Atenuación mediada por Tanshinona-IIA de la fibrosis miocárdica post-infarto mediante cambios de señalización IL-33/ST-2 en tejido adiposo epicárdico de rata

Resumen

Este estudio demuestra que Tanshinone IIA (Tan IIA) mitiga la fibrosis post-infarto de miocardio, probablemente mediante la modulación IL-33/ST2, como se muestra en modelos animales y acoplamiento molecular, y validada por ELISA y Western blot.

Resumen

El infarto de miocardio (IM), una forma grave de enfermedad coronaria, suele provocar fibrosis miocárdica, un factor clave que contribuye a la disfunción cardíaca y la insuficiencia cardíaca. El tejido adiposo epicárdico (EAT) está cada vez más implicado en la patología cardiovascular mediante la modulación mediada por citocinas de la función cardíaca. Tanshinone IIA (TanIIA), un compuesto lipofílico derivado de Salvia miltiorrhiza, presenta propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antifibróticas. Este estudio tenía como objetivo evaluar el potencial terapéutico de TanIIA para atenuar la fibrosis miocárdica post-IM y explorar sus mecanismos subyacentes utilizando un enfoque integrativo que combina experimentos in vivo y análisis in silico . Se estableció un modelo murino de MI y se empleó acoplamiento molecular para evaluar la unión de TanIIA a componentes clave de la vía de señalización expresada por interleucina-33/estimulación del crecimiento del gen 2 (IL-33/ST2). Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con TanIIA mejoró significativamente la función cardíaca, redujo la lesión histológica y mitigó la fibrosis miocárdica, junto con la disminución de niveles séricos de péptido natriurético pro-cerebral N-terminal (NT-proBNP) y troponina cardíaca I de alta sensibilidad (hs-cTnI). TanIIA también atenuó las respuestas inflamatorias y el estrés oxidativo en el suero, miocardio y EAT. Mecánicamente, TanIIA redujo la expresión de IL-33 y ST2, suprimió la vía del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88)/factor nuclear kappa-B (NF-κB) y redujo los niveles del factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1). Los análisis in silico revelaron además que TanIIA presentaba fuertes afinidades de unión para IL-33, ST2, MyD88 y NF-κB p65, siendo la interacción más estable predicha para ST2. En conjunto, estos hallazgos indican que TanIIA alivia la fibrosis miocárdica inducida por el MI modulando la inflamación asociada a EAT y el estrés oxidativo, potencialmente mediante la inhibición multi-objetivo del eje IL-33/ST2. Estos resultados respaldan a TanIIA como un candidato terapéutico prometedor para el manejo de la fibrosis miocárdica post-infarto.

Introducción

El infarto de miocardio, definido patológicamente como muerte de miococos por isquemia prolongada, sigue siendo un evento cardiovascular potencialmente^{mortal 1}. A pesar de los avances significativos en las estrategias de reperfusión y la farmacoterapia, el IM sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel^mundial 2,3,4,5,6. Una consecuencia fisiopatológica clave del IM es la fibrosis miocárdica, la deposición excesiva de proteínas de la matriz extracelular, que es un factor determinante de los resultados clínicos adversos^posteriores. Esta cicatrización fibrótica, aunque esencial para prevenir la ruptura de la pared ventricular, suele convertirse en un proceso de reparación desadaptativo iniciado por complejos vías inflamatorias e intercelulares 5,7,8,9,10. Al reemplazar el miocardio funcional por tejido cicatricial no contráctil, la fibrosis desadaptativa conduce a un aumento de la rigidez ventricular, disfunción cardíaca progresiva y, en última instancia, insuficiencia cardíaca ^9,11. Por lo tanto, investigar nuevos tratamientos farmacológicos que se dirijan y atenuen específicamente la fibrosis post-infarto es un objetivo terapéutico fundamental para mejorar la morbilidad y mortalidad a largo plazo de los pacientes.

La Salvia miltiorrhiza (Danshen), una medicina tradicional china, y sus diversas preparaciones se emplean ampliamente para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. El Tanshinone IIA, su principal componente lipofílico, es reconocido por múltiples propiedades cardioprotectoras, incluyendo efectos antiateroscleróticos, isquémicos antimiocárdicos y^{antioxidantes} 12,13,14,15. Mecánicamente, TanIIA ejerce sus efectos antiinflamatorios y antifibróticos modulando diversas vías de^{señalización} 13,14,15,16,17. Cabe destacar que se ha demostrado que TanIIA actúa directamente a los adipocitos, suprimiendo sus respuestas inflamatorias y mejorando así la disfunción^{celular 18}. Sin embargo, queda por esclarecer si estos efectos protectores de TanIIA se extienden al tejido adiposo epicárdico.

El tejido adiposo epicárdico, un depósito visceral único de adiposo, está fuertemente implicado en la patogénesis de la enfermedad coronaria (CAD), la fibrilación auricular (FA) y la insuficiencia cardíaca. Anatómicamente situada entre el miocardio y la capa visceral del epicardio sin una capa fascial intermedia, la EAT facilita la comunicación paracrina directa con las estructuras cardíacas^adyacentes 19,20,21,22^. En su estado fisiológico, la EAT es cardioprotectora, proporcionando apoyo metabólico y liberando adipoquinas antiinflamatorias^{y antioxidantes} 20,21,23,24,25,26. Por el contrario, durante condiciones patológicas, la EAT se convierte en una fuente de mediadores proinflamatorios, prooxidativos y pro-fibróticos que impulsan la remodelación cardíaca^adversa 27,28,29,30. En consecuencia, se formuló la hipótesis de que TanIIA podría inhibir la fibrosis miocárdica al atenuar las respuestas inflamatorias y el estrés oxidativo en la grasa epicárdica, potencialmente a través de una nueva vía de señalización.

La interleucina-33, miembro de la familia de citocinas^{IL-1 31}, es reconocida por sus potentes propiedades antihipertróficas y antifibróticas en el sistema^{cardiovascular 25}. Sus efectos biológicos están mediados por un complejo receptor distinto, ST2, que existe en dos isoformas: un receptor transmembrana (ST2L) que inicia la señalización y un receptor señuelo soluble (sST2) que secuestra IL-33-32. Clínicamente, los niveles séricos de sST2 están agudamente elevados tras un infarto de miocardio (IM) y sirven como un marcador pronóstico sólido para los resultados adversos en insuficiencia cardíaca y^miocarditis 33,34,35,36. La cascada canónica de señalización IL-33/ST2L implica el reclutamiento de la proteína adaptadora MyD88 y la posterior activación de TRAF6, lo que conduce a la fosforilación y degradación del inhibidor de NF-κB (IκB) y a la consecuente translocación nuclear de NF-κB^37,38. Esta vía está intrincadamente vinculada con otras citocinas inflamatorias clave; por ejemplo, la señalización de IL-33/MyD88 puede promover la secreción de la citoquina antiinflamatoria IL-10³⁹, mientras que la citoquina proinflamatoria TNF-α puede, a su vez, amplificar la respuesta inflamatoria activando NF-κB para inducir la expresión de^{IL-33 40,41}. Es importante destacar que tanto la IL-33 como ST2 se expresan en tejido adiposo, donde se cree que ejercen efectos antiinflamatorios^locales 31,42,43. Sin embargo, sigue sin explorar si los efectos cardioprotectores de TanIIA implican la modulación del eje IL-33/ST2.

Por ello, el presente estudio fue diseñado para poner a prueba la hipótesis central de que TanIIA previene la fibrosis miocárdica al mitigar la inflamación y el estrés oxidativo derivados del tejido adiposo epicárdico mediante la modulación de la vía IL-33/ST2. Concretamente, planteamos la hipótesis de que esta acción terapéutica está impulsada por el compromiso directo y multi-diana de TanIIA con proteínas clave en esta cascada de señalización. Para validar esto, adoptamos un enfoque dual. En primer lugar, se utilizó un modelo de infarto de miocardio en ratas para confirmar la eficacia in vivo de TanIIA en la mitigación adversa del remodelado cardíaco. En segundo lugar, para proporcionar una base molecular directa a estas observaciones, se empleó acoplamiento computacional para caracterizar la posible unión de TanIIA a cuatro nodos clave de la vía: IL-33, ST2, MyD88 y NF-κB p65. Al investigar el mecanismo desde el nivel tisular hasta eventos moleculares específicos de unión, este estudio pretende establecer un nuevo marco mecanicista para los efectos cardioprotectores de TanIIA.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y prácticas de bienestar animal se llevaron a cabo en estricta conformidad con el Reglamento Ético sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Comité de Animales Éticos de la Universidad de Medicina China de Jiangxi (Nº JZLLSC2023-0702), China.

Simulaciones de acoplamiento molecular
Se empleó un enfoque de acoplamiento molecular in silico para explorar las interacciones directas entre TanIIA y IL-33, ST2L, MyD88 y NF-κB p65. Las coordenadas 3D de TanIIA se obtuvieron de la base de datos PubChem, y el archivo SDF inicial fue posteriormente convertido a un formato PDB. La estructura cristalina de IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) y NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) se obtuvo del banco de datos de proteínas. El procesamiento inicial del receptor se realizó en PyMOL (v2.3.4), donde se retiraron las moléculas de agua y los ligandos originales, seguido de una preparación adicional en AutoDockTools para la adición de hidrógeno y asignación de cargas. Ambas moléculas fueron finalmente convertidas al formato PDBQT. AutoDock Vina (v1.1.2) se utilizó para realizar la simulación de acoplamiento dentro de una cuadrícula definida centrada en el sitio activo. La postura óptima de unión se seleccionó en función de la energía de unión más baja, y se identificaron interacciones detalladas utilizando la herramienta web PLIP. La conformación final acoplada se visualizó usando PyMOL (v2.3.4).

Animales
Ratas machos Sprague-Dawley (SD), clase SPF, de 6 semanas y con un peso de 200 ± 20g (certificado nº SCXK(Su)2023-0009). Las ratas se mantuvieron bajo condiciones estandarizadas, incluyendo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y una temperatura de 22 °C ± 2 °C. Durante el experimento se permitió a los animales acceso ilimitado tanto a la comida como al agua.

Protocolo experimental
Se estableció un modelo de infarto de miocardio en ratas ligando la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Las ratas operadas simuladamente se sometieron a los mismos procedimientos quirúrgicos sin ligadura LAD. Brevemente, las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg), seguida de intubación endotraqueal y ventilación. Se realizó una toracotomía izquierda para exponer el corazón. A continuación, se ligó el LAD con una sutura no absorbible 4-0. La inducción exitosa del MI se confirmó mediante la elevación del segmento ST en un electrocardiograma continuo y un blanqueamiento visible de la pared anterior del ventrículo izquierdo. Tras la cirugía, las ratas recibieron cefoxitina sódica (200 mg/kg/día, i.p.) durante tres días. Veinticuatro horas después de la cirugía, las ratas supervivientes fueron asignadas aleatoriamente a seis grupos (n = 10 por grupo):

Grupo simulado: recibieron inyecciones intraperitoneales de solución salina (1 mL·^kg-1·^día-1).

Grupo MI: recibió inyecciones intraperitoneales de solución salina (1 mL·^kg-1·^día-1).

Grupo TanIIA-L (dosis baja): recibió inyecciones intraperitoneales de TanIIA (7,5 mg·^kg-1·^día-1).

Grupo TanIIA-M (dosis media): recibió inyecciones intraperitoneales de TanIIA (15 mg·^kg-1·^día-1).

Grupo TanIIA-H (dosis alta): recibió inyecciones intraperitoneales de TanIIA (30 mg·^kg-1·^día-1).

Grupo XST (control positivo): recibió gavage oral de valsartán (30 mg·^kg-1·^día-1).

Todos los tratamientos se administraron diariamente durante 28 días consecutivos. Las dosis de TanIIA y XST se seleccionaron basándose en estudios previos y nuestros datos preliminares no^{publicados 44,45}.

Electrocardiograma (ECG) y ecocardiografía
Tras 28 días de tratamiento, la función cardíaca fue evaluada mediante ecocardiografía transtorácica. Con un 2% de anestesia isoflurana (modo de movimiento), se obtuvieron imágenes en modo M para determinar los diámetros del ventrículo izquierdo al final de la diastólica/sistólica (LVIDd/s). Posteriormente se calcularon la fracción de eyección del ventriculo izquierdo (LVEF) y el acortamiento fraccionado (LVFS) a partir de un promedio de tres ciclos cardíacos consecutivos. Además, se registraron electrocardiogramas antes de la cirugía, 15 minutos después de la ligadura y en el punto final experimental para monitorizar la actividad eléctrica cardíaca.

Muestreo y tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
La sangre de la aorta abdominal se centrifugó a 1370 × g durante 15 minutos para aislar el suero, que se almacenó a -80 °C. El corazón y el tejido adiposo epicárdico fueron extirpados y pesados rápidamente. Para análisis moleculares, los tejidos de la EAT y la zona límite del infarto se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Otras muestras de tejido se fijaron en paraformaldehído al 4% para el examen histológico. Además, los corazones seleccionados fueron congelados a -20 °C, seccionados y teñidos con la concepción para evaluar el tamaño del infarto. Los materiales y tejidos animales se utilizan y manipulan cumpliendo con las normativas de seguridad en laboratorio.

Examen histológico
Para la evaluación histopatológica, se sometieron a tinción con hematoxilina y eosina (H&E) con secciones de parafina para observar la morfología miocárdica. La tinción tricroma de Masson se utilizó para evaluar la extensión de la fibrosis miocárdica y el tamaño de los adipocitos epicárdicos, cuantificándose la fracción volumétrica de colágeno (CVF). Además, la proporción de colágeno tipo I a tipo III en la zona no infartada se determinó mediante tinción de rojo picrosirio (PSR). Todas las secciones fueron digitalizadas para análisis cuantitativo.

Inmunohistoquímica
Las secciones miocárdicas incrustadas en parafina se desparafinizaron y rehidrataron. La extracción de antígenos se realizó utilizando un tampón de citrato (pH 6,0). Las secciones se bloquearon con 3% de BSA, luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra el colágeno I, colágeno III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 y TGF-β1. Posteriormente, se incubaron secciones con un anticuerpo secundario marcado por HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción se visualizó con DAB y los núcleos se contrateñieron con hematoxilina. Las imágenes se capturaron utilizando un escáner digital y se analizaron con software de análisis de imágenes para cuantificar la densidad óptica integrada (IOD) de la tinción positiva.

Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas
Las concentraciones de hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 y ST2 se cuantificaron en muestras de suero. Además, se midieron los niveles de IL-10 y TNF-α en suero, homogeneatos miocárdicos y lisados de tejido adiposo epicárdico. Todos los ensayos se realizaron utilizando kits comerciales de inmunoabsorción enzimática (ELISA) según los protocolos del fabricante.

Western blot
Se extrajo proteína total de homogeneados tisulares y las concentraciones se determinaron mediante ensayo de ácido bicincónico (BCA). Cantidades iguales de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilo sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Tras el bloqueo con leche desnatada al 5%, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra IL-10, factor de necrosis tumoral α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 y GAPDH (1:1000). Posteriormente, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:5000) y se visualizaron usando un reactivo ECL. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software y los niveles de proteínas se normalizaron a GAPDH como control interno.

Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de estadística médica. Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media. Para comparar entre dos grupos independientes, se empleó una prueba t. En el caso de varios grupos, se aplicó una ANOVA unidireccional o bidireccional seguida de una prueba Tukey post hoc. Para todos los análisis, se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

Resultados

Efectos de TanIIA en la función cardíaca en ratas con infarto de miocardio (Figura 1)
Estado de salud y cambios en el peso corporal: Las ratas del grupo de MI mostraron mala condición general con distensión abdominal, mientras que las ratas del grupo TanIIA mostraron un mejor estado de salud, mayor ingesta de comida y agua, y mayor actividad. Tras 4 semanas, se observó un aumento significativo del peso co...

Discusión

El presente estudio investiga los efectos de TanIIA sobre la fibrosis miocárdica tras un infarto, junto con los mecanismos subyacentes implicados. Los hallazgos principales son los siguientes: (1) TanIIA atenúa la remodelación cardíaca adversa y mejora la función cardíaca al inhibir la fibrosis cardíaca. (2) Se ha encontrado que la TanIIA inhibe la fibrosis miocárdica al atenuar las respuestas inflamatorias y el estrés oxidativo en la grasa epicárdica. (3) TanIIA media los efectos antifi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de cuantificación de proteínas BCA	Thermo Fisher Corporation	PICPI23223
Kit de GATO	Biotecnología de Enlace Enzimático de Shanghái	202211202
Anticuerpo de colágeno I	Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd	GB114197
Anticuerpo de colágeno III	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03186
Anticuerpo GAPDH	Corporación de Tecnología de Señalización Celular	#5174
GraphPad Prism	Corporación de Software GraphPad	Versión 9.0
Kit GSH	Biotecnología de Enlace Enzimático de Shanghái	202211131
H& Solución de tinción con E	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	H8070; G1100
Anticuerpo anti-conejo IgG marcado por HRP	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	SE134
Hs-cTnI  Equipamiento	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220808
Anticuerpo IL-10	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03088
IL-10  Equipamiento	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211172
IL-33 y nbsp; Equipamiento	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211192
Anticuerpo IL-33	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL04438
Software ImageJ	Institutos Nacionales de Salud	versión Fiji
Image-Pro	Media Cybernetics, EE. UU.	Versión 6.0
Ratas macho de Sprague-Dawley (SD)	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd	SCXK(Su)2023-0009
Kit de tinción de masón	Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd	20221218
Kit MDA	Biotecnología de Enlace Enzimático de Shanghái	202211171
Anticuerpo MyD88	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL02494
NT-proBNP  Equipamiento	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220805
Factor nuclear kappa-B(NF-& kappa; B)(p65) anticuerpos	Corporación Abmart	TP56372
Open Babel	Proyecto de toolkit de quimioinformática de código abierto	Versión 2.3.2
Membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF)	Merck Millipore	R9M2784
Solución PSR	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	G1472
Kit SOD	Biotecnología de Enlace Enzimático de Shanghái	202211201
Anticuerpo ST2	Corporación del Grupo Proteintech	11920-1-AP
Kit ST2	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211183
Soluciones Estadísticas de Productos y Servicios (SPSS)	IBM Corporation	Versión 26.0
Inyección de sulfotanshinona sódica	Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd	2012303
Reactivo de luminiscencia ECL supersensible	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd	MA0186
TGF-& beta; 1 Anticuerpo	ABclonal Corporation	A2124
Cápsula Titanvin Valsartan	Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd	211120
TNF-& alfa;   Equipamiento	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211202
TNF-& alfa; anticuerpo	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL01581
Solución TTC	Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd	20210620
Sistema de ultrasonido de ultra-alta resolución para pequeños animales	VEVOcompany	Vevo 2100