Cuantificación de los cambios en las unidades formadoras de colonias de bifidobacterias y lactobacilos durante el tratamiento con rifaximina y gel sinbiótico en voluntarios sanos

Summary

Este ensayo clínico evaluó los recuentos de bifidobacterias y lactobacilos tras una semana de tratamiento con rifaximina y un gel sinbiótico compuesto por Lactobacillus acidophilus NCFM y Bifidobacterium lactis Bi07, con inulina de agave, durante el tratamiento con rifaximina y 4 semanas después, en comparación con un gel placebo, mostrando que el gel sinbiótico puede ayudar a mantener lactobacilos y bifidobacterias.

Abstract

Aunque la microbiota intestinal suele ser estable, puede verse afectada por el tratamiento con antibióticos. La rifaximina, que se utiliza para tratar trastornos gastrointestinales, se administra frecuentemente junto con probióticos para reducir el riesgo de disbiosis. Lactobacillus acidophilus interactúa con las células intestinales y utiliza compuestos prebióticos. Bifidobacteria, especialmente Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, es un probiótico que se ha asociado con efectos beneficiosos en el intestino. Los estudios in vitro han demostrado la superioridad de los fructanos de agave sobre la inulina de achicoria. No hay estudios documentados cambios en los recuentos fecales de lactobacilos y bifidobacterias tras la administración concomitante de rifaximina y sintióticos. Nuestro objetivo fue evaluar los cambios en los recuentos de UFC de bifidobacterias intestinales y lactobacilos en voluntarios sanos tras el consumo de Gel Sintbiótico, que contiene Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 y inulina de agave como prebiótico, durante una semana de tratamiento con rifaximina y durante 4 semanas después. En un ensayo clínico aleatorizado, controlado con placebo y doble ciego, los participantes sanos sin tratamiento antimicrobiano el mes anterior fueron aleatorizados 1:1 en dos grupos (10 participantes por grupo). El grupo Gel Sinbiótico recibió 10,32 g de inulina de agave como prebiótico y 4 ×^{10 UFC/g} de Lactobacillus acidophilus NCFM y 4 ×^{10 9} UFC/g de Bifidobacterium lactis Bi07 por día durante 5 semanas, y 200 mg de rifaximina dos veces al día durante la primera semana. El grupo de gel placebo recibió gel placebo durante 5 semanas y 200 mg de rifaximina dos veces al día durante la primera semana. Los cambios bacterianos se estimaron cuantificando la UFC mediante evaluación microbiológica de las heces. Cinco semanas después, las poblaciones de lactobacilos y bifidobacterias no cambiaron. La detección de Lactobacillus acidophilus NCFM y Bifidobacterium lactis Bi07 en algunas muestras de heces sugiere una colonización transitoria y parcial, lo que pone de manifiesto la necesidad de estudios dosis-respuesta con este producto sinbiótico.

Introduction

La microbiota intestinal humana es una comunidad densamente poblada que incluye especies nativas permanentemente presentes y otros microorganismos transitorios. Aunque su composición puede variar entre individuos, generalmente se considera estable. Sin embargo, puede estar influenciado por la edad, la infección y el tratamiento con^{antibióticos 1,2,3}. La rifaximina, un antibiótico de amplio espectro con baja absorción intestinal, se utiliza para tratar trastornos intestinales y puede alterar la microbiota. Se utilizan bacterias probióticas de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium para mitigar estos^{efectos 2}.

Se ha reportado que cepas de Bifidobacterium spp. son resistentes a^{la rifaximina 2}, lo que tiene un efecto interesante de promover una biota intestinal que contiene poblaciones de Bifidobacterium spp. en números suficientes para efectos probióticos beneficiosos.

Además, Lactobacillus acidophilus ha sido ampliamente reconocido por su capacidad para interactuar con el epitelio^{gastrointestinal 4} y su capacidad para utilizar prebióticos, como polisacáridos, oligosacáridos y fructooligosacáridos. Sin embargo, solo se han identificado unas pocas cepas probióticas, como la cepa Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM). Por tanto, es importante estudiar sus efectos in vivo, al igual que la presencia de Bifidobacterium lactis Bi07 en el tracto gastrointestinal, ya que se ha asociado con diversos beneficios beneficiosos para^{la salud 2,5}. Estos probióticos requieren un prebiótico para crecer de forma óptima, por lo que un bibiótico que contiene tanto un probiótico como un prebiótico funciona de forma sinérgica; es decir, su efecto favorable es mayor que el del probiótico solo. Junto con los prebióticos, que actúan como sustratos para los probióticos, se espera que esta simbiosis mejore la supervivencia de los microorganismos probióticos en el tracto gastrointestinal, conduciendo a una mayor restauración de la^microbiota.

Una fuente importante de prebióticos son los fructanos de agave, que se ha reportado que tienen efectos in vitro superiores sobre la microbiota que los de la raíz de achicoria (Cichorium intybus L.)⁷. Los estudios han informado sobre los efectos del consumo de probióticos; por ejemplo, Engelbrektson et al. evaluaron si el consumo de probióticos durante y después de la administración de antibióticos podría reducir las alteraciones en la microbiota causadas por los^{antibióticos 8}. Encontraron que el grupo que recibió la mezcla probiótica mostró una recuperación más rápida de la microbiota normal que aquellos que no la^{tenían 8}. Además, Koning et al. estudiaron la disbiosis en la microbiota intestinal de 40 voluntarios sanos tratados con 500 mg de amoxicilina dos veces al día durante 7 días y la posible recuperación de la microbiota tras el consumo de una mezcla probiótica. Los resultados mostraron que el tratamiento con amoxicilina afectaba la composición de la microbiota nativa. Cuando se administró una mezcla probiótica, la microbiota se recuperó significativamente tras dos meses de consumo⁹.

Sin embargo, la literatura informa que ningún estudio ha investigado el efecto del consumo de sinbióticos (con fructanos de agave como prebiótico) sobre la microbiota intestinal durante y después de la administración de antibióticos, como la rifaximina; Solo encontramos estudios con probióticos. Por ello, este estudio evaluó los cambios en los recuentos de UFC de bifidobacterias intestinales y lactobacilos en voluntarios sanos tras el consumo de gel sinbiótico, que contiene Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 e inulina de agave como prebiótico, durante una semana de tratamiento con rifaximina y durante 4 semanas después.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional para la Investigación Biomédica en Humanos (CIIBH) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) (REFERENCIA 1734). Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado antes de ser incluidos en este estudio.

Diseño del estudio y población

Se trataba de un ensayo clínico aleatorizado, controlado con placebo, doble ciego, con un periodo de seguimiento de 5 semanas. Se invitó a los trabajadores del INCMNSZ a participar en el estudio, y entre 2011 y 2012 se incluyeron voluntarios sanos de entre 20 y 50 años sin tratamiento antimicrobiano el mes anterior que aceptaron y firmaron el formulario de consentimiento informado. Los sujetos del estudio fueron asignados aleatoriamente 1:1 al grupo Gel Sinbiótico con 10,32 g de inulina de agave como prebiótico y 4 × 10^UFC/g de Lactobacillus acidophilus NCFM y 4 × 10^UFC/g de Bifidobacterium lactis Bi07 al día, contenidos en 4 sobres durante 5 semanas, y 200 mg de rifaximina dos veces al día durante la primera semana. El grupo del gel placebo recibió 4 paquetes de 15 g de gel placebo, con la misma presentación y características sensoriales que el gel sinbiótico, durante 5 semanas, y 200 mg de rifaximina dos veces al día durante la primera semana (Figura 1).

Evaluación clínica

En ambos grupos de estudio, los síntomas y la apariencia de las heces se evaluaron utilizando la Escala de Bristol. También se midieron peso, altura e índice de masa corporal (IMC). Se utilizó un diario para evaluar el consumo de gel sinbiótico, gel placebo y rifaximina, así como para registrar la presencia o ausencia de efectos secundarios relacionados con la ingestión de gel.

Consumo de fibra

La ingesta de fibra se evaluó mediante un diario de alimentos y una llamada de 24 horas cada semana en ambos grupos.

Adherencia al tratamiento

La adherencia al consumo de rifaximina y gel se evaluó contando el número de dosis de rifaximina y el número de sobres de geles sintbióticos y placebo consumidos por participante. Se detectó la presencia de Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Evaluación microbiológica de heces

En la visita 0 y semanalmente durante 5 visitas (6 visitas) en cada grupo, se evaluaron los números de Lactobacilli, Bifidobacterias y Enterobacterias en 120 muestras fecales mediante el método de recuento de placas. Este método mide las unidades formadoras de colonias (UFC) colocando muestras diluidas sobre medios sólidos especializados¹⁰. Se recogían muestras de heces al inicio de cada visita.

Para identificar microorganismos, se recogieron muestras fecales y se almacenaron en tubos BBL. El vial de PBG se utilizaba para bacterias anaeróbicas, y las muestras fecales se transportaban en un enfriador de poliestireno que contenía paquetes de gel congelados para mantener una temperatura baja antes de su procesamiento en laboratorio. Se retiró la tapa del frasco de PBG para coprocultura y se recogió la muestra de heces mediante un hisopo, asegurando que el hisopo quedara impregnado con la muestra. El aplicador se colocaba entonces en un tubo que contenía un medio sólido de cultivo.

Para las bacterias anaeróbicas, se pesaron los viales y se recogieron entre 5 y 10 g de heces con una cuchara. Después, las heces se mezclaban con el contenido del frasco y se sellaban herméticamente. Para el procesamiento de las muestras, se pesaron los viales que contenían las muestras y las bolsas estériles de Stomacher. La muestra se vaciaba en una bolsa, se centrifugaba durante 60 segundos y luego se añadían 4,5 mL de agua con peptona al 0,1%. Posteriormente, 500 μL de la muestra se transfirieron a un vial y se vórtizaron para homogeneizar la mezcla. Tras inocular 100 μL de la muestra en duplicado en cada placa del medio selectivo específico, medio Man Rogosa Sharpe (MRS) para lactobacilos y medio DP Beerens con cisteína + cicloheximida (para eliminar flora no deseada) para bifidobacterias, hasta la dilución 8 (factor de dilución 0,1 mL). Para enterobacterias, se utilizó medio MacConkey en diluciones 5–8 (factor de dilución 0,1 mL), donde se separaron y cuantificaron las colonias^{bacterianas 11}. Cada polvo del medio se disolvía en agua destilada purificada, la solución se calentaba hasta ebullición para asegurar una disolución completa y se esterilizaba en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos. La mezcla se enfrió a 46,5 °C para realizar la técnica de vertido de placa, vertiendo 1 mL por placa en duplicado en placas de Petri estériles que contenían entre 15 y 20 mL de medio de cultivo, y permitiendo que las placas solidificaran. Las muestras inoculadas se incubaron a 37 °C en una atmósfera enriquecida con CO₂ en sistemas GasPak anaeróbicos para mantener condiciones anaeróbicas durante 24–48 horas. Las unidades formadoras de colonias (CFU) se marcaron con un corral y se contaron¹². Se aplicó la siguiente fórmula:

UFC/mL = (número de colonias × factor total de dilución)/volumen de cultivo enchapado (mL)

Identificación de características morfológicas de lactobacilos y bifidobacterias

Se utilizó la mancha de Gram para identificar las características morfológicas del espécimen. Se colocaba una muestra de colonias bacterianas de cada cepa sobre una lámina de microscopio, se teñía con violeta cristalino durante 1 minuto y luego se enjuagaba con agua destilada. Se aplicó una solución de yodo durante 1 minuto y luego se enjuagó con agua destilada. Durante 10 segundos se usó una solución de alcohol y acetona como decolorante y se enjuagó con agua destilada. Finalmente, se aplicó safranina como contratinte durante 1 minuto y se enjuagó con agua destilada. Las láminas del microscopio se observaron bajo un microscopio óptico utilizando aceite de inmersión con un objetivo de 100x.

La cuantificación total se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) en muestras fecales seleccionadas aleatoriamente de cinco sujetos por grupo, obteniendo un total de 60 muestras en 5 semanas. Los aislados de medios de cultivo se procesaron para la extracción de material genético. La PCR se realizó utilizando cebadores bacterianos universales para amplificar un fragmento del gen 13 del ARNr^16S. Los productos de PCR se purificaban y secuenciaban. Las secuencias fueron verificadas y enviadas a la base de datos GenBank para confirmar la presencia de cepas lactobacillas y bifidobacterianas aisladas de las muestras fecales.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como frecuencias absolutas y relativas o mediana (p25-P75). La gravedad acumulada de los síntomas se determinó utilizando la puntuación de Likert (leve, 1; moderada, 2; grave, 3) en cada seguimiento. Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon y el qui-cuadrado o prueba exacta de Fisher. Se realizaron comparaciones intragrupales entre las semanas 0 y 5 utilizando la prueba de Friedman y comparaciones múltiples con Durbin-Conover. La significación estadística se estableció en P < 0,05.

Results

Veinte voluntarios sanos se dividieron aleatoriamente en el grupo del Gel Sinbiótico (n = 10) y el grupo del Gel Placebo (n = 10) (Figura 2 y Tabla 1). En el grupo de Gel Sinbiótico, siete eran hombres y tres mujeres, con una edad media de 31 años (rango de 27–35 años); en el grupo de Gel Placebo, tres eran hombres y siete mujeres, con una edad media de 33 años (rango, 28–38 años). Los grupos eran similares en cuanto a edad,...

Discussion

En el presente estudio, encontramos una reducción significativa en los recuentos enterobacterianos en las muestras fecales de sujetos del grupo placebo desde la primera semana de intervención y en sujetos del grupo con gel sinbiótico en la primera y segunda semana. Este cambio puede explicarse mediante la rifaximina, que se ha descrito como la mitigación del sobrecrecimiento bacteriano^{patógeno 14}. En nuestro estudio, el grupo del gel sinbiótico que siguió a la rif...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo BBL	NA	NA	Se puede usar cualquier marca
Medio DP	NA	NA	Se puede usar cualquier marca
Paquetes de gel congelados
Medio MacConkey	NA	NA
MRS medium	NA	NA	Se puede usar cualquier marca
Vial de PBG			Tampón de fosfato, gelatina, sales 0,05% cisteína como agente reductor para 02
Placas de Petri
Mezcla placebo	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Mismas propiedades físicas y sensoriales que el gel symiotico, pero sin los ingredientes activos
Contenedor de poliestireno
Mezcla simbiótica	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Producto no lácteo compuesto por Lactobacillus acidophilus NCMF y Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), y 17,2 g de inulina de agave como prebiótico en un paquete de 15 g