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Artículo de método

Metagenómica de fracciones de tamaño viral del ADN para muestras de heces humanas

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DOI:

10.3791/70187

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24 de marzo de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo flexible para generar metagenomas de fracciones de tamaño viral (viromes) de alta calidad a partir de muestras de heces humanas. Desarrollado originalmente para la virómica del suelo, aquí este protocolo se aplicó con éxito a muestras de heces, permitiendo una caracterización robusta de la virosfera intestinal humana.

Resumen

Comprender la virosfera humana saludable (el componente viral del microbioma) requiere mediciones precisas de la composición de la comunidad viral en una amplia variedad de tipos virales. Basándonos en la experiencia previa con métodos de ecología de comunidades virales en suelo, aquí demostramos una serie de enfoques de laboratorio para enriquecer y extraer ADN de virus extracelulares en muestras de heces humanas. Se presenta un protocolo primario funcional, junto con opciones para desviaciones en diferentes pasos. El enfoque general consiste en añadir un tampón líquido (por defecto: solución salina fosfatada tamponada potenciada con proteínas, PPBS) para facilitar la eliminación de partículas virales libres de la matriz de heces, centrifugación para separar la fracción líquida que contiene partículas virales, filtración (por defecto: 0,2 μm de tamaño de poro) para eliminar la mayoría de las células, concentración de partículas virales (por defecto: ultracentrifugación), eliminación de ácidos nucleicos libres con nucleasas antes de la lisis viral, y luego extracción de ADN para secuenciación. También se observan técnicas alternativas, incluyendo diferentes buffers, tamaños de filtro y métodos de concentración. En general, se ofrecen múltiples opciones para generar ADN virómico de alta calidad para la secuenciación. En lugar de adaptar el enfoque a equipos y recursos específicos, la flexibilidad del protocolo debería hacerlo aplicable ampliamente a laboratorios con equipos estándar de biología molecular de diferentes formas.

Introducción

La viromica, o la secuenciación metagenómica no dirigida de la fracción de tamaño viral de comunidades mixtas, puede aportar información sobre la diversidad, evolución y ecología de virus no cultivados. Desde los primeros esfuerzos para catalogar comunidades virales intestinales hace más de 20 años, que utilizaron métodos desarrollados para muestras ambientales como el aguade mar 1, los enfoques viromicos han seguido permitiendo descubrimientos en ecología viral dentro del microbiomahumano 2. Sin embargo, no existe un protocolo universal único de virómicos, y las variaciones en las técnicas pueden influir en los resultados desecuenciación 3,4, influyendo en última instancia en la interpretación de la dinámica de la comunidad viral y dificultando las comparaciones entre estudios. Se necesitan protocolos optimizados, combinados con un conocimiento profundo de cómo las elecciones metodológicas moldean los perfiles de viroma, para caracterizar de forma robusta la virosfera humana.

Aunque no existe un protocolo universal de virómicos, la base general de los métodos de virogenia consiste en separar y concentrar físicamente partículas extracelulares similares a virus (viriones) según su tamaño y/o densidad, eliminar ácidos nucleicos libres (derivados en parte de residuos celulares o cápsides virales comprometidas) antes de la lisis virónica, y extraer ADN y/o ARN para su secuenciación. Algunas técnicas virómicas seleccionan a favor o en contra de tipos virales específicos, ya sea como una elección intencionada por parte de los investigadores o como una limitación metodológica no intencionada. La jeringuilla o la filtración al vacío se emplean frecuentemente para eliminar células microbianas y otros residuos, y el tamaño del filtro afecta inherentemente a la calidad y composición del viroma recuperable. Por ejemplo, la filtración puede aumentar la pureza de laviroma 5, pero puede excluir partículas viralesmás grandes 6,7. Los métodos de concentración de viriones, como la ultracentrifugación, la precipitación de polietileno glicol (PEG), la ultracentrifugación por gradiente de densidad y la ultrafiltración, también presentan compensaciones entre pureza, rendimiento y costes deequipamiento 3,8. Se sabe que múltiples químicas de tampón son efectivas para virómica. Puede que no tengan impactos desproporcionados en la caracterización de laviroma 9, pero los buffers de almacenamiento y resuspensión aún pueden afectar la recuperación del virus y los perfiles de la viroma generados a partir del análisis bioinformático10,11. Por último, dado que las concentraciones de ácidos nucleicos virales pueden ser bajas en muestras naturales, muchos estudios optan por amplificar el ADN viral antes de la construcción de la biblioteca (por ejemplo, mediante amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) o amplificación de cebador único independiente de la secuencia (SISPA)). Sin embargo, algunas de estas técnicas introducen un sesgo significativo12,13. En general, aunque muchos métodos viromicos pueden generar viromes con éxito, protocolos optimizados que reconozcan sesgos y estén algo estandarizados permitirán una investigación precisa y reproducible sobre viromes.

Este artículo presenta un flujo de trabajo flexible para generar viromas a partir de muestras de heces humanas. Adaptado de técnicas probadas de virómicos de suelo 14,15,16, este protocolo incluye varios pasos que facilitan la modificación, permitiendo a los investigadores adaptarlo a su propio equipo y necesidades de investigación. El método estándar de viromas de suelo descrito a continuación, aplicado con éxito tanto a muestras de suelo como de heces congeladas, produce viromas de alta calidad sin necesidad de un paso de amplificación del ADN viral previo a la construcción de la biblioteca. Las sugerencias para modificaciones de protocolo han sido probadas en distintos grados en otros estudios, pero sus efectos específicos posteriores sobre las secuencias de viroma de heces humanas no se examinaron aquí.

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Protocolo

Todos los sujetos reclutados para la recogida de muestras de heces dieron su consentimiento informado. Los protocolos de recogida de muestras fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Davis, y los estudios cumplen con la Declaración de Helsinki. Este protocolo está adaptado de Emerson et al. (2022)17.

1. Preparación de materiales

  1. Preparar solución fisiológica mejorada con proteínas (PPBS, 10x PBS, 1% K-citrato, 150 mMMgSO 4, 2% albúmina sérica bovina (BSA)18.
    NOTA: Otros tampones comúnmente utilizados en protocolos viromicos son magnesio fisiológico (SM)19 y tampón primario de citrato de potasiomodificado (AKC') 11.
    1. Añade 10 mL de 10 PBS, 10 g de K-citrato, 18,05 g deMgSO anhidro 4 en una botella de cristal autoclavable de 1 L y llena hasta 1 L con agua de laboratorio ultrapura. Ajusta el pH a 6,5 (normalmente requiere unos 50 μL de 6 M HCl o unos 100 μL de 2 M HCl). Deja una barra de agitación dentro de la botella para usarla en el paso 1.1.2.
    2. Autoclave la botella con amortiguador y una botella de cristal autoclavable de 1 L vacía. Después del autoclave, una vez que el tampón se enfría a temperatura ambiente, colócalo sobre una placa magnética de agitación y añade lentamente 20 g de BSA directamente en el frasco, añadiendo unos 5 g de BSA cada vez (para evitar espuma, minimiza agitar excesivamente la solución, por ejemplo, empieza con una mezcla lenta y ve aumentando gradualmente).
    3. Filtra todo el volumen del tampón a través de un filtro de vacío estéril de 0,22 μm hacia la botella vacía autoclavada de 1 L del paso 1.1.2. Guarda el buffer a 4 °C hasta que lo uses.
      NOTA: El buffer PPBS puede almacenarse a 4 °C durante unos 3 meses, pero no es estable a largo plazo cuando se almacena por encima de cero.
  2. Prepara los tubos de la ultracentrífuga.
    NOTA: Este protocolo utiliza ultracentrifugación para concentrar viriones. Otros enfoques comunes incluyen la precipitación de polietileno glicol (PEG), la ultracentrifugación por gradiente de densidad (por ejemplo, gradientes de cloruro de cesio) y la ultrafiltración.
    1. Para limpiar los tubos de las ultracentrífugas, primero, frógalos con agua de laboratorio ultrapura. Luego enjuaga los tubos con agua de laboratorio ultrapura.
    2. Llena los tubos con 1 M NaOH y déjalos remojar al menos 1 hora (puedes dejar remojo toda la noche). Limpia las tapas de plástico/goma de las ultracentrífugas y sus juntas tóricas sumergiéndolas en 1 M de NaOH.
      NOTA: No sumergas los tapones metálicos con tapa de rosca en NaOH.
    3. Después del remojo, enjuaga tres veces con agua de laboratorio ultrapura, seguida de un enjuague con agua sin nucleasas y de grado biológico molecular. Seca los tubos invertiendo y golpeando suavemente, o dejándolos secar completamente durante la noche. Etiqueta cada tubo de ultracentrífuga con un identificador de muestra.
  3. Preenfría el rotor de la ultracentrífuga a 4 °C dejándolo en la nevera o en la cámara fría durante la noche.

2. Purificación y concentración de viriones

  1. Pesa las heces en un tubo cónico estéril de 50 mL, libre de DNasa, RNasa y ADN.
    NOTA: La cantidad de heces utilizadas puede depender de la cantidad de material de muestra disponible. Aquí se usaron 2 g de heces. Si el material de muestra no utilizado necesita almacenarse congelado, considera alicitar toda la muestra antes de congelarla para minimizar futuros ciclos de congelación y descongelación.
  2. Añade 8 mL de buffer PPBS directamente en los tubos cónicos que contienen las heces (cónica #1). Resuspende completamente mediante vórtice.
  3. Sacude los tubos a 300 RPM a 4 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Si es necesario, se puede agitar a temperatura ambiente, pero se recomienda 4 °C.
  4. Centrifugar muestras en cónica #1 a 4.000 x g a 4 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Utiliza un rotor de cubo basculante, si es posible, para facilitar la separación vertical de densidad y facilitar los siguientes pasos.
  5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante en una nueva cónica estéril de 50 mL (cónica #2) y almacenarla a 4 °C (el sobrenadante aquí contiene los viriones). No descartes el tubo cónico que contiene la pelota (cónico #1), ya que se vuelve a usar en el Paso 2.6.
  6. Repite los pasos 2.2-2.5 dos veces más (de modo que la muestra en la cónica #1 haya pasado por un total de 3 veces resuspensión con buffer, 3 veces agitación y 3 veces centrifugación) y continúa acumulando el sobrenadante en la cónica #2.
    NOTA: Tres disparos deberían acumular un total de ~24 mL de sobrenadante.
  7. Centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene sobrenadante acumulado (cónica #2) durante 8 minutos a 10.000 x g a 4 °C.
  8. Realiza una segunda ronda de centrifugación. Primero, decantar el sobrenadante del cónico #2 a un nuevo tubo cónico de 50 mL (cónico #3). Centrifugar la cónica #3 durante 8 minutos a 10.000 x g a 4 °C.
  9. Usando filtración con jeringuilla, filtra secuencialmente el sobrenadante desde la cónica #3, evitando el pellet en o cerca del fondo del tubo. Prefiltra usando un filtro de jeringuilla estéril de polietersulfona (PES) estéril, seguido de un filtro estéril de jeringuilla PES de 0,20 μm, directamente en un tubo ultracentrífuga.
    NOTA: El propósito de prefiltrar con filtros de 5,0 μm es reducir el atasco de los filtros de 0,20 μm. Aún puede ser necesario desechar y reemplazar los filtros de jeringuilla si se obstruyen. La filtración puede realizarse en un solo paso apilando el filtro de 5 μm sobre el filtro de 0,20 μm, conectado a una sola jeringuilla, y directamente en un tubo ultracentrífuga. Se prefieren las membranas PES, ya que otros materiales pueden retener viriones (por ejemplo, fibra de vidrio) o obstruirse más rápido (por ejemplo, fluoruro de polivinilideno, PVDF). 0,45 μm es otro tamaño común de filtro.
  10. Comprueba la masa de todos los tubos de ultracentrífuga con su contenido de muestra, y empareja los tubos en la ultracentrífuga según la masa. Si es necesario, añadir PPBS al tubo más ligero de cada par para igualar el peso (dentro de un margen de error de 0,05 g para tubos emparejados).
  11. Ultracentrífuga a 112.000 x g a 4 °C bajo vacío durante 2 h 25 min.
    NOTA: Dependiendo del rotor utilizado, la duración del giro variará (según el coeficiente de sedimento (s) = 58). Consulte la Tabla de Materiales para el rotor utilizado aquí. Antes de retirar los tubos de la ultracentrífuga, observa la orientación de cada tubo en el rotor para ayudar a localizar el pellet viral. A veces, tras la ultracentrifugación, el pellet viral no es visible, y se debe tener especial cuidado al retirar el sobrenadante en el siguiente paso.

3. Resuspensión de pellets virales y tratamiento con DNasa

  1. Retira el sobrenadante ya sea decantando o usando una pipeta, teniendo cuidado de no alterar el pellet, que puede ser frágil (el pellet contiene los viriones concentrados).
    NOTA: Como se señaló en el Paso 2.11, el pellet puede o no ser visible, pero a menudo se puede ver un pellet marrón o amarillo del tamaño de un agujero.
  2. Trata las muestras con DNasa.
    NOTA: Si optas por no tratar muestras con DNasa, procede al Paso 4 y sigue "Si no se realizó el tratamiento con DNasa". Consulte la Discusión para considerar cómo realizar el tratamiento con DNasa.
    1. Resuspende el pellet en 100 μL de agua de grado biológico molecular libre de nucleasas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado.
    2. Haz la mezcla maestra del tratamiento con DNasa añadiendo 10 μL de buffer de reacción de DNasa y 10 μL de DNasa para cada muestra a tratar. Pipeta para mezclar bien.
      NOTA: Prepara suficiente mezcla maestra de tratamiento con DNasa para reacciones adicionales que tengan en cuenta la posible pérdida de volumen durante el pipeteo en el Paso 3.2.3.
    3. Añade 20 μL de la mezcla maestra de tratamiento con DNasa a los viriones resuspendidos. Mezcla bien con pipeteo suave. Incuba a 37 °C durante 30 minutos.
    4. Añadir 10 μL de solución de parada de DNasa para inactivar las nucleasas. Un breve vórtice.

4. Extracción de ácidos nucleicos virales

  1. Realiza la extracción de ADN utilizando el kit de extracción de ADN que aparece en la Tabla de Materiales.
    NOTA: Haz dos modificaciones a las instrucciones del fabricante. 1) Tras el paso 1 del procedimiento, calienta el tubo de perlas que contiene los viriones en el buffer CD1 a 65 °C durante 10 minutos y luego procede a la extracción según las instrucciones del fabricante. 2) Durante el paso de elución del ADN (paso 16 del procedimiento), incubar las columnas a temperatura ambiente durante 5 minutos tras añadir C6.
    1. Si se realizó un tratamiento con DNasa: Después de que las nucleasas hayan sido inactivadas (en el paso 3.2.4), utilice todo el volumen como entrada para la extracción de ADN (es decir, en el paso 1 del procedimiento del kit de extracción de ADN, añadir este volumen al tubo de perlas que contiene 800 μL de CD1). Asegúrate de no dejar ninguna solución (esta contiene los viriones).
    2. Si no se realizó el tratamiento con DNasa: Añadir 100 μL de agua de grado molecular libre de nucleasa al tubo ultracentrífuga que contiene el pellet del Paso 3.1. Raspa suavemente la pelota y vuelve a suspenderla. Utiliza el pellet resuspendido como entrada para la extracción de ADN.

5. Cuantificación del ADN

  1. Cuantifica el ADN extraído con el método preferido basado en fluorescencia.
    NOTA: Los rendimientos de ADN de Viroma rara vez son lo suficientemente altos para cuantificar por absorción; sin embargo, esto puede ser útil para identificar contaminantes químicos.
  2. Para almacenamiento a corto plazo, almacenar ADN a -20 °C tras cuantificación. Para almacenamiento a largo plazo, guárdalo a -80 °C. El ADN ya está listo para la preparación y secuenciación de la biblioteca. Consulta la Tabla de Materiales para el kit de preparación de la biblioteca y la plataforma de secuenciación utilizada aquí.

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Resultados

Un esfuerzo exploratorio que aplicó este protocolo a una única muestra de heces congeladas (procesada en triplicado técnico para viromas) junto a dos muestras de suelo demostró su eficacia para producir viromas de alta calidad a partir de diferentes tipos de muestra. Utilizando datos de secuenciación filtrados por calidad y contigs ensamblados de novo generados por este protocolo, se identificaron secuencias virales potenciales mediante una herramienta de identificación...

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Discusión

Este protocolo presenta un método relativamente sencillo y adaptable para generar viromas. Probado en suelos14, 15, 16 y 21, se aplica con éxito aquí a muestras de heces humanas. Este protocolo es el que mejor recupera virus de ADN extracelulares intactos y no está diseñado para recuperar intencionadamente virus intracelulares o profagos (aunque algunos pueden ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a los doctores Sean Adams, Trina Knotts y Mohamed R. Ali (Facultad de Medicina de la Universidad de California, Davis) por recoger y proporcionar la muestra de heces cumpliendo con los protocolos y estándares éticos del IRB. Agradecemos al Dr. Matthew R. Olm (Universidad de Colorado, Boulder) su colaboración en el análisis de la muestra de heces. Esta investigación fue financiada por el NIH Common Fund (Programa de Virome Humana), Premio # U01DE034198. LSH también contó con el apoyo parcial del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE), la Oficina de Ciencia, la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental (BER), el Programa de Ciencia Genómica, número de concesión DE-SC0023127 (subvención a JBE, subvención del investigador principal Sydney Glassman).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Polvo libre de DNasa y Proteasa con Albúmina Sérica Bovina (BSA)Biorreactivos de FisherBP9706100Para la receta PPBS (Paso 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016Kit de extracción de ADN (Paso 4.1)
Kit de biblioteca KAPA DNA HyperPrepRocheN/DLas bibliotecas generadas por este kit se secuenciaron usando la plataforma Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Sulfato de magnesio (MgSO4), anhidro, etc; 99.5%Sigma-AldrichM7506Para la receta PPBS (Paso 1.1)
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, libre de RNasaInvitrogenAM9624Para la receta PPBS (Paso 1.1)
Filtros de jeringuilla de membrana de polietersulfona (PES), estériles, 28 mm, 0,2 y mu; mCorning431229Para filtración con jeringuilla (Paso 2.9)
Tubos centrífugos cónicos de polipropileno, estériles, 50 mLOlympus Plastics28-108
Citrato de potasio monohidrato (Cristalino/Certificado)Fisher ChemicalP222Para la receta PPBS (Paso 1.1)
Qubit  Tubos de ensayoInvitrogenP32856Para la cuantificación del ADN (Paso 5.1)
Fluorómetro Qubit 4InvitrogenP33238Para la cuantificación del ADN (Paso 5.1)
Kits de cuantificación de dsDNA de qubitsInvitrogenQ32850Para la cuantificación del ADN (Paso 5.1)
RNasa sin RNasa RQ1PromegaPR-M6101Incluye el tampón de reacción, la DNasa y la solución de parada
Supor filtros de jeringa de membrana hidrofílica polietersulfona (PES), estériles, 32 mm, 5,00 y micro; M Cytiva (anteriormente Pall Lab)28150-956Para filtración con jeringuilla (Paso 2.9)
Rotor de ultracentrífuga: Rotor de ángulo fijo Tipo 50.2 Ti, 50.000 rpm, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901También utilizamos el Beckman Coulter Type 70 Ti Fixed Angle Titanium Rotor (Cat. 337922). Centrifuga durante 3 horas si usas el 70 Ti.
Tubos ultracentrífuga: botella de policarbonato de 26,3 mL con conjunto de tapa, 25 x 89 mmBeckman Coulter355618Compatible con los rotores Beckman Coulter Tipo 50.2 Ti (Cat. 337901) y Tipo 70 Ti (Cat. 337922)
Ultracentrífuga: Beckman Instruments Optima LE-80K Ultracentrífuga de sueloBeckman Coulter365668También utilizamos la ultracentrífuga refrigerada Beckman Coulter L8-70M (Cat. 344196)

Referencias

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