Artículo de método

Aislamiento e identificación de células sinoviales primarias similares a fibroblastos en pacientes con artritis reumatoide

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DOI:

10.3791/70116

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24 de febrero de 2026

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el método para aislar e identificar sinoviocitos primarios similares a fibroblastos (FLS) de alta pureza del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide para un modelado fiable de la enfermedad y el cribado de fármacos.

Resumen

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica caracterizada por hiperplasia sinovial y destrucción articular progresiva como su característica patológica principal. Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS) se reconocen como componentes celulares clave en la patogénesis de la AR, caracterizados por su comportamiento agresivo y tumoral, que media la destrucción del cartílago y el hueso. El aislamiento y purificación de los sinoicitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS) es una herramienta fundamental para investigar los mecanismos de la enfermedad y evaluar posibles fármacos terapéuticos. Aquí presentamos un protocolo completo para aislar, cultivar y validar funcionalmente la RA-FLS primaria humana a partir de muestras de tejido sinovial resecado obtenidas durante la cirugía de reemplazo de rodilla en pacientes con AR. Este método utiliza tejido sinovial fresco y emplea un proceso enzimático secuencial de digestión con tripsina y colagenasa tipo II para maximizar el aislamiento de RA-FLS de la matriz tisular. Finalmente, la identificación celular se logra mediante inmunofluorescencia de Vimentina y citometría de flujo, complementada por una evaluación funcional de la proliferación inducida por TNF-α. Este protocolo permite la adquisición de cultivos de RA-FLS de alta pureza con características fenotípicas específicas y respuesta inflamatoria, proporcionando a los investigadores un método fiable para obtener RA-FLS cultivados a corto plazo y derivados del paciente, adecuados para cribado de fármacos, estudios mecanicistas y aplicaciones de ingeniería tisular.

Introducción

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica caracterizada por poliartritis simétrica de las articulaciones periféricas, con una prevalencia global estimada del 0,5%-1% y el potencial de inducir diversas complicaciones sistémicas yextraarticulares 1,2,3,4,5. La característica patológica central de la AR es la sinopolitis crónica mediada por respuestas autoinmunes, lo que además conduce a la formación de tejido pano invasivo que erosiona el cartílago articular y el huesosubcondral 6,7. Entre ellas, la sinopolitis representa la característica patológica más antigua y central de la AR. Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS), que residen como las células residentes predominantes del sinovio, son fundamentales para orquestar tanto la inflamación sinovial como la destrucciónósea 8,9. Durante la respuesta inflamatoria sinovial en la AR, los sinoicitos fibroblastos similares a la artritis reumatoide (RA-FLS) pierden su fenotipo "regulador" normal y presentan un perfil "proinflamatorio" 10. Este cambio conduce a la producción masiva de citocinas inflamatorias, que pueden activar vías metabólicas energéticas relacionadas, lo que conduce a un aumento de la proliferación celular y amplifica aún más la cascada inflamatoriasinovial. Simultáneamente, la RA-FLS interactúa con otras células inmunitarias (como macrófagos, células T y células B) para mantener un estado inflamatorio crónicopersistente 14,15. Además, los RA-FLS presentan características similares al cáncer, incluyendo mayor capacidad migratoria, invasividad, proliferación descontrolada y resistencia a la apoptosis, y están activamente implicados en los procesos de erosión del cartílagoy el hueso 16.

En los últimos años, las FLS se han utilizado ampliamente como modelos in vitro para estudiar enfermedades inflamatorias articulares como la AR, una tendencia impulsada en parte por las limitaciones de las farmacoterapias de primera líneaactuales 17,18,19. Se emplean en cultivos 2D, modelos 3D y sistemas órgano-en-chip para investigar mecanismos de enfermedades, validar dianas terapéuticas y realizar cribado defármacos 20,21,22,23. Además, los RAFLS sirven como base para aplicaciones avanzadas, incluyendo organoides sinoviales derivados del paciente para predecir la respuesta de los DMARD; edición genética mediante CRISPR/Cas9 para estudiar la función génica en la progresión de la AR; y como fuente celular para la ingeniería de injertos funcionales de tejidosinovial: 24,25,26.

Obtener RA-FLS cultivado a corto plazo del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide constituye el primer paso para muchos experimentos. En comparación con las líneas celulares de FLS, las RA-FLS cultivadas a corto plazo y derivadas del paciente conservan la heterogeneidad interpaciente y características específicas de la enfermedad, permitiendo una representación más auténtica de los factores transcripcionales relacionados con la enfermedad y las diferencias regulatorias de las vías. En consecuencia, el rendimiento celular, la tasa de crecimiento y el rendimiento funcional pueden verse influenciados por factores específicos del paciente como la edad, la duración de la enfermedad, la historia clínica de la medicación y la actividad de la enfermedad, lo que conduce a cierto grado de variabilidad entre lotes. Por ello, los investigadores deberían evaluar el historial clínico de la fuente tisular antes de su uso y realizar experimentos en los primeros pasajes (P3-P7) para mantener la estabilidad fenotípica de las células.

Este estudio detalla un protocolo simplificado para extraer e identificar RA-FLS del tejido sinovial de la rodilla. El método emplea digestión enzimática secuencial (tripsina seguida de colagnasa tipo II) combinada con disociación mecánica suave. La evidencia sugiere que estas estrategias enzimáticas optimizadas y de varios pasos generalmente superan a los tratamientos con enzima única o con enzimas mixtas no secuenciales, lo que puede comprometer la viabilidad celular y el fenotipo 27,28,29,30. En comparación, el protocolo presentado permite un aislamiento más eficiente y suave de RA-FLS de alta viabilidad y alta pureza, minimizando el daño celular y la pérdida fenotípica para garantizar su idoneidad para ensayos funcionales posteriores.

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Protocolo

Este estudio recogió tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide sometidos a cirugía de reemplazo articular en el Hospital China-Japón Friendship. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de la cirugía. La información recogida y las muestras biológicas se manejaron con estrictas medidas para garantizar la privacidad de los pacientes y la seguridad de los datos. Cualquier muestra restante de tejido sinovial se eliminó conforme a las normativas de bioseguridad. El uso de tejido sinovial de la articulación de la rodilla de pacientes con artritis reumatoide en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Amistad China-Japón (Nº de aprobación: 2025-KY-223). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Adquisición y preparación de tejido sinovial

NOTA: Coloque el tejido sinovial obtenido durante la cirugía en un recipiente estéril lleno de solución salina al 0,9% o PBS para evitar la contaminación durante la transferencia del quirófano al gabinete de bioseguridad. Utiliza la inmersión en etanol seguida de lavado con una solución de penicilina y estreptomicina como pasos críticos para prevenir la contaminación bacteriana o fúngica, asegurando el éxito de los experimentos posteriores.

  1. Sumergir tejido sinovial fresco en un tubo centrífugo de 50 mL que contiene PBS y transfiererlo a un armario de bioseguridad.
  2. Transfiere el tejido sinovial a una placa de Petri con un 75% de etanol y sumergiérselo durante 30 segundos para la desinfección.
  3. Extrae tejido graso y óseo del tejido sinovial usando tijeras quirúrgicas estériles y pinzas, y luego transfiere el tejido restante a una nueva placa de cultivo.
  4. Lava el tejido sinovial obtenido 3 veces con PBS que contenga un 10% de penicilina/estreptomicina.

2. Digestión del tejido sinovial

NOTA: Utiliza tripsina para alterar las uniones celulares y la matriz extracelular dentro del tejido sinovial para su posterior aislamiento. Aplicar colagenasa tipo II para degradar selectivamente la estructura de la matriz extracelular, facilitando la disociación celular de la matriz. Esteriliza todas las tijeras quirúrgicas, pinzas y coladores celulares necesarios para la disección del tejido sinovial mediante autoclave antes de su uso. Tras la digestión, los fragmentos de tejido deben parecer flojos, con bordes deshilachados, y el medio puede volverse ligeramente turbio. El tejido no digerido permanecerá compacto y opaco.

  1. Tritura el tejido repetidamente con tijeras hasta convertirlos en fragmentos de 1 mm × 1 mm.
  2. Añade un 0,25% de tripsina al tejido y digiérdela a 37 °C en un agitador de temperatura constante (a 100-150 rpm) o en una incubadora celular durante 30 minutos.
  3. Prepara una solución de suero bovino fetal (FBS) al 10% utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Transfiere el tejido a tubos centrífugos de 15 mL o 50 mL según la cantidad de tejido, y neutralizarlo y digerirlo con PBS que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS).
  5. Centrifugadora (4 °C, 500 × g, 5 min), luego descarta el sobrenadante y conserva la bola.
  6. Resuspende el pellet en PBS.
  7. Centrifugadora (4 °C, 500 × g, 5 min), luego descarta el sobrenadante y conserva la pelota.
  8. Añade 100 mg de colagenasa tipo II a 50 mL de medio DMEM para preparar una solución de colagenonasa tipo II de 2 mg/mL.
  9. Filtrar la solución de colagénasa tipo II preparada a través de una membrana de 0,22 μm para su esterilización.
  10. Añade 2 mg/mL de colagnosa tipo II y digiérdela en un agitador a temperatura constante a 37 °C (a 100-150 rpm) o en una incubadora celular durante 4 horas.

3. Aislamiento y cultivo de sinovicicitos similares a fibroblastos

NOTA: Realizar todos los procedimientos de cultivo celular en un armario de bioseguridad en condiciones estériles y llevar guantes estériles para evitar contaminaciones.

  1. Prepara el medio DMEM completo suplementando el medio basal DMEM con suero bovino fetal al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
  2. Coloca un colador de 100 mallas sobre una placa de Petri estéril y vierte el tejido sinovial y el líquido digeridos sobre el colador.
  3. Transfiere el colador celular con tejido residual a otra placa de Petri estéril.
  4. Tritura el tejido restante en el colador usando el extremo de una varilla de desatascador estéril de 20 mL hasta que solo queden restos blancos y fibrosos, y no se pueda extraer más suspensión celular.
  5. Enjuaga el colador con un volumen adecuado de medio DMEM completo.
  6. Recoge todos los filtrados, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) y descarta el sobrenadante.
  7. Resuspende el pellet en PBS, centrifugadora (4 °C, 500 × g, 5 min) y descarta el sobrenadante.
  8. Resuspende las células en un medio DMEM completo.
  9. Realiza el recuento celular y transfiere las células a un matraz de cultivo.
  10. Incubar el matraz en una incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO₂).
  11. Cambia el medio después de 48 horas.
  12. Digiera las células con tripsina y el paso en una proporción de 1:3 cuando alcanzan la confluencia completa.

4. Identificar RA-FLS mediante tinción de inmunofluorescencia con vimentina

NOTA: Precalienta la solución de PBS utilizada para el lavado de celdas en baño maria ajustada a 37 °C. Todos los volúmenes de reactivos especificados en esta sección están estandarizados para un formato de placa de 48 pozos. Los volúmenes deben escalarse proporcionalmente según la superficie de crecimiento cuando se usan planchas de otro formato.

  1. Digiera las células con tripsina, resuspende las células recolectadas y diluye a 1 × 104 células/L usando un medio DMEM completo.
  2. Sembra RA-FLS en una placa de 48 pozos a 200 μL por pozo.
  3. Colócalo en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO₂) e incuba durante 24 horas.
  4. Descarta el medio y lava las células tres veces con PBS precalentado.
  5. Añade un 4% de paraformaldehído para fijar las células durante 10 minutos, descarta el fijador y lávate tres veces con PBS.
  6. Preparar 150 μL de solución al 0,1% de Triton X-100 en PBS por pozo. Asegura la mezcla completa mediante vórtices o inversión suave antes de usar.
  7. Añade solución de 0,1% de Triton X-100 a los pozos e incuba durante 10 minutos para permeabilizar las células.
  8. Descarta la solución de Triton X-100 al 0,1% y lava tres veces con PBS.
  9. Añadir 150 μL de solución bloqueadora libre de animales por pozo, incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
  10. Descarta la solución bloqueadora. Añade 150 μL de solución primaria de activación de anticuerpos vimentina (diluida 1:200 en diluyente de anticuerpos) a cada pozo.
  11. Incubar con anticuerpo primario a 4 °C durante la noche.
  12. Descarta el anticuerpo primario y lava las células cinco veces con PBS.
  13. Añadir 150 μL de anticuerpo secundario IgG anticonejo conjugado con Alexa Fluor 488 (diluido 1:50 en diluyente universal de anticuerpos) por pozo e incubar a 37 °C durante 1 hora protegido de la luz.
  14. Descarta el anticuerpo secundario y lava las células tres veces con PBS.
  15. Añade una gota de medio antidescolorado que contenga DAPI por pozo y seca durante 10 minutos en la oscuridad.
  16. Observar y capturar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un objetivo de 20× y conjuntos de filtros apropiados para DAPI y FITC/GFP.
    NOTA: Lava las células con PBS llenando completamente los pozos con PBS, incubando durante 5 minutos y luego retirando el PBS. Este procedimiento consiste en un ciclo de lavado.

5. Cuantificar RA-FLS y evaluar la pureza mediante citometría de flujo

NOTA: Utilizar Vimentina y CD90 como marcadores positivos para identificar RA-FLS, mientras que aplicar CD68, CD14 y CD11b como controles negativos para excluir la contaminación por células inmunitarias. La vimentina actúa como una proteína intermedia de filamento específica intracelular, predominantemente localizada en el citoplasma de RA-FLS. CD90 funciona como un marcador superficial crítico altamente expresado en RA-FLS, permitiendo su distinción de las células inmunitarias. Aunque CD68, CD14 y CD11b se expresan específicamente en macrófagos, monocitos y células mieloides, se emplean como marcadores negativos para excluir la contaminación por células inmunitarias. Asignar fluorocromos a los marcadores de superficie celular según su especificidad de unión y asegurarse de que no haya solapamiento en los canales de fluorescencia. Por ejemplo, en este experimento, CD90 y CD68 comparten el mismo fluorocromo; Por lo tanto, no los añadas al mismo tubo de centrífuga. Antes de incubar con anticuerpos de vimentina, añade agentes de fijación y permeabilidad para alterar la membrana celular. Si el citómetro de flujo tiene suficientes canales fluorescentes, se pueden asignar marcadores como CD90 y CD68 a diferentes canales para un análisis simultáneo multicolor que mejore aún más la eficiencia de detección y el contenido de información.

  1. Digiera RA-FLS de tercera generación usando tripsina libre de EDTA.
  2. Terminar la digestión con medio DMEM completo, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante.
  3. Resuspende el pellet en PBS, realiza el recuento celular y ajusta la concentración a 1 × 10⁶ celdas/mL usando PBS.
  4. Distribuir las celdas en tres tubos centrífugos, añadiendo 200 μL de suspensión de celda a cada tubo.
  5. Añadir anticuerpo CD11b (diluido 1:100 en diluyente universal de anticuerpos) a un volumen final de 100 μL al tubo 1. Vórtice para mezclar.
    1. Tras 15 minutos de incubación, añade 1 mL de agente de fijación/permeabilización al tubo 1, vórtice para mezclar y incubar durante 30 minutos protegido de la luz.
    2. Añadir 1 mL de tampón de fijación/permeabilización al Tubo 1 para terminar la permeabilización, vórtice para mezclar, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante.
    3. Preparar 100 μL de vimentina y cóctel de anticuerpos CD68 (cada uno diluido 1:100 en diluyente universal de anticuerpos), añadir al tubo 1, usar el vórtice para mezclar e incubar protegido de la luz durante 30 minutos.
    4. Añade 1 mL de buffer de fijación/permeabilización al Tubo 1, vórtice para mezclar, centrifugar (4 °C, 500 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante.
    5. Añadir 100 μL de anticuerpo secundario IgG anticonejo conjugado con Alexa Fluor 488 (diluido 1:50 en diluyente universal de anticuerpos) al tubo 1. Vórtice para mezclar e incubar protegido de la luz durante 30 minutos.
    6. Añade 1 mL de buffer al Tubo 1, vórtice para mezclar, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) y descarta el sobrenadante.
    7. Añade 300 μL de buffer al Tubo 1 y vórtice para mezclar y preparar la muestra de carga.
  6. Añadir los anticuerpos CD90 y CD14 (cada uno diluido 1:100 en diluyente universal de anticuerpos) al tubo 2 hasta un volumen final de 100 μL. Dejar el tubo 3 sin anticuerpos como control negativo.
    1. Después de 15 minutos de incubación, añade 1 mL de PBS a los tubos 2 y 3.
    2. Los tubos de centrifugadora 2 y 3 (4 °C, 500 × g, 5 min), descartan el sobrenadante, añaden 300 μL de tampón y usan un vórtice para mezclar la muestra de carga.
  7. Realizar la adquisición por citometría de flujo de las muestras preparadas.
  8. Analizar los datos de citometría de flujo y realizar estadísticas utilizando software compatible.

6. Medición de la proliferación de RA-FLS inducida por TNF-α utilizando el ensayo MTS

  1. Digiera RA-FLS de tercera generación usando tripsina libre de EDTA.
  2. Terminar la digestión con medio DMEM completo, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante.
  3. Resuspende el pellet en un medio DMEM completo, realiza el recuento de células y diluye a 1 × 10⁵ celdas/L.
  4. Siembra las celdas resuspendidas en una placa de 96 pozos a 100 μL por pozo.
  5. Incubar la placa en una incubadora de cultivos celulares hasta que ocurra adhesión celular, y luego dividirla en grupos de control en blanco e intervención.
  6. Añade 10 ng/mL de TNF-α al grupo de intervención y un volumen igual de PBS al grupo control en blanco.
  7. Tras 24 horas de intervención, se añaden 10 μL de reactivo MTS a cada pozo y continúen la incubación en la incubadora de cultivos celulares.
  8. Tras 1 hora de incubación, mide la absorbancia (OD) a 490 nm usando un lector de microplacas.
  9. Calcular la viabilidad de proliferación celular basándose en el valor OD de cada pozo.

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Resultados

Utilizando el protocolo, aislamos con éxito RA-FLS de cultivo a corto plazo y derivada del paciente. Se proporciona un diagrama esquemático del flujo de trabajo procedimental (Figura 1). En microscopía óptica, el RA-FLS mostró un fenotipo morfológico predominante de células poligonales con forma de huso e irregulares. Las células mostraron una extensa expansión citoplasmática con procesos alargados. Los bordes celulares parecían ligeramente indistintos en ár...

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Discusión

Este protocolo establece un método reproducible para el aislamiento y cultivo a corto plazo de RA-FLS de pacientes con AR, con éxito evidenciado por una alta viabilidad celular, un fenotipo característico, expresión de marcadores específicos y respuesta funcional a estímulos inflamatorios.

Pasos críticos y consideraciones técnicas
La fiabilidad de este método depende de varios pasos críticos. En primer lugar, el tejido sinovial fresco debe ...

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Divulgaciones

Los autores no reportan conflictos de interés en este trabajo y confirman que el uso de Figdraw para generar la Figura 1 cumple con los términos de licencia de la plataforma.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nºs 82074223 y 8207141673) y el proyecto clave a nivel del gobierno central: El establecimiento de un uso sostenible de valiosos recursos de la medicina china (nº 2060302).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgGZhongshan Jingqiao BiotecnologíaZF-0511
0,25% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-072
4% de paraformaldehídoSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-humano CD68biolegend562111
Solución de bloqueo libre de animalesTecnología de señalización celular15019
APC anti-humano CD90biolegend559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biociencias657925
BD LSRFortessaBD Biociencias647177
BV605 antihumano CD11bBidegend563015
Ensayo de proliferación celular (MTS) de CellTiter 96 AQueous One SolutionPromegaG358A
Colagenasa IISolarbioC8150
Medio de montaje fluorescente que contiene DAPIZhongshan Jingqiao BiotecnologíaZLI-9556
Medio de montaje fluorescente que contiene DAPIZhongshan Jingqiao BiotecnologíaZLI-9556
Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, alta glucosaHyCloneSH30022.01
Suero bovino fetal-Superfino (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC anti-humano CD14biolegend325604
PBS, 1 y horarios; (pH 7,4) Solución salina tamponada con fosfatoServicebioG4202
Solución de mezcla penicilina-estreptomicina (antibióticos dobles) 100 y 100 veces;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
QuickBlock Bloqueo Universal de Proteínas y Buffer de Dilución de AnticuerposBeyotimeP0270-500ml
TNF-& alfa humano recombinante;Peprotech300-01A
Buffe de tinción por factor de transcripcióneBiociencia00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Solución de tripsina (libre de EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Referencias

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