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Artículo de método

Evaluación de la reserva de flujo coronario en un modelo murino de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada mediante ecocardiografía Doppler

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DOI:

10.3791/70135

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24 de marzo de 2026

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1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un enfoque rápido y no invasivo para evaluar la disfunción microvascular coronaria en un modelo murino de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF). La reserva de flujo coronario (CFR) se determina mediante la localización guiada por ultrasonido Doppler de la arteria coronaria izquierda, calculada como la relación entre la velocidad hiperémica y la velocidad base del flujo coronario.

Resumen

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF) supone una considerable carga global para la salud y un gran desafío clínico debido a la ausencia de terapias efectivas, y la fisiopatología subyacente sigue siendo esquiva. La disfunción microvascular coronaria (CMD), que es muy prevalente en pacientes con HFpEF, desencadena isquemia miocárdica que afecta tanto la función diastólica como sistólica del ventrículo izquierdo. Dado que la disfunción microvascular es una característica central de la HFpEF, la DMC se considera ahora un factor importante en su patogénesis. La reserva de flujo coronario (CFR), definida como la relación entre la velocidad máxima hiperémica y la del flujo sanguíneo en reposo, es un marcador muy valioso de isquemia miocárdica. Además, sirve como un indicador integral de la disfunción vasomotora coronaria, midiendo los efectos hemodinámicos combinados de las arterias coronarias epicárdicas y microvasculares sobre la perfusión miocárdica. Este protocolo se centró en evaluar los cambios en la CFR en un modelo murino de HFpEF mediante ecocardiografía Doppler. En este estudio, los ratones control mostraron un aumento mayor del doble en la velocidad máxima del flujo sanguíneo coronario con vasodilatación inducida por isoflurano en comparación con los valores en reposo, mientras que esta respuesta se atenuó significativamente en ratones con HFpEF. En la HFpEF, una reducción de la CFR predice los resultados adversos y refleja la disfunción microvascular subyacente, posicionándola como una herramienta clave para estudiar la progresión de la enfermedad y guiar la selección del paciente.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC) con fracción de eyección preservada (HFpEF) ha sido la forma dominante de IC y se asocia con un pronóstico negativo. Sin embargo, no existe un tratamiento probado para reducir su morbilidad y mortalidadrelacionadas 1,2. La presencia de múltiples factores de riesgo, incluyendo la edad avanzada, hipertensión, diabetes, dislipidemia y obesidad, subyace a la complejidad y heterogeneidad de la HFpEF3. En los últimos años, la evidencia acumulada ha demostrado que la disfunción microvascular coronaria (DMC) es un factor de riesgo independiente y directo para la HFpEF, en lugar de una comorbilidad 4,5,6. La disfunción microvascular coronaria que implica tanto anomalías funcionales como estructurales subestá en la isquemia subendocárdica, la fibrosis intersticial difusa y la disfunción ventricular izquierda en laHFpEF 7,8. Se ha realizado una extensa investigación sobre el papel patológico de la CMD en las enfermedadescardiovasculares 9,10. Un estudio clínico mostró que la disfunción microvascular (evidenciada por un CFR alterado <2,0) está directamente asociada con una peor función diastólica del ventrículo izquierdo y podría ser un objetivo terapéutico prometedor en HFpEF11. La evaluación ecocardiográfica en el estudio de prevalencia de disfunción microvascular en insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (PROMIS-HFpEF) reveló que el 75% de los pacientes con HFpEF presentaban CMD, según mediciones de CFR en la arteria coronariaizquierda 12. Además, la CMD anormal se correlacionó con un mayor riesgo de resultados adversos, incluyendo un aumento significativo del riesgo demortalidad 13,14. En consecuencia, emplear la DMC como biomarcador clave en modelos animales facilita enormemente la investigación de la fisiopatología de la HFpEF y ayuda a validar la replicación exitosa del fenotipo de la enfermedad.

Actualmente, los métodos para evaluar la función microvascular coronaria, como la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética cardiovascular (CMR), la reserva fraccional de flujo (FFR) y el índice de resistencia microcirculatoria (IMR), son difíciles de aplicar en estudios con roedores debido al pequeño tamaño de los animales y a la limitada disponibilidad de hardware de imagen dedicado. La reserva de flujo coronario (CFR) está recomendada por directrices internacionales como herramienta para interrogar la fisiologíacoronaria 15,16. Además, la CFR actúa como un marcador fiable de isquemia cardíaca, un indicador de la disfunción vascular coronaria y un valioso indicador pronóstico del riesgocardiovascular 17. La ecocardiografía Doppler para la evaluación de la CFR es un método validado y reproducible para evaluar la función vascular coronaria global en modelos preclínicos de roedores. Aunque estudios previos han informado del uso de CFR en modelos de ratón/rata de lesión por isquemia-reperfusiónmiocárdica 18,19, nunca se ha aplicado en modelos animales de HFpEF. Además, el método de evaluación CFR descrito en este estudio, que localiza rápidamente el LCA mediante ecocardiografía Doppler en color, puede extenderse a una variedad de modelos animales, incluyendo miocardiopatía diabética, cardiopatía hipertensiva y trastornos inflamatorios o autoinmunes crónicos. En el presente estudio, dada la ausencia de estenosis coronaria epicárdica en el modelo murino, la reducción de la reserva de flujo coronario (CFR) refleja principalmente disfunción microvascular coronaria más que contribuciones combinadas epicárdicas y microvasculares. Así, el CFR sirve como un marcador sustituto fiable para la CMD en este modelo HFpEF.

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Protocolo

Todos los procedimientos cumplieron con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Institucional del Hospital Torre de Tambores de Nanjing (Aprobación nº 20011141) y se ajustaron a las directrices de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo (ARRIVE) 20. En este estudio, se estableció el modelo HFpEF en ratones machos C57BL/6J de seis a ocho semanas (BW, ~25 g). Durante toda la duración experimental, los ratones fueron alojados en una sala libre de patógenos específicos (SPF) bajo condiciones controladas de temperatura (23 ± 1 °C), humedad (65%–70%) y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad. Todos los animales tenían acceso improvisado a comida y agua. Tras el estudio, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 1,5% y eutanasiados mediante dislocación cervical. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento del modelo de ratón HFpEF

  1. Asignar aleatoriamente los ratones en dos grupos: un grupo control (CTRL) y un grupo HFpEF, con ocho ratones en cada uno.
  2. Emplear un protocoloestablecido 21,22,23,24,25 para inducir el modelo de ratón HFpEF de la siguiente manera:
    1. Alimenta a ratones de seis a ocho semanas con una dieta alta en grasas (HFD, 60% de grasa) y proporciona 0,5 g/L de éster metilico N-nitro-L-arginina (L-NAME) disuelto en agua potable durante 8 semanas.
      NOTA: Prepara agua de beber L-NAME en botellas marrones para evitar la exposición a la luz y refresca cada 2–3 días.
  3. Alimenta a ratones de edad compatible con una dieta normal estándar y proporciona agua potable regularmente durante la misma duración que el grupo control.

2. Evaluación de la reserva de flujo coronario mediante ecocardiografía

  1. Precede la evaluación ecocardiográfica anestesiando al ratón mediante inhalación de isoflurano vaporizado al 1,5% administrado a 1,5–2,0 L/min con un flujo de O₂ del 100% en una cámara de anestesia.
    PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico volátil. Asegúrate de ventilar adecuadamente durante la operación. Usa guantes de nitrilo al añadir isoflurano líquido al vaporizador para evitar el contacto con la piel.
  2. Confirma la ausencia de reacción al pellizco de la piel y a la estimulación de los dedos o la cola, y luego coloca al animal en posición supina sobre la plataforma de imagen.
  3. Cambia la máquina de anestesia gaseosa de la cámara a la administración con mascarilla y mantén una concentración anestésica constante del 1,5% durante todo el procedimiento.
  4. Obtener datos fisiológicos (ECG y respiración) aplicando gel conductor a la lámina de cobre (electrodos ECG) de la plataforma de imagen y pegando las cuatro patas sobre ellas.
    NOTA: Mantener el isoflurano al 1,5% para mantenimiento y mantener la temperatura corporal central cerca de los 37 °C utilizando la plataforma de calentamiento incorporada. Mantener una frecuencia respiratoria objetivo de 100–140 respiraciones por minuto para asegurar la estabilidad fisiológica durante la imagen.
  5. Elimina el vello del pecho aplicando crema depilatoria con un aplicador con punta de algodón.
  6. Limpia el exceso de nata y el pelo suelto con gasas empapadas en agua para prepararte para la imagen.
    NOTA: Eliminar completamente la crema depilatoria residual para evitar irritación o toxicidad de la piel.
  7. Aplica ungüento oftálmico lubricante estéril en ambos ojos para evitar el resecamiento escleral.
  8. Aplicar gel de transmisión por ultrasonidos en la zona anterior del corazón y colocar la plataforma de imagen en un ángulo aproximado de 30°–45° respecto a la horizontal.
    NOTA: Evita las burbujas de aire en el gel de ultrasonidos.
  9. Coloque el transductor de ultrasonido de alta frecuencia lentamente sobre la línea paraesternal y alinearlo paralelo al tórax para obtener la vista ajustada del eje largo paraesternal (PLAX) del ventrículo izquierdo (Figura 1A).
  10. Inclina la sonda para asegurar un contacto ligero con la pared torácica, evitando la compresión.
  11. Pulsa el botón de Modo Brillante para cambiar a la imagen en modo brillo.
  12. Ajusta el ángulo de la sonda y la plataforma de imagen para localizar la arteria coronaria izquierda (LCA).
    NOTA: Identificar el ventrículo izquierdo (VI), la aurícula izquierda (LA), la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAW), la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPW), el tabique interventricular (IVS), la aorta (AO), la arteria pulmonar (PA), la vena pulmonar (PV), la válvula mitral (MV) y el músculo papilar dentro de la ventana acústica.
  13. Activa el modo Doppler de color pulsando el botón Doppler de color en la pantalla táctil. En visualización en tiempo real, el flujo alejado de la válvula aórtica (hacia la sonda) aparece en rojo.
  14. Ajusta el ángulo y la posición de la sonda para visualizar el LCA completo desde el seno aórtico hasta el sitio de la rama distal, minimizando la interferencia del flujo venoso pulmonar.
  15. Activa el modo Doppler de onda pulsiva (PW). Coloca la ventana de medición del peso de peso paralela a la dirección del flujo sanguíneo del LCA (Figura 1B, C).
    NOTA: Mantenga el ángulo de insonación por debajo de 60° y aplique corrección de ángulo en tiempo real alineando el cursor Doppler paralelo al flujo coronario.
  16. Seleccione Guardar clip para capturar la forma de onda base de la velocidad de flujo del LCA.
  17. Aumenta la concentración de isoflurano al 3% y observa el incremento gradual de la velocidad del flujo coronario.
  18. Tras 45 segundos de exposición continua al 3% de isoflurano, selecciona Guardar clip para capturar la velocidad del flujo coronario hiperémico.
    NOTA: Monitoriza continuamente el flujo sanguíneo del ACL. Si el volumen de la muestra de PW se desplaza debido al movimiento respiratorio o cardíaco, pausa la adquisición, vuelve al modo Doppler en color para reidentificar el LCA, reposiciona la compuerta PW y reanuda el modo PW.
  19. Al finalizar, suspende la inhalación de isoflurano y retira el gel de ultrasonidos. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica hasta que se recupere del todo, luego devuélvelo a su jaula.

3. Análisis estadístico

  1. Mediciones medias de tres ciclos cardíacos consecutivos trazadas en el software de análisis para obtener las velocidades de flujo de línea base y máxima del LCA. Calcular la CFR como la relación entre la velocidad máxima del flujo coronario hiperémico y la velocidad máxima basal del flujo coronario diastólico (CFV).
  2. Implementa un diseño doble ciego entre el experimentador y el analista de datos. Evalúa la normalidad usando la prueba de Shapiro–Wilk. Analizar datos normalmente distribuidos utilizando un test t de Student sin pares de dos colas. Analizar datos no distribuidos normalmente utilizando la prueba Mann–Whitney U.

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Resultados

En este estudio, 16 ratones (HFpEF, n = 8; CTRL, n = 8). La arteria coronaria izquierda se identificó bajo guía Doppler en color en la vista del eje largo paraesternal (PLAX), y la velocidad del flujo coronario se midió usando Doppler de onda pulsada (PW). Tras la adquisición de imágenes suficientes y reproducibles de cada ratón en concentraciones tanto del 1,5% (inicial) como del 3% (hiperémica) de isoflurano, se determinóel CFR promediado de al menos 3 ciclos ca...

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Discusión

Este estudio presenta un protocolo que utiliza un método no invasivo, sencillo y reproducible para evaluar la disfunción macro y microvascular en modelos animales de HFpEF. La ecocardiografía Doppler para evaluar la Reserva de Flujo Coronario está reconocida por la Sociedad Europea de Cardiología como un método validado yreproducible 15. En condiciones fisiológicas normales en ratones C57BL/6J, se espera que la reserva de flujo coronario sea de ≥2,0. En este estud...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no existen intereses financieros o comerciales en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo para Jóvenes Científicos Distinguidos en Nankín - Proyecto Clave, apoyado por la Fundación para el Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica, Departamento de Salud de Nankín (JQX22001); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2023M731631); financiación para ensayos clínicos del Hospital Drum Tower afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Nankín (2024-LCYJ-PY-29); Fundación de Investigación de la Comisión Provincial de Salud y Planificación Familiar de Jiangsu (MQ2024049).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Monitor de fisiología animalFujifilmVEVO 3100Monitoriza la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal
Ratones C57GemPharmatech Co., Ltd
CámaraCanon, JapónEOS R50Registra las posiciones de la plataforma de imagen y de la sonda de ultrasonido
Crema depilatoriaVeet, francésDepilación
GasaCurityCAR-6339-PKEstéril
IsofluranoRECOMPENSAR510-22-10Anestesia
N-nitro-L-arginina éster metilo (L-NAME)Sigma-AldrichN5751Introducción al modelo de ratones HFpEF
Dietas de investigación, 60% grasa y nbsp;  Research Diets, Inc.   D12492Dieta alta en grasas
Almohadilla termodinámica quirúrgicaGlobalebio, ChinaGE0-20WControl de temperatura
Gel de ultrasonidosLaboratorios ParkerW60698LGel de transmisión de ultrasonidos
Plataforma de imagen preclínica Vevo 3100FujifilmVEVO 3100Ecocardiografía
Software VevoLABFujifilmVevoLAB 3.2.6Análisis de datos de ecocardiografía

Referencias

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