Aislamiento e identificación de células sinoviales primarias similares a fibroblastos en pacientes con artritis reumatoide

Resumen

Este protocolo describe el método para aislar e identificar sinoviocitos primarios similares a fibroblastos (FLS) de alta pureza del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide para un modelado fiable de la enfermedad y el cribado de fármacos.

Resumen

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica caracterizada por hiperplasia sinovial y destrucción articular progresiva como su característica patológica principal. Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS) se reconocen como componentes celulares clave en la patogénesis de la AR, caracterizados por su comportamiento agresivo y tumoral, que media la destrucción del cartílago y el hueso. El aislamiento y purificación de los sinoicitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS) es una herramienta fundamental para investigar los mecanismos de la enfermedad y evaluar posibles fármacos terapéuticos. Aquí presentamos un protocolo completo para aislar, cultivar y validar funcionalmente la RA-FLS primaria humana a partir de muestras de tejido sinovial resecado obtenidas durante la cirugía de reemplazo de rodilla en pacientes con AR. Este método utiliza tejido sinovial fresco y emplea un proceso enzimático secuencial de digestión con tripsina y colagenasa tipo II para maximizar el aislamiento de RA-FLS de la matriz tisular. Finalmente, la identificación celular se logra mediante inmunofluorescencia de Vimentina y citometría de flujo, complementada por una evaluación funcional de la proliferación inducida por TNF-α. Este protocolo permite la adquisición de cultivos de RA-FLS de alta pureza con características fenotípicas específicas y respuesta inflamatoria, proporcionando a los investigadores un método fiable para obtener RA-FLS cultivados a corto plazo y derivados del paciente, adecuados para cribado de fármacos, estudios mecanicistas y aplicaciones de ingeniería tisular.

Introducción

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica caracterizada por poliartritis simétrica de las articulaciones periféricas, con una prevalencia global estimada del 0,5%-1% y el potencial de inducir diversas complicaciones sistémicas y^{extraarticulares} 1,2,3,4,5. La característica patológica central de la AR es la sinopolitis crónica mediada por respuestas autoinmunes, lo que además conduce a la formación de tejido pano invasivo que erosiona el c....

Protocolo

Este estudio recogió tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide sometidos a cirugía de reemplazo articular en el Hospital China-Japón Friendship. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de la cirugía. La información recogida y las muestras biológicas se manejaron con estrictas medidas para garantizar la privacidad de los pacientes y la seguridad de los datos. Cualquier muestra restante de tejido sinovial se eliminó conforme a las normativas de bioseguridad. El uso de tejido sinovial de la articulación de la rodilla de pacientes con artritis reumatoide en este estudio fue aprobado por el ....

Resultados

Utilizando el protocolo, aislamos con éxito RA-FLS de cultivo a corto plazo y derivada del paciente. Se proporciona un diagrama esquemático del flujo de trabajo procedimental (Figura 1). En microscopía óptica, el RA-FLS mostró un fenotipo morfológico predominante de células poligonales con forma de huso e irregulares. Las células mostraron una extensa expansión citoplasmática con procesos alargados. Los bordes celulares parecían ligeramente indistintos en ár.......

Discusión

Este protocolo establece un método reproducible para el aislamiento y cultivo a corto plazo de RA-FLS de pacientes con AR, con éxito evidenciado por una alta viabilidad celular, un fenotipo característico, expresión de marcadores específicos y respuesta funcional a estímulos inflamatorios.

Pasos críticos y consideraciones técnicas
La fiabilidad de este método depende de varios pasos críticos. En primer lugar, el tejido sinovial fresco debe .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgG	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZF-0511
0,25% Tripsina-EDTA (1X)	Gibco	25200-072
4% de paraformaldehído	Solarbio	P1110
Alexa Flour674 anti-humano CD68	biolegend	562111
Solución de bloqueo libre de animales	Tecnología de señalización celular	15019
APC anti-humano CD90	biolegend	559869
BD FACSDiva Software 8.0.2	BD Biociencias	657925
BD LSRFortessa	BD Biociencias	647177
BV605 antihumano CD11b	Bidegend	563015
Ensayo de proliferación celular (MTS) de CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G358A
Colagenasa II	Solarbio	C8150
Medio de montaje fluorescente que contiene DAPI	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZLI-9556
Medio de montaje fluorescente que contiene DAPI	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZLI-9556
Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, alta glucosa	HyClone	SH30022.01
Suero bovino fetal-Superfino (FBS)	Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.	ZQ0500
FITC anti-humano CD14	biolegend	325604
PBS, 1 y horarios; (pH 7,4) Solución salina tamponada con fosfato	Servicebio	G4202
Solución de mezcla penicilina-estreptomicina (antibióticos dobles) 100 y 100 veces;	Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.	CSP006
QuickBlock Bloqueo Universal de Proteínas y Buffer de Dilución de Anticuerpos	Beyotime	P0270-500ml
TNF-& alfa humano recombinante;	Peprotech	300-01A
Buffe de tinción por factor de transcripción	eBiociencia	00-5523-00
Triton X-100	Solarbio	T8200
Solución de tripsina (libre de EDTA)	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	BL526A