Protocolo para el estudio de la regulación honokiol de la señalización transformante del factor de crecimiento Beta 1/SMAD en modelos de fotoenvejecimiento cutáneo inducido por ultravioleta A

Resumen

Este protocolo investiga si el honokiol mejora el fotoenvejecimiento inducido por UVA en fibroblastos dérmicos humanos y piel de ratón activando la vía TGF-β1/Smad y reduciendo la expresión de MMP.

Resumen

Honokiol (HNK), un componente clave derivado de Magnolia officinalis, tiene el potencial de tratar enfermedades de la piel. Actualmente, el impacto y el mecanismo de acción de la HNK sobre el fotodaño inducido por el ultravioleta A (UVA) en la piel no están claros. Se construyó un modelo de daño foto-envejecimiento de células HDF y piel de ratón sin vello mediante inducción UVA. El impacto de la HNK en la viabilidad de las células HDF normales y las células HDF inducidas por UVA se examinó mediante el ensayo de viabilidad celular. Los niveles de SOD, GSH, CAT y MDA en células HDF se midieron utilizando diferentes kits, y los niveles de ROS se midieron con DCFH-DA y Dihidroetidio. La tinción de SA-β-galactosidasa y TUNEL detectó senescencia y apoptosis en células HDF, y la citometría de flujo evaluó la progresión del ciclo celular. El daño histopatológico en la piel se evaluó mediante tinción patológica. Además, se utilizaron inmunofluorescencia y Western blot para evaluar los niveles de proteínas asociadas a la vía de Ki67, colágeno, metaloproteinasa de la matriz (MMP) y TGF-β1/Smad. El tratamiento con HNK (2,5-10 μM) no tuvo un impacto adverso en la viabilidad normal de las células HDF, pero atenuó el daño celular HDF inducido por UVA, reduciendo el estrés oxidativo y la apoptosis. La radiación UVA indujo la senescencia de las células HDF, provocó la detención de la fase S, la reducción de Ki67, disminuyó el contenido de colágeno y aumentó la expresión de MMP, mientras que la HNK atenuó eficazmente estas anomalías inducidas por la UVA. Además, los rayos UVA causaban arrugas más profundas, disminución del contenido de agua y colágeno, y aumentaba el grosor epitelial en la piel del ratón, mientras que la inyección subcutánea de HNK atenuaba el daño patológico al tejido cutáneo y aumentaba el contenido de agua y colágeno. Además, el HNK activó la vía TGF-β1/Smad, y el inhibidor del TGF-β1 SB431542 afectó el efecto protector del HNK frente al daño foto-envejecimiento en las células HDF. En conclusión, HNK tiene el potencial de ser un fármaco para mitigar el daño por fotoenvejecimiento al reducir la expresión de MMP mediante la activación de la vía TGF-β1/Smad, inhibiendo así el fotoenvejecimiento inducido por UVA en células HDF y piel de ratón.

Introducción

El proceso de envejecimiento cutáneo es intrincado y se divide en dos formas principales: envejecimiento natural y fotoenvejecimiento¹. Los estudios indican que entre un 80% y un 90% del envejecimiento cutáneo es causado por factores exógenos en el entorno (por ejemplo, rayos ultravioleta, contaminación del aire), de los cuales el fotoenvejecimiento inducido por radiación ultravioleta a largo plazo tiene los efectos más^{graves 2,3}. La radiación ultravioleta se divide en UVC, UVB y UVA. Dado que la UVC no puede penetrar la capa de ozono, la investigación actual sobre fotoenvejecimiento se centra en UVA (320-400 nm) y UVB (280-320 nm)^4,5,6. En comparación con la UVB, la UVA tiene menos energía, pero es más penetrante, atravesando la epidermis y llegando profundamente a la dermis, lo que es una causa importante de envejecimiento cutáneo^grave. Estudios previos han demostrado que el daño causado por la irradiación UVB de 57 mJ^{/cm 2} y 20 UVA J/cm² a las células HaCaT es comparable^{de 8}. El fotoenvejecimiento de la piel provoca cambios en la función y estructura de la piel, manifestados específicamente como hundimiento del tejido superficial, profundización de arrugas, pérdida de colágeno y la aparición de un color de piel gris visible a simple vista; En casos graves, pueden aparecer diversas lesiones y tumores benignos y^{precancerosos.} Junto con el aumento de la investigación sobre el envejecimiento y la lucha antienvejecimiento, los riesgos para la salud del fotoenvejecimiento se han convertido en una de las preocupaciones de salud más importantes a nivel mundial. Por ello, es fundamental investigar los procesos fisiopatológicos subyacentes al daño foto-envejecimiento inducido por los rayos UVA, con el objetivo de desarrollar nuevas opciones terapéuticas para su tratamiento.

Extraído de Magnolia officinalis, una hierba medicinal tradicional china, Honokiol (HNK) es un compuesto bioactivo significativo con la fórmula química de C₁₈H_{18O 2}¹¹. HNK presenta diversas actividades farmacológicas, y su grupo hidroxilo fenólico es altamente susceptible a la oxidación y tiene fuertes efectos antioxidantes y de eliminación de radicales^{libres 12}. Además, la HNK tiene efectos farmacológicos antibacterianos, antiinflamatorios, antivirales, antitumorales, antidepresivos, neuroprotectores y antiprematuros de insuficiencia^ovárica 13,14,15,16. Se ha determinado que la HNK oral es esencialmente segura en estudios con animales y clínicos, y no se han identificado efectos adversos^{significativos} 17,18,19. Estudios recientes han encontrado que la HNK previene el cáncer de piel inducido por^{UVB 20} e inhibe la respuesta inflamatoria cutánea inducida por UVB y la hipermetilación^{del ADN 21}, lo que sugiere su posible uso en el tratamiento de afecciones cutáneas. En comparación con los agentes antienvejecimiento foto-envejecientes ampliamente utilizados, incluyendo la vitamina C y el resveratrol, el HNK tiene propiedades distintas y superiores: su estructura lipofílica confiere una mejor permeabilidad transdérmica que la vitamina^{C hidrofílica 22}; y presenta una mayor fotoestabilidad y biodisponibilidad in vivo que el resveratrol²³. Estos hallazgos preclínicos apoyan la idea de que la HNK tiene un potencial traslacional prometedor como candidato seguro y eficaz para productos de cuidado de la piel e intervenciones clínicas contra el fotodaño cutáneo inducido por los radiados ultravioleta. Sin embargo, aún no se ha informado del impacto del tratamiento con HNK en el daño por fotoenvejecimiento cutáneo causado por UVA.

El factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) es una citoquina multifuncional crucial para el crecimiento y desarrollo celular, la reparación y regeneración de tejidos, y el crecimiento y desarrollo de células, tejidos y^{órganos 24,25}. Se ha demostrado que TGF-β1 envía señales a la célula principalmente a través de miembros de la familia de proteínas Smad, lo que conduce a la regulación específica de la transcripción de genes diana aguas abajo. Cuando se activa la señalización TGF-β1, se produce la fosforilación de Smad2 y Smad3^26,27. Estudios recientes han demostrado una fuerte conexión entre la vía TGF-β1/Smad y la fibrosis cutánea y el fotoenvejecimiento ^28,29. Se ha informado que el objetivo mamífero de la rapamicina activa la vía TGF-β1/Smad en los tejidos cutáneos de ratas, lo que a su vez promueve la síntesis de ceramidas, importantes para retener la humedad cutánea y mantener la barrera^{cutánea 30}. Cabe destacar que se ha informado que HNK moduló la vía TGF-β1/Smad en células estrelladas hepáticas, lo que a su vez mejoró la fibrosis^{hepática 31}. Por ello, se establecieron modelos celulares y murinos de lesión por fotoenvejecimiento inducida por UVA, con tratamiento HNK de 2,5–10 μM en células HDF y intervención de HNK de 5 mg/kg o 10 mg/kg en ratones sin pelo, para explorar los efectos de la HNK en el daño por fotoenvejecimiento y su posible papel en la modulación de la vía TGF-β1/Smad. Este estudio tenía como objetivo desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el daño fotográfico cutáneo inducido por UVA.

Protocolo

Todos los experimentos de cultivo celular se realizaron conforme a las directrices institucionales de bioseguridad y bajo condiciones de laboratorio de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). Los experimentos con animales se realizaron tras la aprobación del Comité de Ética Animal del Hospital 988 de la Fuerza Conjunta de Apoyo Logístico del Ejército Popular de Liberación de China (número de aprobación: 2023-089).

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de estricta conformidad con las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg/kg, inyección intraperitoneal). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal durante los procedimientos de alojamiento, tratamiento y muestreo. Los reactivos, productos químicos, equipos y software utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular y procesamiento

1. Cultivar fibroblastos dérmicos humanos (HDF) en un medio de cultivo de fibroblastos. Mantener los cultivos a 37 °C en un ambiente de humedad saturada con un 5% de CO₂.
2. Sustituye el medio de cultivo cada 3 días y el HDF de paso en una proporción de 1:3 cuando está en confluencia.
3. Irradiar HDF con lámparas UVA (espectro de emisión: 320-400 nm) a una dosis de 5 J/^{cm 2}.
4. Repone con medio fresco inmediatamente después de 30 minutos de irradiación UVA. Repite la irradiación UVA una vez al día durante 8 días^{consecutivos y 32}.
5. Tratar la HDF con 2,5, 5, 10, 20 o 40 μM HNK durante 24 o 48 horas en los experimentos de cribado de^{dosis 33}. Tratar la HDF con 2,5, 5 o 10 μM HNK durante 24 horas, seguida de irradiación UVA (5 J/^{cm 2}) en experimentos posteriores.
6. Exponer HDF a 10 μM de HNK durante 4 horas, luego incubar con el inhibidor de 10 μM de TGF-β1 SB431542 durante 24 horas y finalmente irradiar con UVA (5 J/cm²) en el grupo HNK+SB431542.

2. Evaluación de la viabilidad celular

1. Inocular el HDF en placas de cultivo celular de 96 pozos con una densidad de 1×^{10 4} células por pozo.
2. Tras diferentes tratamientos, añadir 10 μL de reactivo de sal tetrazolio soluble al 10% en agua a cada pozo hasta un volumen final de 100 μL por pozo, e incubar las células a 37°C durante 1,5 horas en la oscuridad.
3. Mide los valores OD450 de las células usando un lector de microplacas.

3. Determinación de los niveles de superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA), catalasa (CAT) y glutatión (GSH)

1. Lavar HDF con 1 mL de PBS pre-enfriado (0,01 M, pH 7,4), añadir 200 μL de solución de preparación de muestras SOD (del kit de ensayo SOD) para lisar las celdas sobre hielo durante 15 minutos.
2. Centrifugar el lisado a 8000 × g durante 5 minutos a 4 °C y recoger el sobrenadante como muestra del ensayo.
3. Utiliza un kit de análisis de proteínas BCA (ácido bicinquinínico) para determinar la concentración de proteína del sobrenadante y ajusta la muestra a 50 μg de proteína total en un volumen de 50 μL.
4. Mezclar la muestra de proteína de 50 μg con el tampón de ensayo SOD hasta un volumen final de reacción de 200 μL, incubar la mezcla a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad y luego medir el valor OD450.
5. Toma el mismo sobrenadante de lisato celular usado para el ensayo SOD, mide los niveles de CAT, GSH y MDA usando los respectivos kits de ensayo.

4. Medición de los niveles celulares de ROS

1. Tratar las células HDF con diferentes condiciones, enjuagar dos veces con PBS de 500 μL y mezclar bien con 500 μL de sonda fluorescente de oxígeno reactivo de 10 μM e incubar a 37 °C durante 20 minutos lejos de la luz.
2. Centrifugar a 1000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para recoger las celdas, y luego enjuagar dos veces con 500 μL PBS.
3. Resuspende las células en un medio de cultivo celular de 500 μL y luego analiza la tinción mediante citometría de flujo.
4. Registrar la intensidad de fluorescencia usando software de análisis de citometría de flujo y luego calcular los niveles de ROS basándose en la intensidad de fluorescencia de mayor ROS corresponde a una fluorescencia verde más fuerte.

5. Tinción de β-galactosidasa (SA-β-galactosidasa) asociada a la senescencia

1. Siembra HDF en placas de cultivo celular de 6 pozos con una densidad de 1×^{10 6} células por pozo y cultiva hasta adherirse. Después de diferentes tratamientos, lava HDF una vez con 2 mL de PBS.
2. Añade 1 mL de fijador de tinción de β-galactosidasa a cada pozo e incuba las células a temperatura ambiente con el fijador durante 15 minutos.
3. Lava las células 3 veces con 2 mL de PBS, añade 1 mL de solución de trabajo de tinción a cada pozo y luego incuba a 37°C durante la noche en la oscuridad.
4. Observa y fotografía las células con un microscopio óptico (las células senescentes parecen azules).

6. Ensayo de ciclo celular

1. Sembrar HDF en placas de 6 pozos en 1×10⁶ celdas/pozo; tras diferentes tratamientos, enjuaga las células dos veces con 2 mL de PBS.
2. Centrifugar a 1000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para recoger las células, añadir 1 mL de etanol al 70% (fijador de celdas) y mezclar suavemente pipeteando. Coloca las celdas fijas en un frigorífico de 4°C durante 12 horas.
3. Preparar 500 μL por muestra de solución de tinción celular mezclando yoduro de propidio (PI, concentración final 50 μg/mL) y RNasasa (concentración final 200 μg/mL) en PBS. Exponer las células a 500 μL de solución de tinción e incubar en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos.
4. Evalúa la intensidad de fluorescencia utilizando citometría de flujo. Realizar análisis del ciclo celular utilizando un citómetro de flujo.

7. Tinción de tunel

1. Exponer las células HDF de diferentes grupos de tratamiento a 1 mL de paraformaldehído al 4% e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Añade 1 mL de PBS que contiene 0,3% de Triton X-100 a las células e incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Lava las células dos veces con PBS y luego añade una solución de ensayo TUNEL de 500 μL en gota a gota para cubrir uniformemente las celdas. Incubar a 37°C en la oscuridad durante 1,5 horas.
4. Añade 200 μL de solución de tinción DAPI para cubrir las células e incuba alejado de la luz durante 10 minutos a 25 °C.
5. Sella las células con un medio de montaje para preservar la señal de fluorescencia, luego obsérvalas y fotografías con un microscopio de fluorescencia (las células TUNEL-positivas muestran fluorescencia verde).

8. Tinción por inmunofluorescencia

1. Sembra células HDF de diferentes grupos de tratamiento en placas de 12 pozos. Una vez que la densidad celular alcanza el 50%-60%, expone las células a 1 mL de paraformaldehído al 4% e incuba a temperatura ambiente durante 25 minutos.
2. Añade 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en gota para bloquear la superficie celular y incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Añadir 500 μL de anticuerpos primarios Ki67 (1:300), colágeno I (1:100), metaloproteinasa matricial (MMP)-1 (1:50) o MMP-3 (1:100) gota a gota, e incubar a 4°C durante la noche.
4. Al día siguiente, incubar las células con 500 μL de anticuerpo secundario marcado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (1:100) a 37°C alejado de la luz durante 1 hora.
5. Añade 200 μL de solución de tinción DAPI para cubrir las células, incuba alejada de la luz durante 10 minutos, observa con un microscopio de fluorescencia y analiza con software de análisis de imágenes (las células positivas para colágeno I y MMP-1 muestran fluorescencia roja, las células positivas en Ki67 y MMP-3 muestran fluorescencia verde).

9. ELISA

1. Añadir 100 μL de sobrenadante de cultivo celular HDF a pozos de placas de kit MMP-1 o MMP-3, e incubar a 37°C durante 2 horas.
2. Lava los pozos 3 veces con 200 μL de PBS, luego añade 100 μL del anticuerpo correspondiente a cada pozo e incuba a 37 °C en la oscuridad durante 1 hora.
3. Enjuaga los pozos 3 veces con 200 μL de tampón de lavado (proporcionado en el kit), sacude el exceso de solución e incuba las muestras con 100 μL de estreptavidina-HRP durante 30 minutos a 37°C en la oscuridad.
4. Después de enjuagar con PBS, añade 100 μL de sustratos A y B según las instrucciones del kit y incuba a 37°C en la oscuridad durante 10 minutos.
5. Añade 50 μL de solución de terminación, mezcla bien, evalúa el valor de OD₄₅₀ usando un lector de microplacas y calcula la concentración.

10. Construcción de modelos de ratones por envejecimiento fotográfico

1. Hembras de ratón SKH1 de grado SPF doméstico (15-20 g, 4-5 semanas) a 22 °C con un 55%-60% de humedad y permiten acceso autónomo a la comida y al agua. Desinfecta regularmente las instalaciones, incluyendo recipientes de comida, botellas de agua y alborones para beber.
2. Asignar aleatoriamente los ratones al grupo de control (n=6) y al grupo modelo (n=18). Ratones del grupo modelo irradiado con UVA a 0,35 J/^{cm 2} durante 8 semanas³⁴; ratones del grupo de control en el mismo entorno sin irradiación UVA.
3. Divide los ratones del grupo modelo por igual en 3 subgrupos (n=6 cada uno).
4. Administrar inyecciones subcutáneas de HNK a 5 mg/kg o 10 mg/kg en un volumen de 100 μL dos veces por semana a dos subgrupos durante la irradiación UVA (registrados como grupo HNK de 5 mg/kg y grupo HNK de 10 mg/kg, respectivamente). Administrar inyecciones subcutáneas de 100 μL de suero fisiológico dos veces por semana al tercer subgrupo durante la irradiación UVA (registrado como grupo UVA).
5. Evalúa la formación de arrugas en la piel y el contenido de agua tras modelar con éxito³⁵.
6. Eutanasia a ratones con pentobarbital sódico (100 mg/kg) intraperitonealmente y luego recoge tejidos cutáneos dorsales para experimentos posteriores.

11. Medición del contenido de colágeno I de la piel

1. Recoge 50 mg de tejidos cutáneos dorsales de ratón, molédelos bien en nitrógeno líquido y lisa con 500 μL de tampón de lisis RIPA preenfriado durante 30 minutos sobre hielo.
2. Centrifuga el lisato a 8000 × g durante 5 minutos a 4 °C, recoge el sobrenadante y mide el contenido de colágeno usando un kit de ensayo de péptidos pro-colágeno I C según las instrucciones del fabricante.

12. Tinción de hematoxilina y eosina (HE)

1. Fijar tejidos de piel de ratón en 10 mL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 24 horas, deshidratar en etanol degradado (50%, 75%, 95%, 100%, cada uno durante 5 minutos), infiltrar en parafina y seccionar en rodajas de 4 μm.
2. Hornea las rodajas a 65°C durante 8 horas, deparafina en xileno dos veces durante 10 minutos cada una y rehidrata en etanol gradiente a temperatura ambiente.
3. Tinta las rodajas con solución de hematoxilina durante 8 minutos, enjuaga con agua del grifo corriente durante 1 minuto, diferencia con solución diferenciadora durante 30 segundos y tiñe con eosina durante 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Deshidrata las rodajas teñidas en etanol degradado, transparente en xileno, sella con un medio de montaje y obsérvese bajo un microscopio (el núcleo celular aparece de color azul-púrpura, mientras que el citoplasma, las fibras de colágeno y los eritrocitos aparecen de color rosa en distintos grados).

13. Tinción de masson

1. Tinte secciones de parafina de los tejidos de la piel del ratón usando el kit de tinción tricromo^{Masson 36}. Deparafiniza las secciones de parafina en xileno dos veces durante 10 minutos cada una, añade la solución de tinción de hematoxilina con hierro Weigert y teñe durante 10 minutos.
2. Diferencia con solución de diferenciación de etanol ácido durante 30 segundos, enjuaga con agua del grifo corriente durante 5 minutos y luego tiñe con la solución de tinción Ponceau-fucisina gota a gota durante 10 minutos a temperatura ambiente. Realiza el azulado inverso con la solución azul de Masson y luego enjuaga con agua destilada durante 1 minuto.
3. Preparar una solución de trabajo ácida débil en una proporción de agua destilada: solución ácida débil (incluida en el kit) = 2:1; Añade 1 mL de solución ácida débil de trabajo en gota y lava durante 30 s a temperatura ambiente.
4. Vierte el exceso de líquido, añade 1 mL de solución de ácido fosfomolíbdico gota a gota y trata durante 2 minutos a temperatura ambiente. Añade 1 mL de la solución ácida débil de trabajo en gota y luego lava durante 30 segundos.
5. Vierte el exceso de líquido, añade 1 mL de solución teñidora de azul anilina en gota y tiñe durante 1 minuto. Añade 1 mL de solución ácida débil de trabajo en gota y lava durante 30 segundos.
6. Deshidrata rápido en etanol al 95% durante 2 segundos. Deshidrata en etanol absoluto dos veces, 10 segundos cada vez.
7. Después de secarlo, limpia las secciones con xileno y monta con goma neutra. Observa la distribución de las fibras de colágeno en cada grupo bajo un microscopio (las fibras de colágeno aparecen azules, mientras que las fibras musculares, citoplasmas y eritrocitos son de un rojo brillante, y los núcleos celulares se ven claramente azul-negro).

14. Medición de los niveles de ROS en tejido cutáneo

1. Toma secciones congeladas de tejido de piel de ratón (preparadas en menos de 1 hora tras la excisión), extiende 1 mL de solución limpiadora en gota sobre toda la superficie de la sección y déjala reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2. Sacude la solución de lavado, luego añade 1 mL de sonda de osígeno reactivo de 10 μM en la gota, para cubrir uniformemente las secciones; incuba a 37 °C lejos de la luz durante 30 minutos.
3. Enjuaga las secciones dos veces con PBS, añade engomas de cobertura y observa usando un microscopio de fluorescencia (las zonas ROS-positivas presentan fluorescencia roja; cuanto menor sea el nivel de ROS, más débil será la señal de fluorescencia roja).

15. Pruebas de indicadores bioquímicos

1. Recoge suero para ratones y prepara los reactivos de detección según las instrucciones de los kits de ensayo correspondientes.
2. Mide las actividades de la aspartato transaminasa (AST) y la alanina transaminasa (ALT) en el suero de ratón utilizando los respectivos kits.
3. Determina los niveles de urea, nitrógeno en sangre (BUN) y creatinina (CRE) en el suero para ratones utilizando los kits correspondientes.

16. Western blot

1. Recoger 50 mg de tejido o 1×10⁶ células, lisar las muestras sobre hielo durante 30 minutos utilizando un tampón de lisis RIPA de 200 μL para obtener proteínas.
2. Centrifugar a 8000 × g durante 5 minutos a 4 °C y recoger el sobrenadante. Evalúa el contenido de proteínas en células y tejidos utilizando el kit de ensayo de concentración de proteínas de BCA.
3. Realizar electroforesis de proteínas de muestra en gel SDS-PAGE al 12%, y transferir proteínas separadas a membranas PVDF a 4 °C.
4. Bloquea las membranas PVDF con un 5% de BSA durante 3 horas a temperatura ambiente. Enjuaga las membranas con TBST (contiene 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl y 0,1% Tween-20) 3 veces, luego incuba durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), colágeno I (1:1000), ciclina A2 (1:500), quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) o p-Smad3 (1:1000).
5. El segundo día, lava las membranas con TBST 3 veces y luego incuba con 1 mL de IgG anticonejo de cabra (1:10000) a temperatura ambiente durante 2 horas. Aplica 500 μL del reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) de forma uniforme sobre las membranas, luego escanealas usando un sistema de imagen en gel.
6. Realiza análisis de valores grises utilizando software de análisis de imágenes. Expresa el nivel de expresión relativo como la relación entre su valor gris y el de GAPDH.

17. Análisis estadístico

1. Para ensayos celulares in vitro , todos los experimentos se repiten de forma independiente tres veces (n=3, réplicas biológicas).
2. Para experimentos in vivo con animales, se incluyen 6 ratones por grupo (n=6), lo que cumple con los principios 3R para el bienestar y la ética de animales de laboratorio.
3. Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Realizar análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico. La normalidad de los datos se probó utilizando la prueba de Shapiro-Wilk.
4. Para datos distribuidos normalmente, se utiliza ANOVA unidireccional para la comparación multigrupo, seguida de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones por pares entre grupos. Para datos no distribuidos normalmente, se aplica la prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica. P< 0,05 indica una diferencia significativa.
5. Genera gráficos usando software de grafos.

Resultados

HNK alivia el daño por estrés oxidativo en las células HDF causado por UVA
Los impactos de las distintas concentraciones de tratamiento con HNK durante 24 horas o 48 horas sobre la viabilidad de las células HDF fueron examinados mediante un ensayo de viabilidad celular para determinar la concentración y duración adecuadas del tratamiento. Los resultados mostraron que 2,5, 5 y 10 μM de HNK no afectaron significativamente la viabilidad de las células HDF normales tras 2...

Discusión

La luz ultravioleta es un factor ambiental que perjudica a las células y a los organismos. Estudios previos han informado que los rayos UVA, con su alta potencia de penetración, son el principal tipo de luz ultravioleta que llega a la superficie terrestre³⁸. Los fibroblastos son células funcionales importantes en la dermis, y su envejecimiento puede causar directa o indirectamente el envejecimiento de la piel³⁹. El daño por fotoenvejecimien...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de actividad ALT	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	P2711M	Kit de detección de actividad de la transaminasa alanina
Kit de ensayo CRE Amplex Red	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0291S	Kit de detección de creatinina
Medio de montaje anti-Fade	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	P0126	Medio de montaje para preservación de señales de fluorescencia
Kit de ensayo de actividad AST	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	P2715S	Kit de detección de actividad de la transaminasa de aspartato
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	P0012	Kit de determinación de concentración de proteínas
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	V900933	Reactivo bloqueador para la unión no específica
Kit de ensayo BUN	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0574S	Kit de detección de nitrógeno con urea en sangre
Kit de ensayo CAT	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0051	Kit de detección de actividad de la catalasa
Reactivo CCK-8	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	96992	Solución de ensayo de viabilidad celular, que es una sal de tetrazolio soluble en agua
Anticuerpo CDK2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA5-79024	anticuerpo principal para la detección de CDK2
Agente quimioluminiscente ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-K1005	Reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorado
Anticuerpo de colágeno I	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA1-26204	anticuerpo primario para la detección de colágeno I
Anticuerpo de ciclina A2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA5-34682	anticuerpo primario para la detección de ciclina A2
Solución de tinción DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	D9542	Tinte de tinción nuclear
Sonda fluorescente DCFH-DA	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-D0940	Sonda fluorescente de especies reactivas de oxígeno
Solución de diferenciación	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	C0161s	Reactivo para el paso de diferenciación de hematoxilina
Sonda de dihidroetidio	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0063	Sonda de especies reactivas de oxígeno
Medio de cultivo de fibroblastos	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	Medio de cultivo completo para el crecimiento de fibroblastos
IgG anticonejo de cabras etiquetado con FITC	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	F-2765	Anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Citometría de flujo	BD en biociencias, San José, CA, EE. UU.	BD FACSCaliburTM	Citómetro de flujo
Software FlowJo	BD en biociencias, San José, CA, EE. UU.	v10.8	Software de análisis de citometría de flujo
Microscopio de fluorescencia	Leica, Heidelberg, Alemania	DM IL LED	microscopio para imagen de fluorescencia
Anticuerpo GAPDH	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA1-987	Anticuerpo de control interno para la normalización de proteínas
Sistema de imagen en gel	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	iBright CL1500	Sistema de imagen para la detección de proteínas
cabra anti-conejo IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	31460	Anticuerpo secundario para inmunodetección
Software Graphpad Prism 9.0	GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.	Prism 9.0	Software de grafografía
Kit de ensayo GSH	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0053	Kit de detección de contenido de glutatión
Kit de tinción HE	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	C0105S	Kit de tinción histológica para análisis morfológico tisular
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-N0003	Honokiol, compuesto bioactivo
Fibroblastos dérmicos humanos	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	Células primarias de fibroblastos de la piel humana
Software IBM SPSS Statistics 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, EE. UU.	IBM SPSS Estadísticas 26.0	Software de análisis estadístico
Software ImageJ	Wayne Rasband, Instituto Nacional de Salud Mental, EE. UU.	Versión 1.54H	Software de análisis de imágenes
Anticuerpo Ki67	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	MA5-14520	Anticuerpo primario para la detección de marcadores de proliferación celular
Microscopio óptico	Leica, Heidelberg, Alemania	DM3000	Microscopio óptico para imagen en campo claro
Kit de tinción tricromo Masson	Solarbio, Pekín, China	G1340	Kit de tinción de colágeno y tejido conectivo
Kit de ensayo MDA	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0131S	Kit de detección de niveles de malondialdehído (marcador de peroxidación lipídica)
Lector de microplacas	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	1410101	Instrumento de medición de absorbancia para ensayos basados en células
Anticuerpo MMP-1	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA5-27210	Anticuerpo primario para la detección de la metaloproteinasa-1 de la matriz
Kit MMP-1 ELISA	Biotecnología vinculada a enzimas, Shanghái, China	ml038199	detección cuantitativa de MMP-1 en muestras biológicas
Anticuerpo MMP-3	Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.	ab52915	Anticuerpo primario para la detección de la metaloproteinasa matricial-3
Kit MMP-3 ELISA	Biotecnología vinculada a enzimas, Shanghái, China	ml105322	detección cuantitativa de MMP-3 en muestras biológicas
Goma neutra	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	C0173	Medio de montaje
Anticuerpo P16	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	PA5-20379	Anticuerpo principal para la detección de proteínas P16
Anticuerpo P21	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	MA5-14949	Anticuerpo principal para la detección de proteínas P21
Anticuerpo P53	Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.	ab131442	Anticuerpo primario para la detección de proteínas P53
paraformaldehído	Solarbio, Pekín, China	P1110	Reactivo de fijación celular y tejido
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	ST512	Yoduro de propidio para la tinción de ADN en el análisis del ciclo celular
Kit de ensayo peptídico pro-colágeno I C	TAKARA, Tokio, Japón	MK101	Kit de detección de síntesis de colágeno
Anticuerpo p-Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	44-244G	anticuerpo primario para la detección de Smad2 fosforilado
Anticuerpo p-Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	44-246G	anticuerpo primario para la detección de Smad3 fosforilado
Membranas PVDF	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	88520	Membrana de transferencia de proteínas para Western Blot
Búfer de lisis RIPA	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	P0013B	Amortiguador de extracción de proteínas para lisados celulares y tisulares
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	ST579	ribonucleasa para la eliminación de ARN durante la tinción de ADN
Kit de tinción SA-β-galactosidasa	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	C0602	Kit de detección de senescencia celular
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-10431	TGF-& beta; 1 Inhibidor de la vía de señalización
Geles SDS-PAGE	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	WG1403BX10	Geles de poliacrilamida para electroforesis de proteínas
Ratones sin pelo SKH1	Vitalriver, Pekín, China		Modelo animal para estudios de fotoenvejecimiento cutáneo
Anticuerpo Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	51-1300	anticuerpo primario para la detección de Smad2
Anticuerpo Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	51-1500	anticuerpo primario para la detección de Smad3
Kit de ensayo SOD	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	S0101S	Kit de detección de actividad de dismutasa por superóxido
TGF-& beta; 1 Anticuerpo	Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.	ab215715	anticuerpo primario para TGF-y beta; 1 Detección
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	X-100	detergente no iónico para permeabilización de membranas celulares
Solución de ensayo TUNEL	Beyotime Biotechnology, Shanghái, China	C1086	reactivo para detección de apoptosis para la fragmentación del ADN
Xileno	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	247642	disolvente orgánico para la deparafinización tisular