La regulación a la baja de LINC00426 promueve la progresión de la enfermedad renal diabética (DKD) induciendo la apoptosis en las células renales y aumentando la inflamación.
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Artículo de investigación
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La regulación a la baja de LINC00426 promueve la progresión de la enfermedad renal diabética (DKD) induciendo la apoptosis en las células renales y aumentando la inflamación.
El estudio investiga el valor diagnóstico de la LINC00426 en la diabetes tipo 2 (DT2) y la enfermedad renal diabética (DKD), así como sus efectos reguladores sobre las células renales. El estudio incluyó a 280 pacientes con DM 2 (146 casos de DKD) y 186 controles sanos que visitaron durante el mismo periodo. La reacción en cadena cuantitativa en tiempo real de la polimerasa por transcripción inversa (RT-qPCR) confirmó que el LINC00426 sérico está regulado a la baja en pacientes con DM2 y DKD. El análisis de características de funcionamiento del receptor (ROC) evaluó el valor diagnóstico de LINC00426 para T2DM y DKD. La regresión logística multivariante identificó factores de riesgo independientes para la DKD. LINC00426 mostró valor diagnóstico para ambas enfermedades y se correlacionó negativamente con la relación albúmina a creatinina de orina (UACR). Su regulación a la baja predijo de forma independiente el desarrollo de DKD. Un entorno de alta glucosa (HG) inhibe la expresión de LINC00426 en las células HK-2 y HGMC. El ensayo CCK8, la citometría de flujo y los ensayos inmunoenzimáticos vinculados a enzimas confirmaron que la HG también suprimía la proliferación mientras promovía la apoptosis y la inflamación. En cambio, la sobreexpresión de LINC00426 aumenta la capacidad proliferativa de las células HK-2 y HGMC, inhibe la apoptosis y reduce las respuestas inflamatorias. La regulación a la baja de LINC00426 puede agravar la progresión de la DKD al inhibir la proliferación de células renales (HK-2 y HGMC) y promover la apoptosis y las respuestas inflamatorias.
La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) es un trastorno metabólicocrónico 1. Los informes indican que la diabetes tipo 2 y sus complicaciones se han convertido en una preocupación significativa de salud públicaglobal, suponiendo amenazas para la salud humana y el desarrollo social. Debido a hábitos de vida poco saludables adquiridos conel tiempo 4, la prevalencia de la diabetes tipo 2 ha ido aumentandoanualmente 5. La nefropatía diabética (DN) fue renombrada como enfermedad renal diabética (DKD) en 2007 6,7. Como complicación común delDT2DM 8, su incidencia y mortalidad entre pacientes diabéticos continúan aumentandoanualmente 9. La DK suele permanecer latente en pacientes con diabetescrónica o manifestarse de formaabrupta 11. La DKD puede causar disfunción renal y dañoendotelial 12,13. La DKD se manifiesta principalmente como la pérdida urinaria de moléculas grandes, como proteínas, tras un daño en el sistema de filtración renal 14. Sin embargo, para los pacientes, los marcadores bioquímicos en sangre (glucosa en ayunas, insulina) son el estándar de oro para diagnosticar la diabetes tipo 2, aunque la DKD sigue siendo difícil de detectar. Los enfoques de tratamiento convencionales no logran identificar ni evaluar de forma rápida la progresión de laDKD 15. Por ello, aumentar la conciencia sobre la enfermedad e identificar nuevos biomarcadores diagnósticos es crucial para la prevención y el tratamiento tanto del DT2 como de la DKD.
En los últimos años, la implicación del ARN largo no codificante (lncRNA) en diversas funciones como la inmunidad16, la regulación del cáncer y el metabolismo se ha vuelto cada vez más reconocida17. La acumulación de evidencia ahora implica una expresión desregulada de ARNnc en la patogénesis de enfermedades crónicas complejas, especialmenteDKD 18,19. Por ejemplo, Zhang et al.20 identificaron mediante secuenciación de alto rendimiento que el ARNncRNA EVF-2 interactúa con hnRNP, promoviendo el desarrollo de DKD al mejorar la expresión de genes relacionados con el ciclo celular y factores inflamatorios. En un modelo de rata DKD, se identificó USR0000B2476D de ARNlnc como implicada en la regulacióninmune 21. LINC00426 es un ARNnc recién descubierto que desempeña un papel importante en la regulación de factoresinflamatorios 22. Estudios comparativos recientes de microarrays sugieren que LINC00426 podría tener potencial como biomarcador para el desarrollo de laDM2 23. Además, las estrategias bioinformáticas han captado la implicación de LINC00426 en la regulación inmunitaria dentro del carcinoma de célulasrenales 24. Numerosos estudios también han destacado la implicación fundamental de la inflamación en la diabetes y elDKD 25 en la diabetes y el DKD. Estudios existentes han demostrado que el diabetes tipo26 y las condiciones relacionadas con laprediabetes 27, incluyendo el síndrome metabólico28, la obesidad29 y la cardiopatología metabólicacardiovascular 30, están todas asociadas a una alta carga inflamatoria. Además, las complicaciones microvasculares diabéticas, como la neuropatía31, la nefropatía32 y laretinopatía 33, así como las complicaciones macrovasculares34, son todas respuestas inflamatorias crónicas. Por lo tanto, estudiar la relación entre LINC00426 y DT2 y DKD es muy importante para descubrir nuevos marcadores diagnósticos y revelar los mecanismos de la DKD. No obstante, la literatura actual sobre el papel de la LINC00426 en TD2M y DKD sigue siendo limitada, sin evidencia clínica que aclare su patrón de expresión, valor de riesgo independiente y eficacia diagnóstica en pacientes con DKD.
Para cubrir esta carencia de investigación, el presente estudio incluyó a 466 participantes, detectó la expresión de LINC00426 sérica mediante RT-qPCR, identificó factores de riesgo independientes para la DKD mediante regresión logística y evaluó además el potencial diagnóstico de LINC00426 para la DMT2 y la DKD mediante análisis ROC. Nuestros hallazgos aclaran preliminarmente las características de expresión y la importancia clínica de la LINC00426 en DKD, cubriendo así la brecha de conocimiento existente y proporcionando nuevas perspectivas sobre la patogénesis de DKD y la exploración de biomarcadores.
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Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética Médica del Tercer Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur. Todos los pacientes y sus familias expresaron su apoyo y firmaron formularios escritos de consentimiento informado.
Recogida de muestras
El tamaño de la muestra se calculó usando el software G*Power. El nivel de significación (α) se estableció en 0,05, la potencia estadística (1-β) en 0,8, el tamaño del efecto (f) en 0,25 y se consideró una tasa de abandono del 10%. Los resultados del cálculo indicaron que se requerían al menos 123 participantes por grupo al estudiar las poblaciones de grupo, DM2 y DCD. En el estudio real, se incluyeron 186 participantes en el grupo control, 134 pacientes en el grupo con diabetes tipo 2 y 146 en el grupo con enfermedad de la muerte. Todos fueron voluntarios que recibieron tratamiento en el Third Xiangya Hospital de la Universidad Central South desde julio de 2022 hasta junio de 2023. De estos, 72 pacientes no presentaron complicaciones, mientras que 208 pacientes presentaron una o más complicaciones. Las complicaciones incluyeron principalmente neuropatía diabética, retinopatía diabética y enfermedad renal diabética (DKD), con 146 pacientes diagnosticados con DKD. La clasificación de la diabetes se determinó en función de la insulina en ayunas y los niveles de glucosa en sangre en ayunas; Se excluyeron a los pacientes con diabetes tipo 1 para evitar ambigüedades diagnósticas. Se excluyeron casos de diabetes gestacional y condiciones especiales de diabetes.
Los criterios de inclusión fueron los siguientes: Edad ≥ 18 años; registros médicos completos y documentación disponibles; cumplimiento de las Directrices chinas de 2020 para la Prevención y Tratamiento de la Diabetes Tipo2 37. Los criterios de exclusión incluían trastornos psiquiátricos comórbidos, deterioro cognitivo o incapacidad para cooperar con el estudio; condiciones infecciosas agudas; insuficiencia orgánica; y tumores malignos.
Se seleccionó un grupo de control de 186 personas sanas que se sometieron a exámenes médicos rutinarios durante el mismo periodo. Los participantes del grupo de control deben cumplir los siguientes criterios: no tener antecedentes de diabetes u otros trastornos metabólicos; glucosa en ayunas normal (<6,1 mmol/L), glucosa postprandial de 2 horas (<7,8 mmol/L) y hemoglobina glicada (<5,7%); y sin antecedentes de enfermedad renal ni complicaciones, con indicadores de función renal normales (tasa de filtración glomerular, ratio albúmina urinaria/creatinina).
Pruebas indicadoras relacionadas con la diabetes
Se registró información demográfica básica para cada participante al momento de su admisión. A la mañana siguiente, se recogieron 5 mL de sangre venosa de cada sujeto en estado de ayuno para analizar indicadores bioquímicos. Los niveles de glucosa en ayunas (FBG) se analizaron utilizando un medidor de glucosa35. La hemoglobina glicada (HbA1c) se midió con un analizador HbA1c totalmenteautomatizado 36. Se recogieron muestras de orina en un plazo de 24 horas desde la inclusión del estudio. La concentración de albúmina urinaria se midió utilizando un analizador de proteínas37 mediante el método inmunoturbidimétrico38. El grado de insuficiencia renal en pacientes con DKD se evaluó mediante la proporción albúmina urinaria-creatinina (UACR), un índice bien establecido para evaluar la lesión renal temprana y la progresión de la enfermedad enDKD 3,39.
Cultivo celular y procesamiento
Se adquirieron células epiteliales renales humanas HK-2 y células mesangiales glomerulares HGMC. Específicamente, las células HK-2 se cultivaron en un medio K-SFM que contenía un 10% de suero bovino fetal, suplementado con una solución antibiótica al 1%. Las células HGMC se cultivaron en un medio celular primario completo. Las células se mantuvieron en una incubadora de 37 °C y 5% de CO2 . El pasaje y la transfección se realizaron cuando la confluencia superó el 70%. Para la inducción de glucosa alta (HG), las células se sembraron en placas de 6 pozos y se expusieron a 30 mM de D-glucosa en 2 mL de medio de cultivo por pozo durante 48 horas (HK-240 y células HGMC41). Un grupo control con baja glucosa fue tratado con 5,5 mM de D-glucosa + 24,5 mM manitol.
La secuencia completa de LINC00426 fue clonada en el plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1 para construir el plásmido de sobreexpresión pcDNA3.1 LINC00426. El vector vacío pcDNA3.1 se utilizó como control negativo. La transfección celular se realizó utilizando el reactivo Lipofectamina 3000 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células HK-2 y HGMC inducidas por HG se sembraron en placas de 6 pozos y se transfectaron con una confluencia del 70%–80%. Para cada pozo, se mezclaron 2,5 μg de ADN plasmídico (pcDNA 3.1 o pcDNA 3.1 LINC00426) con 5 μL de reactivo de Lipofectamina 3000 en Opti-MEM de 250 μL durante 15 minutos a temperatura ambiente, según investigacionesprevias 10. El complejo de transfección se añadió luego gota a las células en un medio de cultivo completo. Tras 6 horas de incubación a 37 °C, el medio fue reemplazado por un medio fresco y las células se cultivaron durante 42 horas adicionales antes de los experimentos posteriores.
Extracción total de ARN y transcripción inversa
La sangre restante se centrifugó de nuevo a 3000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se recogió y almacenó a -80 °C. El ARN total se extrajo de muestras de suero y célula utilizando el método Trizol-fenol-cloroformo, precipitado con etanol de igual volumen según investigacionesprevias 42. La concentración y pureza de ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro UV. ADNc total se sintetizó a partir de muestras utilizando la mezcla de reactivos RT mediante un amplificador de PCR génica. Las condiciones de reacción fueron de 42 °C durante 15 minutos, seguidas de 85 °C durante 5 segundos. Las muestras se almacenaron brevemente a 4 °C.
Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real por transcripción inversa (RT-qPCR)
La RT-qPCR se realizaba utilizando mezcla maestra SYBR qPCR. La expresión de LINC00426 sérico se cuantificó mediante el instrumento cuantitativo de PCR. Los datos se normalizaron usando β-tubulina como gen de referencia interno, calculados mediante el método 2−ΔΔCt . El valor medio de β-tubulina fue aproximadamente 25, oscilando entre 23 y 27 en todas las muestras de suero. El coeficiente de variación (CV) de Ct fue del 2,5%. La ANOVA unidireccional no mostró diferencias significativas en los valores de β-tubulina Ct entre los grupos control, T2DM y DKD, lo que confirma su expresión estable y su idoneidad como referencia interna para la normalización de LINC00426 sérica. Los cebadores implicados en la reacción se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. Condiciones de reacción: pre-desnaturalización a 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s; extensión final a 60 °C durante 15 s.
Análisis de Western blot
El análisis Western blot se realizó siguiendo nuestros protocolos experimentales establecidos. Brevemente, las células se lisaron con buffer de lisis RIPA suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa al 1%. Tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se realizó la cuantificación de proteínas. Las muestras de proteína se desnaturalizaron a 95 °C, y se separaron cantidades iguales de 30 μg de proteína mediante SDS-PAGE, seguidas de electrotransferencia sobre membranas PVDF de 0,45 μm. Las membranas se bloquearon con leche desnatada a temperatura ambiente durante 2 horas. Los anticuerpos primarios contra Bax, Bcl-2, Caspasa-3, IκBα y p-P65 se diluyeron a 1:1000 con TBST, mientras que la β-actina se diluyó a 1:3000. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante correspondientes a temperatura ambiente durante 1 hora. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato ECL en un sistema de imagen en gel. Los valores de gris de banda se cuantificaron con el software ImageJ.
Kit de Conteo de Celdas-8 (CCK8)
Digiera las células transfectadas con tripsina al 0,25% (sin EDTA) durante aproximadamente 3 minutos, luego centrifuga a 800 x g durante 5 minutos. Recoge el pellet y vuelve a suspenderlo en un medio de cultivo celular. Sembra 100 μL de suspensión de celdas (2 x 103 celdas) en una placa de 96 pozos. Tras la incubación durante 24 horas a 37 °C con 5% deCO2 para permitir la adherencia celular, se añaden 10 μL de solución de CCK8. La adición inicial de la solución CCK8 se designa como 0 h. La absorbancia a 450 nm se mide usando un lector de microplacas en 0, 24, 48 y 72 horas.
Citometría de flujo
El efecto de la transfección sobre la apoptosis celular se evaluó utilizando la solución de tinción de isotiocianato de Annexin V-fluoresceína (FITC)/yoduro de propidio (PI). Tras la transfección, las células se digerían utilizando el mismo procedimiento de digestión de tripsina descrito anteriormente. Las células fueron lavadas con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) y resuspendidas. Los pellets de celda se recogieron por centrifugación a 800 x g durante 5 minutos. Transfiere 100 μL (aproximadamente 1 x 105 celdas) a un tubo de citometría de flujo, centrifuga a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y descarta el sobrenadante. Suspender las células en un tampón de unión Annexin V-FITC de 195 μL. Añade 5 μL de Annexin V-FITC y 10 μL de solución de tinción PI a la mezcla, luego mezcla bien. Incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, se coloca el tubo de citometría de flujo tratado en un baño de hielo para almacenamiento temporal. Antes del análisis, filtra la suspensión de la celda mediante un filtro de malla de 200 micras y vuelve a suspenderla. Recoge señales celulares utilizando el sistema de citometría de flujo bajo excitación a 488 nm/636 nm.
Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)
Las citocinas inflamatorias celulares se midieron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente para el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) y IL-1 beta (IL-1β). El procedimiento específico de detección es el siguiente: añadir 100 μL del estándar diluido adecuadamente a los pozos estándar. Añadir 100 μL de medio basal cel·lar a todos los pozos en blanco. Añadir 50 μL de sobrenadante celda y 50 μL de 1 x tampón de detección a los pozos de muestra. Posteriormente, se añade 50 μL de la solución de anticuerpos de detección a los pozos correspondientes. Cubre la microplaca e incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Descarta el líquido de los pozos y lava 6 veces con un buffer de lavado. Para lograr resultados óptimos, asegúrate de que los pozos estén completamente secados. Añade 100 μL de solución de trabajo de estreptavidina a cada pozo de nuevo, sella la placa e incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos. Finalmente, añade 100 μL de sustrato cromogénico y luego incubalos en la oscuridad durante 20 minutos. Luego añade 100 μL de solución de parada y mezcla suavemente. La solución ahora aparecerá como un líquido claro y amarillento de intensidad variable. Mide la densidad óptica (OD) de la solución a 450 nm y 630 nm usando un lector de microplacas. La diferencia entre estos dos valores corresponde a la concentración del factor inflamatorio en la muestra.
Análisis estadístico
Los datos se procesaban y analizaban utilizando software estadístico comercialmente disponible. Todos los resultados experimentales comprendieron tres réplicas válidas. Las comparaciones intergrupales emplearon muestras independientes, pruebas t y análisis de varianza (ANOVA). Se realizaron comparaciones múltiples utilizando el método de Tukey. La curva ROC se utilizó para evaluar el valor diagnóstico de LINC00426 para la DM 2 y la DKD. El análisis de regresión logística evaluó los factores de riesgo para la DKD. P < 0,05 indicaron significación estadística para los resultados de los datos respectivos.
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Comparación de las características basales entre individuos sanos y pacientes con diabetes tipo 2
El estudio incluyó a 280 pacientes con diabetes tipo 2 y 186 individuos sanos como controles. El análisis de los historiales médicos de los participantes (véase Tabla 1) reveló que la edad media del grupo control era de 58,91 ± 17,63 años, en comparación con 59,50 ± 17,14 años de los pacientes con diabetes tipo 2. Sin embargo, no hubo diferencias signific...
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La DKD representa una complicación microvascular grave en la diabetes tipo 2. Su manifestación más temprana es la presencia de microalbuminuria; detectar esto en las primeras etapas podría retrasar potencialmente la progresión de la DKD. Sin embargo, la microalbuminuria carece de sensibilidad en el análisis rutinario de orina y, por tanto, se pasa por altocon frecuencia 43. Este estudio encontró que el LINC00426 está regulado a la baja en pacientes con DM2 y posee...
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No hay conflicto de intereses en este estudio.
No es aplicable.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200056 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | Beyotime | C1062S | |
| Antibiotics for cell culture | Gibco | R-015-10 | |
| Aristo specific protein detector | GOLDSITE | GPP-100 | |
| Bax Antibody | Cell signaling Technology | 2772 | |
| BCA protein assay kit | Beyotime | P0013B | |
| Bcl-2 (124) Mouse Monoclonal Antibody | Cell signaling Technology | 15071 | |
| beta-Actin (13E5) Rabbit Monoclonal Antibody | Cell signaling Technology | 4970 | |
| Blood glucose monitor | Yuwell | 710 | |
| Caspase-3 Antibody | Cell signaling Technology | 9662 | |
| CCK-8 reagent | Sigma | 96992 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| Constant-temperature cell incubator | SaiLun | DHP-9032 | |
| D-Glucose | MedChemExpress | HY-B0389 | |
| Flow cytometer | Beckman coulted | CytoFLEX | Chloroform |
| Fluorescent quantitative PCR instrument | Roche | Light Cycler 96 | |
| Foetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0193 | |
| Fully automated glycated haemoglobin analyser | Hanyu medical | HLC-723G11 | Phenol |
| Gene PCR amplifier | Bio Rad | S1000 | |
| Glomerular mesangial cells, HGMC | Sunncell Biotechnology Co., Ltd. | SNP-H252 | |
| Human Basic IL-1 beta ELISA Kit | Invitrogen | ECH002 | |
| Human IL-6 ELISA Kit | Invitrogen | EH2IL6 | |
| Human kidney epithelial cells, HK-2 | Sunncell Biotechnology Co., Ltd. | SNL-165 | |
| Human TNF alpha ELISA Kit | Invitrogen | KAC1751 | |
| IkappaB alpha (L35A5) Mouse Monoclonal Antibody | Cell signaling Technology | 4814 | |
| K-SFM medium | Invitrogen | 17005-042 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Multifunctional enzyme-linked immunosorbent assay reader | TECAN | GENios Plus | |
| NF-kappaB p65 (D14E12) Rabbit Monoclonal Antibody | Cell signaling Technology | 8242 | |
| non-fat milk | Biosharp | BS102-500g | |
| Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 31985062 | |
| P3000 Reagent | Invitrogen | L3000-015 | |
| PBS buffer | Sangon Biotech | E607080 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | |
| Phospho-NF-kappaB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit Monoclonal Antibody | Cell signaling Technology | 3033 | |
| Primary cell complete medium | Sunncell Biotechnology Co., Ltd. | SNPM-H252 | |
| Prime Script RT reagent Kit | Takara | RR037A | |
| PVDF membranes | Merck Millipore | SE1M003M00 | |
| rotease and phosphatase inhibitor cocktail | Beyotime | P1045 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026CN | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo | Nanodrop 2000 |
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