Este protocolo describe los pasos necesarios para la colonización de ratones con pks+ Escherichia coli en condiciones no inflamatorias, así como métodos no invasivos para la validación de la colonización y evaluación de la expansión de pks+ E. coli en heces.
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Artículo de método
Colonización con pks+ Escherichia coli de Murina en condiciones no inflamatorias
En este artículo
Resumen
Resumen
pks+ Escherichia coli está cada vez más implicada en el desarrollo del cáncer colorrectal (CCR), especialmente entre un subconjunto en rápida expansión de pacientes jóvenes con CCR de inicio temprano. Las cepas pks+ de E. coli producen la genotoxina colibactina, conocida por causar fracturas de ADN de doble cadena y mutaciones en las vías de proliferación y diferenciación celular asociadas con el CRC. Este artículo detalla un método para la colonización de pks+ E. coli en ratones bajo condiciones no inflamatorias, desde la preparación del inóculo bacteriano hasta la validación de la colonización. Tras una incubación nocturna, se administra la cepa de pks+ E. coli NC101 a ratones condicionados con antibióticos mediante gavage oral. La colonización en heces se evalúa cuantificando el número de unidades formadoras de colonias gram-negativas (UFC) que fermentan la lactosa y mediante amplificación cuantitativa por PCR. Utilizando este protocolo, se demostró que, tras la exitosa colonización de ratones C57BL/6 con E. coli NC101, la suplementación con fibra dietética inulina promovió el crecimiento de pks+ E. coli, reflejado en una mayor recuperación de UFC, mayor abundancia de la familia Enterobacteriaceae y niveles incrementados de la E. P Gene. En resumen, este modelo permite el estudio de tratamientos preventivos y terapéuticos dirigidos a un patobionte clave involucrado en el desarrollo del CRC.
Introducción
Se sabe que la microbiota intestinal desempeña un papel importante en la salud y enfermedad del huésped, con disbiosis microbiana intestinal, o un crecimiento excesivo de ciertas bacterias potencialmente patógenas (patobionitas), identificadas como una característica de varios estados patológicos, incluyendo enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias intestinales (EII) ycáncer 1. pks+ Escherichia coli es un patobionte enriquecido en muestras de tejido colónico de pacientes conEII-2 y cáncer colorrectal (CRC)3 en comparación con individuos sanos. La actividad pro-tumorígena de pks+ E. coli está vinculada a la expresión del grupo génico policetida sintasa (pks) y a la producción de la genotoxinacolibactina 4. La colibactina transloca al núcleo de las células epiteliales del colon, lo que conduce a la formación de rupturas de ADN de doblecadena 5 y mutaciones en vías clave asociadas alCRC 6. Se ha demostrado que la colonización por pks+ E. coli contribuye a la iniciacióntumoral 7 y a la progresióntumoral 3 en modelos preclínicos de CCR asociada a colitis (CAC). Recientemente, la mutagénesis inducida por colibactina se ha asociado con CRC de inicio temprano 8,9. La incidencia de CRC de inicio temprano, que ocurre en menores de 50 años, ha ido aumentando en las últimas décadas, con el potencial de revertir la actual disminución general de las tasasde CRC 9.
El papel de pks+ E. coli en el desarrollo del CRC, así como en otros aspectos mediados por microbiotas de la salud del huésped, sigue siendo esclarecido. Además, se ha demostrado que varios factores influyen en la expresión génica del PKS, incluyendoinflamación 10, concentraciones de hierroluminal 11 y factoresdietéticos 12,13, abriendo la puerta a intervenciones dirigidas a la microbiota. Aquí se describe un método para la colonización intestinal de pks+ E. coli mediante gavage oral en ratones utilizando una cepa murina de la cepa pks+ E. coli NC101 (E. coli NC101). Otros modelos han evaluado los efectos de E. coli NC101 sobre la inflamación y carcinogénesis en ratones libres de gérmenes (GF) monocolonizados por gavage oral y muestrasrectales 3, en modelos genéticamente susceptibles (IL-10-/-) decolitis 3,14, y en modelos químicamente inducidos de inflamación del colon y alteración de la barreraintestinal 15. Sin embargo, la colonización rentable con pks+ E. coli también puede obtenerse en condiciones no inflamatorias en ratones libres de patógenos específicos (SPF) pretratados con antibióticos para crear un nicho de colonización yexpansión 14,16,17. También se presentan diversos métodos para la detección y cuantificación de pks+ E. coli en heces de ratón, incluyendo la amplificación cuantitativa por PCR (qPCR) del gen clbP, la evaluación qPCR de la abundancia de la familia Enterobacteriaceae y la recuperación de unidades formadoras de colonias (UFC) en medios de agar MacConkey específicos para bacterias de fermentación de lactosa gramnegativas. Estos métodos pueden usarse de forma intercambiable o conjuntamente para confirmar la presencia de pks+ E. coli y la producción de colibactina con fines de validación o para evaluar diferencias en la expansión de pks+ E. coli en respuesta a intervenciones dirigidas a la microbiota.
Aquí, este protocolo se utiliza para evaluar el efecto de la inulina de fibra dietética sobre la colonización y expansión de pks+ E. coli mediante qPCR y recuperación de UFC. La inulina es un prebiótico que ha demostrado promover el crecimiento de especies beneficiosas de Bifidobacterium y Lactobacillus en el intestino, así como aumentar la producción de ácidos grasos de cadena corta, que desempeñan un papel importante en la homeostasis intestinal18. Sin embargo, también se ha demostrado que la inulina promueve el crecimiento de la producción de pks+ E. coli y colibactina, lo que ha llevado a un aumento de la tumorogénesis en un modelo de poliposis colis adenomatosa (Apc)Min/+ CRC tratado con DSS. Este experimento evalúa la expansión de pks+ E. coli en respuesta a la inulina dietética en un modelo murino sin inflamación ni barrera intestinal deteriorada.
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron conforme a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal tras la aprobación por parte del Comité Institucional de Cuidado Animal del Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM). Se obtuvieron ratones de siete semanas de una fuente comercial y se aclimataron durante una semana antes del inicio del experimento. Una representación esquemática de este método se presenta en la Figura 1. Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
Figura 1: Esquema de preparación y colonización de pks+ E.coli. Día (D)-4: Cuatro días antes de la gvage, comienza con antibióticos en ratones. D-1: 24 horas antes de la gavage, retirar los antibióticos. Prepara el cultivo de E. coli pks+ para incubación nocturna. D0: Prepara el inóculo bacteriano de pks+ E. coli. Administrar el pks+ E. coli o un control de vehículo (solución salina) a los ratones mediante gavage oral lo antes posible tras la preparación del inóculo. D7+ Recoger heces de ratones para la detección y cuantificación de la colonización por pks+ E. coli. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
1. Tratamiento con antibióticos
- Diluir ampicilina, colistina y estreptomicina en agua potable estéril hasta una concentración final de 1 mg/mL para ampicilina, 1 mg/mL para colistina y 5 mg/mL para estreptomicina.
- Permite el acceso ad libitum a antibióticos en agua potable durante 3 días.
- Retirar los antibióticos y restablecer el acceso al agua estéril durante un periodo de lavado de 24 horas antes del ataque con el inoculo NC101 de E. coli.
NOTA: La solución antibiótica debe prepararse fresca para cada experimento. Se debe controlar la ingesta adecuada de la solución antibiótica. Si es necesario, se puede añadir un edulcorante al agua.
2. Preparación del inóculo NC101 de E. coli (hasta n = 12 ratones)
NOTA: Los pasos 2.1-2.8 deben realizarse utilizando técnica aséptica.
- Prepara y autoclave Caldo de Lisogenia (LB).
- Estría E. coli NC101 desde el material de glicerol sobre una placa de agar LB usando un lazo inoculador estéril. Incubar durante la noche a 37 °C.
- Inocular 5 mL de caldo LB estéril en un tubo de cultivo con una sola colonia desde la placa de agar LB utilizando un lazo inoculador. Incubar durante la noche a 37 °C en un shaker de incubación de mesa a 150 rpm.
- Centrifuga el tubo de cultivo a 1500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Retira y descarta el sobrenadante, evitando el pellet bacteriano, que aparecerá como un depósito blanco roto en la base del tubo.
- Resuspende la pellet bacteriana en 5 mL de solución salina estéril al 0,9%.
- Lava repitiendo los pasos 4 a 6.
- Mide la densidad óptica a 600 nm (OD600) usando un densímetro celular y ajusta el OD600 a 0,625 (~1 x 108 CFU/ratón) usando solución salina estéril.
NOTA: Para evitar contaminación bacteriana del caldo en el paso 3, incuba un tubo aparte de 2-3 mL de caldo LB estéril durante la noche. El caldo debe permanecer claro tras la incubación nocturna, lo que indica que no hay contaminación bacteriana. Si el ODinicial 600 es inferior a 0,625, repite los pasos 4 a 6, usando un volumen menor para volver a suspender el pellet. Para asegurar una dosis precisa de E. coli NC101, las diluciones en serie del líquido gavage deben emplatarse y cultivarse durante toda la noche. El número de UFC para cada dilución puede utilizarse para estimar la cantidad inicial de UFC en la suspensión bacteriana.
3. Gavage oral de E. coli NC101
- Agita suavemente el inóculo bacteriano para asegurar una distribución igual de bacterias.
- Coloca la aguja gavage en una jeringuilla de 1 mL y llénala con 0,2 mL de inoculo bacteriano, eliminando cualquier burbuja de aire.
- Saca al ratón de la jaula y sujeta suavemente pero con firmeza la piel desde justo detrás de las orejas hasta los omóplatos, usando la almohadilla del pulgar y el lateral del índice. Asegura la cola con el dedo medio o anular de la misma mano.
- Sujeta al ratón en posición vertical e inserta la aguja de gavage en el lateral de la boca. Desliza el extremo de la aguja de gavage por el paladar y hasta el esófago y el estómago, empujando suavemente la cabeza del ratón hacia atrás para extender el cuello. Si se siente alguna resistencia, retira la aguja de gavage. Vuelve a hacer el recerrojo del ratón si es necesario antes de intentarlo de nuevo.
- Inyecta lentamente el inóculo bacteriano (0,2 mL) y retira la aguja, siguiendo el mismo ángulo que la inserción.
- Devuelvo al ratón a la jaula y procede con los ratones restantes.
NOTA: El inóculo bacteriano debe administrarse lo antes posible después de la preparación. Los ratones de control deben recibir 0,2 mL de solución salina estéril al 0,9% (vehículo). La longitud, calibre y diámetro de la bola adecuadas de la aguja de gavage deben determinarse en función del peso corporal medio de los ratones en cada experimento. Comprueba el patrón de respiración y la actividad del ratón después de 5 minutos y antes de salir de la instalación animal. Si se observa dificultad respiratoria/respiración, se eutanasia al ratón siguiendo un protocolo aprobado. El gavage oral solo debe ser realizado por personal de investigación formado. Una ejecución incorrecta del gavage oral puede provocar complicaciones graves o la muerte debido a una perforación esofágica o la inyección del líquido del gavage en los pulmones. Cuando la realiza personal de investigación experimentado, no se espera mortalidad con este procedimiento. Los ratones utilizados en este experimento deben estar alojados bajo condiciones de SPF. Para evitar la contaminación entre jaulas, deben usarse jaulas ventiladas individualmente y manipular los ratones en un armario de seguridad biológica. Antes de abrir cada jaula, se deben limpiar las manos y el exterior de la tapa con un desinfectante adecuado (por ejemplo, peróxido de hidrógeno acelerado). Los requisitos de EPP para manipular ratones utilizados en este protocolo incluyen una bata (desechable o reutilizable) y guantes. La instalación de animales hospedadores puede requerir EPI adicional. Todas las manipulaciones que involucren ratones control deben realizarse primero.
4. Recogida de muestras fecales
- Recoge una pelota fecal de cada ratón en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL sujetando al ratón como se describe en el paso 3.3. El ratón debería defecar inmediatamente. Alternativamente, coloca al ratón en una jaula limpia y vacía y espera hasta 30 minutos a que ocurra la deserción.
- Congela la muestra de repente colocando el tubo en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a -80 °C hasta un análisis adicional.
NOTA: La detección de ClbA o cuantificación de ClbP en heces mediante PCR en tiempo real debe realizarse antes del inicio del experimento para verificar que los ratones no estén colonizados con pks+ E. coli. Para mantener la colonización más allá de una semana, puede ser necesario el gavage bacteriano recurrente sin la preadministración de antibióticos (pasos 2.1-3.6), dependiendo de las condiciones experimentales. La cuantificación de E. coli NC101 en heces mediante recuperación de UFC o PCR en tiempo real debe realizarse al menos semanalmente durante la duración del experimento al implementar este protocolo por primera vez para optimizar la frecuencia de dosificación.
5. Extracción de ADN de bacterias fecales
- Extrae ADN bacteriano de muestras de heces recogidas utilizando un kit de extracción de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro y ajusta la concentración de ADN a 5 ng/μL.
6. Confirmación de la colonización mediante la detección de los genes 16S de ClbA y E. coli
- Realizar la amplificación simultánea de los genes de ARN ribosómico (ARNrr) 16S de ClbA y E. coli (Tabla Suplementaria 1) mediante PCR utilizando una mezcla maestra y un instrumento apropiados para PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Visualiza los genes 16S de clbA y E. coli en ratones colonizados por E. coli NC101 mediante electroforesis en gel de agarosa como se describióanteriormente 19. Los ratones no colonizados deberían carecer de la banda clbA .
7. Cuantificación de E. coli NC101 mediante recuperación de UFC
NOTA: Realiza los pasos 7.1-7.7 utilizando la técnica aséptica.
- Pesa un tubo vacío de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Añade aproximadamente 20 mg de heces al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y anota el peso del tubo con la muestra añadida.
- Añade 200 μL de solución salina estéril al 0,9% a cada tubo.
- Espera 10-15 minutos a que las heces se ablanden a temperatura ambiente y haz un vórtice en cada tubo durante 5 minutos a máxima velocidad para obtener una suspensión homogénea. Pequeñas partículas de alimento no digerido serán visibles.
- Transfiere 100 μL de cada suspensión a una placa de agar MacConkey y distribuye uniformemente el homogeneado usando un separador en forma de L.
- Incuba las placas durante la noche a 37 °C.
- Cuenta el número de colonias rosas y normaliza por el peso de cada pellet fecal y el volumen placado.
NOTA: El agar MacConkey selecciona bacterias gramnegativas. Además, las bacterias que pueden fermentar la lactosa (como E. coli) forman colonias rosadas, mientras que las que no pueden forman colonias incoloras o amarillas. Solo se deben contar las colonias rosas para los fines de este protocolo. Si el número de colonias es demasiado elevado para contar, se pueden realizar diluciones seriadas del homogenado inicial usando solución salina estéril al 0,9%. Ten en cuenta el factor de dilución al calcular el número de colonias por muestra.
Peso del pellet = peso del tubo de microcentrífuga con la muestra de pellet - peso del tubo vacío de la microcentrífuga.
8. Cuantificación del gen clbP
- Realizar la amplificación de los genes de rRNA 16S (Tabla Suplementaria 1) mediante PCR cuantitativa utilizando una mezcla maestra y un instrumento apropiados para PCR en tiempo real siguiendo las instrucciones del fabricante.
9. Cuantificación de Enterobacteriaceae
- Realizar la amplificación de los genes de ARN Enterobacteriaceae y universales 16S (suplementaria) mediante PCR cuantitativa utilizando una mezcla maestra y un instrumento apropiados para PCR en tiempo real.
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Resultados
La amplificación y visualización de los genes ClbA y E. coli 16S en heces en el punto final mediante PCR y electroforesis en gel mostraron que, aunque ambos genes eran visibles en ratones colonizados por E. coli NC101, solo el gen E. coli 16S era visible en ratones control, confirmando que E. coli NC101 no estaba presente (Figura 2B).
Como seesperaba, 15 ratones ...
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Discusión
Los efectos pro-cancerígenos de la pks+ E. coli productora de colibactina se han asociado recientemente tanto con el aumento de la CRC9 de inicio temprano como con la adopción de una dieta "estilooccidental" 12, factores que seguirán marcando las tendencias de la CRC en las próximas décadas. La mayoría de los modelos de colonización de pks+ E. coli se muestran en el contexto del cáncer asociado a la colitis, que no permite...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud [CIHR, subvención CSV-198232]. Agradecemos a la clínica veterinaria de la CRCHUM. Las figuras se crearon usando BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,9% solución salina estéril | Baxter | JF7634 | |
| Dieta personalizada de 10% de inulina | Teklad | TD.240286 | Resultados representativos |
| 50 ppm FeS04 (sin fibra) dieta personalizada | Teklad | TD.120515 | Resultados representativos |
| Hembra de ratón B6 de 8 a 12 semanas | Laboratorios Charles River | C57BL/6 | Resultados representativos y nbsp; |
| Ampicilina sal sódica y nbsp; | Wisent Inc | 400-110 XG | |
| Centrífuga de mesa | Fisher Scientific | 75004381 | |
| Medidor de densidad celular | Biochrom | 80-2116-30 | |
| Tubo de cultivo, 13 mL | Sarstedt | 62.515.006 | |
| ECNC101 | N/A | N/A | Donado por el Dr. Christian Jobin, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill |
| Aguja Gavage, 38mm x 22 G | Aparato de Harvard Canadá | 34-024 | Ya no disponible - Una posible alternativa está disponible en Instech Labs (FTP-22-38) y nbsp; |
| Agitador orbital incubador | VWR | 980153 | |
| Bucle inoculante | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Separador en forma de L | Fisher Scientific | 14-665-230 | |
| Caldo de lisogenia | Wisent Inc | 800-060 LG | Añade 35g de LB de polvo y 1L de agua. Autoclave antes de usar. |
| Caldo de lisogénia agar | Wisent Inc | 800-011 LG | Añade 35g de LB de polvo y 1L de agua. Autoclave antes de usar. |
| Agar MacConkey | Becton Dickinson | 211387 | Añade 50g de polvo MacConkey a 1L de agua. Autoclave antes de usar. |
| Kit de extracción de ADN microbiano | Qiagen | 47016 | |
| Incubadora microbiológica | Fisher Scientific | 150152633 | |
| Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL | UltiDent Scientific | 73-M150-C | |
| Rotor de PCR - Tubos de tira genética | UltiDent Scientific | 73-V100-RG | |
| Placa de Petri | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PCR en tiempo real SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| Ciclador térmico de PCR en tiempo real | Investigación Corbett | RG-3000A | |
| Tubo de tapa de rosca, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Colistostimetano sódico y nbsp; | Fresenius Kabi | C309306 | |
| Sal de sulfato de estreptomicina | Millipore Sigma | S9137 | |
| Tubo deslizante de tuberculina, 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | |
| Vórtice | Fisher Scientific | 12-812 |
Referencias
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