y la arquitectura genómica de orden superior centrada en ese^{ARN 5}. Metodológicamente, la RDD enriquece complejos ARN-cromatina entrecruzados con sondas antisentido biotiniladas contra el ARN de interés, realiza ligación de proximidad en complejos con un enlace diseñado para unir fragmentos de ADN espacialmente adyacentes, y construye bibliotecas de secuenciación para obtener perfiles de contacto específicos de locus adecuados para análisis basados en hipótesis en diversos tipos y condiciones celulares, incluyendo contextos que involucran ARN bacteriano o viral exógeno en hospedadores infectados. Estas características sitúan a RDD como un equivalente anclado en ARN de los métodos establecidos de conformación cromosómica, proporcionando información de contacto interpretable en resoluciones adecuadas para el análisis regulatorio.

La razón de ser de la RDD proviene de las limitaciones de las estrategias existentes de mapeo ARN-cromatina. Enfoques de captura dirigida como ChIRP-seq y CHART-seq identifican la ocupación genómica de ADN de un solo ARN, un paradigma de un ARN por todo el ADN que reporta la unión pero no los contactos físicos ADN-ADN entre loci^{ocupados 6,7}. Los ensayos globales, incluyendo GRID-seq y MARGI, se han extendido a todo el ARN a todo el ADN, catalogando proximidades ARN-ADN a nivel genómico pero careciendo de resolución explícita de los contactos ADN-ADN dentro de complejos centrados en^{ARN 3,8}. Métodos multiplexados como RD-SPRITE informan de colocalización de orden superior entre muchos ARN y loci de ADN y transmiten aspectos de la topología^{nuclear 9}, pero las señales suelen estar dominadas por abundantes ARN, que pueden ocultar ARN reguladores de baja abundancia y limitar la profundidad dirigida para la red de interacción de un solo ARN. Las estrategias de enriquecimiento más ligadura ancladas por proteínas o marcas, como ChIA-PET¹⁰,^{PLAC-seq 11} y HiChIP¹², mapean eficazmente bucles centrados en factores pero no anclan interacciones a un ARN definido sin un módulo de captura específico para ARN, dejando sin resolver la dimensión ADN-ADN anclada en ARN. Al integrar el enriquecimiento bioquímico dirigido con la ligadura de proximidad en complejo, RDD captura directamente los contactos ADN-ADN entre fragmentos de cromatina coocupados por el ARN de^{interés 4}, aumenta la sensibilidad y especificidad para ARN de baja a moderada abundancia, y genera mapas de contacto específicos de locus de alta resolución que complementan métodos globales centrados en ocupación (ChIRP/CHART)^6,7 y centrados en proximidad (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3. 8,9} mientras conceptualmente paralela a las estrategias de ligación ancladas a factores proteicos (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. Los lectores deberían considerar la RDD cuando una cuestión biológica requiere resolver relaciones espaciales entre loci de cromatina específicamente asociados a un ARN objetivo —especialmente cuando se hipotetiza que ese ARN puede estructurar, puente o restringir interacciones genómicas a largo alcance para ajustar la transcripción— o al priorizar objetivos regulatorios potenciales del conjunto de unión de un ARN, distinguiendo los núcleos directos centrados en ARN de la mera coocupación, delimitar redes potenciadoras/represoras para ARN específicos, o seguir el recableado de contactos anclados en ARN a través de perturbaciones, etapas de desarrollo o infecciones. En tales escenarios, la RDD aborda una necesidad no satisfecha proporcionando información de interacción ADN-ADN anclada en ARN con la sensibilidad, especificidad y resolución necesarias para estudios mecanicistas rigurosos.

Protocolo

NOTA: Para este método RDD, el sistema de ejemplo utiliza células S2 de Drosophila y tanto los ncRNAs roX2 como 7SK ; Los reactivos de reacción se listan en la Tabla 1, las composiciones de los buffers en la Tabla 2, los detalles de los reactivos y los detalles del instrumento en Materiales . La Figura 1 ofrece una visión general del protocolo para la generación de bibliotecas RDD. Los procedimientos que implican rotación (F8) utilizan los siguientes parámetros: F8, 20 rpm, uu20 y UU30. Para todos los tampones utilizados desde el Paso 2 hasta el Paso 10, suplementar frescamente con 1x inhibidor de la proteinasa (PI) y un inhibidor de RNasa (RI, 0,05 U/μL).

Principios de diseño de sondas: Para ARN novedoso y no reportado, diseña sondas en línea con el Stellaris Probe Designer, luego filtra secuencias no específicas usando herramientas de alineamiento (por ejemplo, alineación tipo BLAST) o UCSC BLAT, seguida de la 3′-biotinilación de las sondas seleccionadas. Para nuevos ARN objetivo, diseña secuencias que coincidan con el ARN objetivo para que sirvan como controles negativos, también sometidos a 3′-biotinilación. El control de calidad consiste en diseñar cebadores de transcripción inversa contra el ARN objetivo para validación de transcripción y cebadores dirigidos al ADN genómico para qPCR para evaluar la contaminación; Incluye cebadores que localizan sitios de unión genómica y regiones no unentes para evaluar la especificidad de la unión. Las sondas relacionadas con roX2 y 7SK se proporcionan en la Tabla 1.

1. Recolección de células y doble reticulación

1. Cultivar células de Drosophila S2 a 27 °C. Procura reunir un total de aproximadamente 3 x 10⁹ celdas. Resuspende las células directamente en el medio de cultivo y, tras el conteo Trypan-blue, aliteracia 8 x 10⁸ celdas en cada tubo cónico de 50 mL de centrifugación.
   1. Mezcla 2 μL de células con 8 μL de DPBS, añade 10 μL de Trippan Blue y luego carga sobre el hemocitómetro para contar células.
      NOTA: Las células de Drosophila S2 se presentan como ejemplo. Normalmente, 8 x 10⁸ celdas corresponden aproximadamente a 40 mL de volumen de cultivo procesados en un único tubo cónico de 50 mL. Los usuarios pueden ajustar las condiciones de cultivo y extraer cantidades celulares según el tipo celular utilizado y la abundancia del ARN objetivo.
2. Añade formaldehído a una concentración final del 1% (p/v) y rota a 27 °C durante 20 minutos.
   NOTA: Realizar fijación a temperatura de cultivo o a temperatura ambiente (RT; 20-25°C). A menos que se indique, gira en la mezcladora (F1, 12 rpm). Para las células adherentes, utiliza un agitador orbital (50 rpm).
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; Usa una campana extractora.
3. Celdas de pellet a 845 x g durante 5 minutos en RT; Descarta el supernadante de los residuos químicos/biológicos apropiados. El pellet celular de 8 x¹⁰ 8 células S2 suele tener un volumen de aproximadamente 1^{cm 3} .
4. Resuspende el pellet en un EGS recién preparado de 2 mM hasta un volumen total de 40 mL en DPBS, y gira a 27 °C durante 40 minutos.
   NOTA: Disolver el EGS en DMSO y transferirlo a DPBS (véase la Tabla 2). El EGS en DMSO es peligroso.
5. Templar añadiendo 2 mL de glicina 2,5 M (final 0,125 M); Gira a 27 °C durante 10 minutos.
6. Pellet a 845 x g durante 5 minutos en RT; Descarta el supernadante de los residuos químicos/biológicos apropiados. Lava pellets dos veces con 40 mL de DPBS precalentado a 27 °C.
7. Pellet a 845 x g durante 5 minutos. Resuspende el pellet celular en 10 mL de DPBS y cuenta las células. El número de células puede disminuir durante el paso de reticulación, normalmente en aproximadamente un 30%.
8. Alícuota: 1 x 10,⁹ celdas en cada tubo de 50 mL; pellet a 845 x g durante 5 minutos en RT; Descarta el sobrenadante. Guarda los pellets a −80 °C.
   NOTA: Todos los siguientes pasos de reacción son para una biblioteca RDD.

2. Lisis celular y permeabilización de núcleos

1. Toma 1 pila de doble reticulación de 10⁹ S2 del congelador de −80 °C. Descongela con agua helada durante 30 minutos.
2. Resuspende las celdas en 50 mL de DPBS, centrifuga a 845 x g durante 5 minutos en RT y descarta el sobrenadante.
3. Lisis celular: Resuspende el pellet celular en 20 mL de buffer de lisis FA al 0,1% (sin Triton X-100). Rota en RT durante 15 minutos. Comprobar por microscopía; Ajusta el tiempo por tipo de célula. La lisis exitosa se indica mediante permeabilización de membrana plasmática y liberación citoplasmática, de modo que los núcleos se vuelven fácilmente visibles como estructuras distintas bajo un microscopio óptico estándar (Figura 2A).
4. Permeabilización de núcleos: Añadir 1,8 mL de SDS al 10% (1% final). Gira a 37 °C durante 15 minutos. Centrifuga a 3.200 x g durante 20 minutos en RT y descarta el sobrenadante. Comprobar por microscopía (Figura 2B); Ajusta el tiempo por tipo de célula. Los núcleos parecen más oscuros, como un velo de membrana, o algunos están separados. Repite hasta que la lisis esté completa.
5. Lavado del núcleo: Resuspende el pellet en un buffer de lisis FA de 20 mL al 0,1% (sin Triton X-100), gira a RT durante 10 minutos, luego centrifuga a 3.200 x g durante 20 minutos en RT, descarta el sobrenadante y marca el tamaño del pellet de núcleos. Guarda el pellet de núcleos a −80 °C para su uso posterior.

3. Fragmentación de la cromatina

1. Resuspende el pellet de núcleos en 15 mL de buffer de lisis FA al 0,1% (con Triton X-100). Aplique 1,5 mL de los núcleos en suspensión en cada tubo de ensayo de fondo redondo de 14 mL, evitando burbujas.
   1. Marca el tamaño del pellet antes de la sonicación para comparar y repite la sonicación si el pellet sigue siendo grande después de la sonicación.
2. Sonica a una amplitud del 38% durante 4,5 minutos, con ciclos de 30 s ENCENDIDO / 30 segundos APAGADO. Recoge toda la cromatina sonicada en un tubo de 15 mL y centrifuga a 3.200 x g durante 20 minutos en RT, luego transfiere el sobrenadante (~13 mL) a un nuevo tubo de 15 mL.

4. Cromatina preclear con perlas de C1

1. Preparar perlas de estreptavidina C1: Una cuota de 400 μL de estreptavidina C1 se agrupa en un tubo de 1,5 mL (100 μL por 1 × 10 celdas⁹ S2), colócalas sobre un imán durante 30 segundos y retira el sobrenadante. Lavar dos veces con 200 μL de buffer de lisis FA al 0,1% (con Triton X-100), luego resuspender en 100 μL de buffer de lisis FA al 0,1% (con Triton X-100).
2. Preclear de cromatina: Añadir los 100 μL de perlas preparadas de estreptavidina C1 en el tubo que contiene ~13 mL de sobrenadante de cromatina sonicada (del paso 3.2); rotar 20 minutos en RT; colocar en un soporte magnético durante 1 minuto y transferir el sobrenadante (cromatina preautorizada) a nuevos tubos de 50 mL; tomar 10 μL y almacenarlos a −20 °C para QC1 (Figura 3A).

5. Hibridar la sonda de ARN con la cromatina preautorizada

1. Añadir 2 volúmenes (26 mL) de tampón de hibridación recién preparado a 1 volumen (13 mL) de cromatina preaclearada; rota 30 minutos en RT.
2. Alicuota la mezcla en tres tubos de 15 mL; añadir 6 μL de sondas biotiniladas de 100 μM (oligonucleótidos de ADN, Tabla 1) a cada muestra (2 μL por tubo de 15 mL); Gira a 37 °C durante la noche. Sella los tapones de los tubos con película.

6. Inmovilizar la sonda - complejo de cromatina en perlas C1

1. Bloquear perlas de estreptavidina C1 con tampón bloqueante: tomar 400 μL de perlas frescas de estreptavidina C1 y lavar dos veces con 800 μL de tampón de lisis FA al 0,1% (sin Triton X-100); añadir 400 μL de Buffer de Bloqueo e incubar en un mezclador (F8) durante 30 minutos en RT. Colócate sobre un imán durante 10 minutos y descarta el sobrenadante; lavar tres veces con 800 μL de tampón de lisis FA al 0,1% (sin Triton X-100). Para cada lavado, haz una pipeta suave para mezclar, colócala sobre el imán durante al menos 30 segundos y luego descarta el sobrenadante.
2. Resuspende las perlas de C1 en 400 μL de tampón de hibridación.
3. Inmoviliza el complejo sonda-cromatina en las perlas de estreptavidina C1: Añade las perlas de estreptavidina C1 tratadas con tampón bloqueante a la correspondiente cromatina hibridada y rota durante 2,5 horas en RT.
4. Transfiere la reacción de inmovilización de tubos de 15 mL a un tubo de 1,5 mL usando un soporte magnético. Colocar cada tubo de 15 mL en una rejilla magnética durante 5 minutos; Quita el sobrenadante. Resuspende las perlas con 1 mL de buffer de lavado y transfiere a un nuevo tubo de 1,5 mL.
5. Lava las esferas cinco veces con 800 μL de buffer de lavado, luego dos veces con buffer TE. Para lavar, añade buffer, incuba en una batidora (F1, 12 rpm) durante 5 minutos a 37 °C, colócala en una rejilla magnética durante 30 segundos y desecha el sobrenadante.
6. Sujeta las esferas en 1.000 μL de buffer TE (1x PI) en RT.

7. Bloqueo de sitios desocupados en perlas C1 con Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB) desnaturalizada

1. Disolver 4,8 mg de IPB en 400 μL de tampón de lavado IPB; rota en RT durante 15 minutos.
2. Solución β-ME: Añadir 1 μL de β-ME a 312 μL de H₂O; mezcla y gira a RT durante 15 minutos.
3. Desnaturalizar el IPB: Añadir 44 μL de la solución β-ME a 400 μL de IPB; mezcla y gira a RT durante 15 minutos.
4. Bloquear las perlas C1: Añadir 220 μL del IPB desnaturalizado a las perlas C1 unidas con el complejo sonda-cromatina (en 1.000 μL TE); rota en RT durante 15 minutos.
5. Lava las cuentas C1 con TE cinco veces. Añade buffer, incuba en una batidora (F8) durante 5 minutos a RT, luego colócala en una rejalla magnética durante 30 segundos y descarta el sobrenadante.

8. Reparación de extremos de cromatina (en cuentas)

1. Añadir 693 μL de mezcla de reparación final a la cromatina en las perlas de C1 y mezclar bien; luego añadir 7 μL de ADN polimerasa T4.
2. Incubar en termomezclador (800 rpm) a 12 °C durante 30 minutos; luego en la batidora (F8) a 16 °C durante 15 minutos.
3. Lava las esferas tres veces con 800 μL de tampón ChIA-PET bien frío, y luego una vez con TE. Para cada lavado, haz una pipeta suave para mezclar, colócala sobre el imán durante al menos 30 segundos y luego descarta el sobrenadante.

9. A-tailing de cromatina (en cuentas)

1. Añade 693 μL de mezcla de A-tailing a la cromatina de las perlas de C1 y mezcla bien, luego añade 7 μL de fragmento de Klenow (exo-3'-5').
2. Incubar en la batidora (F1, 12 rpm) a 37 °C durante 50 minutos. Lava las perlas tres veces con 800 μL de tampón ChIA-PET helado, y luego una vez con tampón de elución.

10. Ligación de proximidad por cromatina (en perlas)

1. Añade 1.390 μL de mezcla de ligación de proximidad a la cromatina en las perlas de C1. Incubar en la batidora (F8) a RT durante 5 minutos.
2. Luego añade 10 μL de ligasa de ADN T4. Gira en la mezcladora (F8) en RT durante 5 minutos, luego cambia a F1 (12 rpm) en RT durante 50 minutos, seguido de 16 °C durante la noche.
3. Lava las perlas tres veces con 800 μL de tampón ChIA-PET helado, luego dos veces con tampón TE.

11. Liberar el ADN de cromatina ligado por proximidad de las perlas C1

1. Añadir 480 μL de tampón de elución LC ChIP a la cromatina en las perlas C1, mezclar bien y añadir 20 μL de 20 mg/mL de proteinasa K para la descruzamiento.
2. Incubar en termomezclador (950 rpm) a 65 °C durante la noche.

12. Purificación de ADN ligada por proximidad (con fenol: cloroformo: reactivos IAA)

1. Haz girar el tubo de bloqueo de fase de alta densidad a 13.500 x g durante 2 minutos en RT. Añade productos de reticulación (500 μL) al tubo de bloqueo de fase de alta densidad.
2. Añade 500 μL de fenol:cloroformo:IAA (usando una punta de pipeta de 5 mL) al tubo de bloqueo de fase de alta densidad. Mezcla suavemente a mano.
   PRECAUCIÓN: Actúa en una campana extractora.
3. Centrifuga a 13.500 x g durante 6 minutos en RT. Durante la centrifugación, prepare un tubo de 1,5 mL añadiendo 52 μL de acetato de sodio de 3 M (pH 5,5) en el fondo. Coloca 1 μL de glucógeno con tinte azul sobre la tapa. No mezcles ni cierres el tubo en este punto.
4. Transfiera rápidamente el sobrenadante del tubo de bloqueo de fase de alta densidad al tubo preparado de 1,5 mL.
5. Añade 520 μL de isopropanol bien frío al tubo de 1,5 mL. Mezcla suavemente y luego coloca a -80 °C durante la noche.
6. Quita el tubo de -80 °C y descongela a RT (~10 min). Centrifugar a 13.500 x g durante ~1 hora a 4 °C para precipitar ADN. Habrá un pellet azul en la parte inferior del tubo.
7. Lava el pellet de ADN con etanol al 75% y retira cuidadosamente el sobrenadante. Añade 800 μL de etanol al 75% helado, centrifuga a 13.500 x g durante 5 minutos a 4 °C y retira el sobrenadante. Repite el lavado con etanol una vez.
   PRECAUCIÓN: Retirar el sobrenadante inmediatamente después de la centrifugación: primero con una punta de 1 mL, luego con una de 100 μL. Los tubos calientes pueden desalojar la bolita azul.
8. Tras el último lavado con etanol, centrifugar a 13.500 x g durante 10 minutos a 4 °C para recoger cualquier residuo de etanol en el fondo y luego retirar cuidadosamente el etanol restante.
9. Seca la cápsula de ADN en un vacío (normalmente entre 1 min 30 s y 2 min). Resuspende la cápsula de ADN en 10 μL de buffer de elución e incuba en RT durante unas 2 horas. Cuantifique el ADN utilizando un cuantificador de ácidos nucleicos y evalúe la calidad con un sistema automático de electroforesis capilar (Figura 3B-C).

13. Etiquetado de ADN Tn5 ligado por proximidad

1. Prueba de etiquetado Tn5: Prepara un volumen total de reacción de 50 μL según la Tabla 1. En un tubo PCR sobre hielo, añadir secuencialmente 50 ng de ADN QC1, ddH₂O y 12,5 μL de tampón de etiquetado 4x. Finalmente, añade la cantidad requerida de enzima Tn5. Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo entre 10 y 20 veces después de cada adición, evitando burbujas. Haz un breve efecto de trompa por el tubo según sea necesario.
   NOTA: Mezclar suavemente y evitar burbujas es fundamental para el etiquetado. Además, la cantidad de Tn5 debe optimizarse empíricamente para lograr la distribución deseada de fragmentos (predominantemente 200 bp-1 kb), y los usuarios pueden ajustar el rango de tamaño ajustando la entrada de Tn5.
2. Reacción de etiquetado: Incubar la reacción a 55 °C durante 10 minutos en un instrumento PCR con la tapa ajustada a 70 °C, y luego mantenerla a 4 °C.
3. Liberación de Tn5 y purificación del ADN: Añadir 50 μL de tampón de elución ChIP y 1 μL de Proteinasa K al ADN marcado (para una concentración final de SDS del 0,5%). Mezcla e incuba en el termomezclador a 65 °C y 900 rpm durante 30 minutos. Purificar el ADN con un kit de purificación de ADN y cuantificar el ADN utilizando un sistema automático de electroforesis capilar (Figura 3D).
   NOTA: En esta etapa, los fragmentos de ADN deberían oscilar predominantemente entre 200 pb y 1 kb. La proporción enzima Tn5 respecto al ADN debe optimizarse empíricamente.
4. Escalado de etiquetado de Tn5: Basándonos en los resultados de la prueba de Tn5, se escala la reacción para el ADN ligado por proximidad usando las mismas condiciones. Tras la etiquetación, retira la muestra del instrumento de PCR y colócala sobre hielo. Centrifuga brevemente hacia abajo, incuba en RT durante 2 minutos y luego añade 5,5 μL de SDS al 10% (p/v; concentración final de SDS: 1%). Mezcla pipeteando arriba y abajo entre 10 y 20 veces, evitando burbujas, y gira hacia abajo brevemente. Incubar muestras a 37 °C en un instrumento de PCR durante al menos 15 minutos. El ADN etiquetado puede almacenarse a -20 °C durante varios días.

14. Cuentas M280 bloqueando

1. Toma 20 μL de perlas M280 y lávalas dos veces con 200 μL de buffer 1x blanco y blanco. Para lavar, añade buffer, vuelve a suspender las cuentas pipeteando, centrifuga brevemente hacia abajo, coloca un imán durante 30 segundos y retira el sobrenadante.
2. Bloqueo de perlas con buffer de bloqueo: Resuspende las perlas M280 en 100 μL de buffer de bloqueo; Gira en la mezcladora (F8) a RT durante 45 minutos.
3. Lavado de cuentas: Gira brevemente hacia abajo, pon en el imán durante 10 minutos y descarta el buffer de bloqueo. Lava las perlas dos veces con 200 μL de 2 buffers en blanco y negro.
4. Bloqueo de perlas con ADN genómico: Resuspende las perlas en 100 μL de 2x tampón en blanco y negro, añade 100 μL de ADN genómico cortado (~500 ng, 300-500 pb), mezcla bien y rota sobre el mezclador (F8) a RT durante 30 minutos.
5. Descarta la mezcla de ADN genómico y lava las perlas dos veces con 200 μL de 1x tampón blanco y negro.

15. Inmovilización de ADN ligado en perlas M280

1. Unir ADN ligado a las perlas M280: Descartar 1x buffer en blanco y negro. Añade todo el ADN fragmentado ligado a las perlas M280, mezclo y rota en la mezcladora (F8) a RT durante 45 minutos.
2. Gira brevemente hacia abajo, coloca sobre el imán y descarta el sobrenadante. Lavar las perlas cinco veces con 500 μL de tampón de lavado precalentado a 37 °C; una vez con 500 μL de 1x B&N; y una vez con 200 μL de 1x blanco y negro. Coloca sobre el imán durante 1 minuto, mezcla suavemente en el fondo del tubo y descarta el sobrenadante. Añade 30 μL de tampón de elución a las perlas (no mezcles).
   1. Para lavar, añade buffer, incuba 5 minutos en la batidora (F8), coloca en el imán 30 s y luego descarta el sobrenadante. Las perlas con ADN ligado y unido pueden almacenarse a -20 °C.

16. Amplificación de ADN ligado en perlas M280

1. Prepara la reacción PCR (según el kit de preparación de la biblioteca de ADN). Transfiere los tubos de PCR a la máquina de PCR y configura el programa.
   NOTA: Los ciclos de amplificación por PCR son críticos para la calidad final de la biblioteca; Aumentar el número de ciclos reduce la complejidad de la biblioteca. Optimiza el número de ciclos empíricamente y generalmente no supera los 15 ciclos.
2. Purificar el producto de PCR usando perlas magnéticas (Figura 3E). Selección de tamaño: Utiliza (0,8-0,61) cuentas magnéticas para hacer selección doble de tamaño de la biblioteca RDD.
   1. La biblioteca final de ADN debería oscilar predominantemente entre 250 y 600 pb (Figura 3F). Asegúrese de que 10-30 ng de ADN de biblioteca se midan mediante cuantificador de ácidos nucleicos para la secuenciación.
3. Secuenciación: sujeto para secuenciación Illumina con 2x 150 pb. La profundidad de secuenciación depende de la expresión de ARN, la densidad del sitio de unión y los patrones a nivel genómico. Aquí, roX2 satura a ~23M lecturas y 7SK a ~8M lecturas, por lo que esta última necesita menos profundidad. Empieza por especie, luego evalúa la redundancia para cualquier profundidad extra: ~5M para Drosophila, ~20M para humano/ratón, ajustando por métricas de control de calidad.

Resultados

Este protocolo describe el método RDD para detectar interacciones ADN-ADN de cromatina asociadas al ARN. El flujo de trabajo comienza con el enriquecimiento bioquímico de complejos ARN-cromatina utilizando sondas biotiniladas, seguido de la ligación por proximidad para enlazar fragmentos de ADN espacialmente adyacentes. Tras construir bibliotecas de secuenciación, se realiza secuenciación de alto rendimiento.

El análisis bioinformático de datos RDD se agiliza mediante la plataforma^{ChIA-PIPE 13}. Los pasos clave en esta cadena analítica incluyen: recortar los enlaces de secuenciación de las lecturas en bruto, mapear las lecturas de extremos emparejados al genoma de referencia, filtrar pares de lecturas mapeados de forma única, eliminar duplicados de PCR y asignar interacciones a sitios de ARN objetivo basándose en coordenadas de la sonda. Normalmente, alrededor del 50% de las lecturas secuenciadas se retienen con éxito tras el filtrado de enlazadores y calidad. A continuación, se agregaron eventos de interacción válidos para generar mapas de contacto específicos de locus, proporcionando perfiles detallados de la arquitectura de cromatina guiada por ARN. Para los datos RDD, implementamos tres ajustes ChIA-PIPE: la secuencia de enlace RDD ("ACGCGATATCTTATTGACT") se usó en lugar del enlace ChIA-PET por defecto ("ACGCGATGGCTACTCTGACT"); el agrupamiento de bucles se realizó con una extensión PET acortada de 50 pb, además de los 500 pb, por defecto, para aumentar la precisión posicional de los sitios de interacción del ARN; y la cobertura de enriquecimiento de ARN se calculó con deepTools (bamCoverage v3.5.1) usando un tamaño de bin de 1 punto base. Estas modificaciones: configuración de enlaces, reducción de extensión PET para un clúster más fino, y ChIA-PIPE adaptado a cobertura de alta resolución para las bibliotecas RDD.

La Figura 4 muestra resultados representativos de RDD para dos ARN no codificantes: roX2¹⁴ (Figura 4A,C; verde), un ARN complejo de compensación de dosis implicado en la regulación de la estructura del cromosoma X y la expresión génica en Drosophila, y 7SK¹⁵ (Figura 4B,D; púrpura), un pequeño ARN nuclear altamente conservado que modula la elongación de la transcripción regulando la actividad P-TEFb en metazoos. Las interacciones de unión al ARN y cromatina detectadas por RDD se visualizan junto con los datos de RNAPII ChIA-PET (arcos azules), destacando la relación estructural entre los bucles asociados al ARN y elementos reguladores clave como promotores (P), potenciadores (E) y sitios de inicio o fin de transcripción (TSS/TES). Los picos de interacción destacados en los datos agregados apoyan un modelo en el que tanto roX2 como 7SK median contactos críticos potenciador-promotor o de cromatina de largo alcance.

El análisis multidimensional se logra integrando interacciones ancladas en RDD con mapas de conformación de cromatina genómica de Hi-C (mapas de calor rojos del panel inferior) y marcas epigenómicas (H3K27ac, H3K27me3), transcripción incipiente (RNA-seq) y datos RNAPII ChIA-PET (Figura 4C,D). En estas regiones, los dominios topológicamente asociados (TADs) se visualizan claramente, con bucles de cromatina guiados por ARN que a menudo se encuentran en los límites de TAD o abarcan múltiples TADs. La anotación adicional con datos de modificación de histonas y transcripción permite discriminar entre regiones de cromatina activa e inactiva. Los principales núcleos reguladores centrados en el ARN están rodeados en la figura.

Emergen patrones distintos para diferentes NCRNA. roX2 se caracteriza por unirse en las regiones TES y buclar a TSSs, localizándose frecuentemente en los límites TAD y formando contactos de largo alcance que pueden cruzar múltiples TADs. En cambio, 7SK se une predominantemente a potenciadores y forma bucles de menor alcance con promotores vecinos, generalmente sin atravesar las fronteras del TAD.

En conjunto, estos resultados confirman que la RDD es un método fiable y de alta resolución para diseccionar la estructura de cromatina 3D específica de ARN. Este enfoque permite una investigación directa sobre los roles espaciales de los ARN reguladores en la arquitectura del genoma y la expresión génica en diversos entornos biológicos.

Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de generación de bibliotecas RDD. Los pasos centrales del flujo de trabajo para la generación de bibliotecas RDD se muestran en secuencia y van acompañados de ilustraciones esquemáticas correspondientes. El procedimiento comienza con doble reticulación y etiquetado con cromatina, seguido de hibridación con una sonda de ARN modificado por biotina e inmovilización mediante estreptavidina. Los pasos posteriores incluyen el a-tailing, la ligación por proximidad con enlaces modificados por biotina y la construcción de bibliotecas. Tras ligar el ADN, se realiza la purificación, fragmentación mediada por Tn5, enriquecimiento de biotina y amplificación de bibliotecas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Imágenes microscopísticas representativas de células de Drosophila S2 que demuestran criterios de control visual de calidad para la lisis celular y la permeabilización de núcleos. (A) La lisis celular exitosa se caracteriza por permeabilización de membrana plasmática y liberación citoplasmática, haciendo que los núcleos sean fácilmente visibles. (B) La permeabilización exitosa de los núcleos se indica por la hinchazón celular, el desprendimiento parcial de la membrana plasmática y núcleos intactos y claramente visibles. Barra de escala = 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis electroferográfico de preparaciones de cromatina. Captura de pantalla de un electroferograma de un sistema de electroforesis capilar perfilando varias muestras de cromatina. (A) Muestra cromatina fragmentada (sonicación) con un tamaño que oscila aproximadamente entre 1000 y 3000 pb, indicando fragmentación exitosa. (B) Ilustra la cromatina asociada con ARN (sondas asociadas al ARN + no unidas), con un pico menor que representa sondas no ligadas, como indica la flecha. (C) Muestra cromatina asociada al ARN, también con un rango de concentración de 1000 a 3000 pb, reflejo de complejos ARN-proteína. (D) Representa la cromatina marcada con Tn5, revelando un rango indicativo de la eficiencia de la etiquetación. (E) Muestra la distribución del tamaño de fragmento de la biblioteca de secuenciación tras la amplificación, abarcando aproximadamente 180-1000 pb. (F) Muestra la distribución del tamaño de fragmento de la biblioteca de secuenciación tras la selección de tamaño, con fragmentos predominantemente enriquecidos en el rango de ~250-600 pb. Se indican los valores de RFU (unidades relativas de fluorescencia) para cada muestra, demostrando la cuantificación efectiva de la integridad y tamaño de la cromatina. Los picos morados representan el marcador. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos de la RDD para las interacciones con cromatina asociadas a NCRNA. (A-B) Muestra las ubicaciones genómicas de la unión de ncRNA roX2 (verde) y 7SK (púrpura), junto con los correspondientes bucles de interacción remota de cromatina. Los datos de RNAPII ChIA-PET (azul) revelan una clara relación reguladora entre estos arcnRNAs y la expresión génica, con picos que indican fuerza de interacción. Abreviaturas: TSS = sitio de inicio de transcripción; TES = sitio final de transcripción; P = promotor; E = potenciador. (C-D) Proporciona una visión de mayor dimensión de la relación entre los bucles de cromatina relacionados con ncRNA roX2 y 7SK y los TADs (rojo), así como los diferentes estados activos y inactivos de cromatina y los niveles de expresión génica. Los círculos destacan áreas con interacciones significativas entre los TADs. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Reactivos de reacción RDD. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Composiciones de búfer RDD. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Pasos críticos en el método
Estimar la cantidad de sondas de ARN y los niveles correspondientes de ARN en la cromatina es crucial. El exceso de sondas puede provocar que las sondas no unidas ocupen sitios de estreptavidina durante el paso de inmovilización, lo que puede dificultar la captura prevista de las interacciones de ARN objetivo. Además, añadir demasiada estreptavidina desperdicia materiales y requiere más IBP desnaturalizado para bloquear eficazmente los terrenos vacíos. Un bloqueo insuficiente puede afectar negativamente a la eficiencia de la ligación de proximidad posterior, especialmente porque el enlace de ligación de proximidad también presenta modificaciones de biotina. Si el bloqueo no se realiza adecuadamente, partes del enlace pueden unirse directamente a las perlas de estreptavidina, complicando los resultados. Además, la proporción entre el enlace y la cromatina debe estimarse cuidadosamente: un exceso de enlazante puede hacer que ambos extremos del ADN de la cromatina sean marcados, inhibiendo la ligadura efectiva de proximidad.

Modificaciones del método
En este estudio, ilustramos el método RDD usando como ejemplo células S2 de Drosophila con arcnRNA roX2 . Los volúmenes de los reactivos necesitan ajustarse en función del tipo celular y los niveles de expresión de NCRNA; si la expresión de NCRNA es alta, se puede reducir la cantidad celular o aumentar la concentración de ARN en la sonda, y viceversa. Aunque este protocolo inmoviliza la cromatina en las perlas, un enfoque alternativo consiste en realizar ligadura de proximidad in situ seguida de un enriquecimiento con sondas de ARN.

Especificidad, controles y control de calidad
Anteriormente describimos y validamos la RDD y realizamos RDDs paralelas en múltiples ARN, mostrando una fuerte especificidad; Los lectores pueden consultar la obra^{anterior 4,16}. La RDD requiere un enriquecimiento específico de locus dependiente de la sonda y que sea reproducible y, cuando sea posible, validado ortogonalmente. Las interacciones verdaderas cumplen tres criterios: enriquecimiento en loci dirigidos a la sonda frente a regiones cercanas no vinculantes; dependencia de la sonda (ausente o notablemente reducida en controles negativos); y reproducibilidad entre réplicas biológicas y validación independiente (por ejemplo, RT-qPCR). Las sondas antisentido fueron diseñadas con Stellaris, cribadas con BLAST/BLAT para eliminar objetivos fuera de objetivo, ordenadas con biotina 3', y validadas por RT y qPCR (incluyendo comprobaciones de contaminación por ADN y enriquecimiento en sitio frente a no sitio). Recomendamos tres controles —sin sonda, sin desplegado/no dirigido, y sondas de ARN no relacionado o sin región de enlace— y evaluamos la especificidad comparando la cobertura qPCR o de secuenciación entre muestras objetivo y control, informando sobre el enriquecimiento de pliegues y el fondo. Para ARN de baja abundancia, aumentar la densidad de la sonda (dentro de las limitaciones fuera del objetivo), aumentar la profundidad de secuenciación y realizar validaciones ortogonales.

Resolución de problemas del método
Si las interacciones ARN-cromatina capturadas son notablemente bajas, la eficiencia de la ligadura por proximidad puede necesitar optimización mediante ajustes de las cantidades de enlace y cromatina. Además, se observaron picos elevados de sondas no unidas mediante electroferogramas capilares automáticos. Los resultados indican que se añadieron demasiadas sondas, lo que puede corregirse reduciendo la cantidad utilizada.

Limitaciones del método
Una ventaja clave del método RDD es su eficiencia para capturar interacciones específicas de cromatina asociadas al ARN, lo que significa que cada experimento solo puede centrarse en un ARN específico a la vez. Además, dado que la ligación de proximidad está diseñada para detectar interacciones por pares, las interacciones entre múltiples sitios no pueden evaluarse simultáneamente.

Importancia del método
El método RDD no solo revela los sitios de unión al ARN, sino que también aclara las relaciones de interacción entre esos sitios, ampliando nuestra comprensión de la arquitectura de la cromatina.

Usos prácticos y potencial futuro de la RDD
La RDD es adecuada para diversos ARN asociados a la cromatina, incluyendo ARN endógenos hospedadores y ARN exógenos de virus u otros microorganismos, lo que pone de manifiesto su amplia aplicabilidad en diferentes campos de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M acetato de magnesio	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
10% SDS (peso/volumen)	Invitrogen	AM9822
10 y veces; Amortiguador de cola A	NEB	B7002S
10 y veces; Amortiguador de reparación final	NEB	B6002S
10 y veces; T4 ADN ligasa tampón	NEB	B0202S
10 y veces; Búfer TBE	Invitrogen	AM9863
Tubos de ensayo de fondo redondo de 14 mL	Corning	352057
2 y veces; Mezcla maestra PCR	NEB	M0541
20 y más veces; Búfer SSC	Invitrogen	AM9770
200-μ Tubos L PCR	Sangon Biotech	F611541-0010
Botellas de almacenamiento de PET cuadradas de 250 mL	Corning	431531
2-Mercaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100 mL	! PRECAUCIÓN β-ME es tóxico; Úsalo siempre en una campana extractora.
Tubos de 2 mL	Eppendorf	22431048
3 M Acetato de sodio pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M acetato de potasio	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Botellas de almacenamiento PET cuadradas de 500 mL	Corning	431532
Balance analítico	Sartorius	BP211D
Contador automático de celdas	Contraestrella	IC1000
Sistema automático de electroforesis capilar	Bióptico	C100100
Sondas biotiniladas	GENEWIZ		Consulta Tabla 1
Pólvora bloqueadora	Invitrogen	T2015
Enlacer puente oligos	GENEWIZ		Consulta Tabla 1
Incubadora CO2	Termo Científica	51033549
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
Kit de preparación de biblioteca de ADN V2 para Illumina	Vazyme	TD501
Kit de purificación de ADN	Zymo	D4013
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) (1 y veces)	Gibco	14190250
Cóctel inhibidor de proteasas sin EDTA	Roche	11836170001
EGS (Bis[succiniMidylsuccinate])	Termo Científica	21565
Amortiguador de elución	Qiagen	19086
Alcohol etílico, puro	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; Úsalo siempre en una campana extractora.
Formamida	Invitrogen	AM9342
Sistema de imagen en gel	Tanon	3500R
Glicina	Invitrogen	50046-1kg
Glucógeno con tinte azul	Invitrogen	AM9516
Cartucho de alta sensibilidad	Bióptico	C105105
Tubos de bloqueo de fase de alta densidad (1,5 mL)	Qiagen	129046
Kit de ensayo fluorométrico de dsDNA de alta sensibilidad	Invitrogen	P32851
Index kit V2 para Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB)	Termo Científica	21334
Alcohol isopropílico	Sigma-Aldrich	I9030	! PRECAUCIÓN: El alcohol isopropílico es tóxico; Úsalo siempre en una campana extractora.
Cartucho Kilo base	Bióptico	C105106
Fragmento de Klenow (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Cuentas magnéticas	Beckman	A63881
Rack de separación magnética y nbsp; para tubo de 15 mL	Invitrogen	12301D
Rack de separación magnética y nbsp; para tubo de 2 mL	Invitrogen	12321D
Rack de separación magnética para tubo de PCR	NEB	S1515S
Incubadora microbiológica	Termo Científica	IMH180
Microscopio	Nikon	Eclipse TS2
Mezclador	ELMI	RM-2L
N,N-Dimetilformamida (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! PRECAUCIÓN: El DMF es tóxico; Úsalo siempre en una campana extractora.
Microcentrífuga no refrigerada	Eppendorf	5405000204
Agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Cuantificador de ácidos nucleicos	Invitrogen	P33226
Agitador orbital	Cristal	SYC-2102
Fenol:Cloroformo:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Solución de proteinasa K	Invitrogen	AM2548
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	22628180
Incubadora refrigerada	Termo Científica	IMP180
Microcentrífuga refrigerada	Eppendorf	5404F1621754
Frigorífico	Haier	DW-25L262
Inhibidor de RNasa	Ambión	AM2696
Tubos de 15 mL sin RNasa	Invitrogen	AM12500
Tubos de 50 mL libres de RNasa	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Materiales	VCX130
Cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina C1	Invitrogen	65001
Cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina M-280	Invitrogen	11205D
T4 ADN ligasa	NEB	M0202S
ADN polimerasa T4	NEB	M0203S
pH del tampón TE 8.0	Invitrogen	AM9849
Ciclador térmico	Bio-Rad	1851148
Termomezclador	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Congelador de ultra baja temperatura	Termo Científica	995
Concentrador de vacío	TOMY	MV-100