Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la timoquinona sobre el estrés oxidativo, la vía de señalización Keap-1/Nrf-2 y el comportamiento en el plasma, la corteza cerebral y el hipocampo de ratas expuestas al bisfenol A.
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Artículo de método
Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la timoquinona sobre el estrés oxidativo, la vía de señalización Keap-1/Nrf-2 y el comportamiento en el plasma, la corteza cerebral y el hipocampo de ratas expuestas al bisfenol A.
La exposición crónica en dosis bajas al bisfenol A (BPA), un disruptor endocrino ambiental ampliamente utilizado, se ha asociado cada vez más con neurotoxicidad mediada por estrés oxidativo. La timoquinona (TQ), un componente bioactivo de Nigella sativa, presenta potentes propiedades antioxidantes; sin embargo, su potencial neuroprotector contra la toxicidad inducida por el BPA sigue siendo incompletamente comprendido. Dada la naturaleza generalizada de la exposición al BPA, identificar estrategias neuroprotectoras eficaces y accesibles es cada vez más importante. Este estudio investigó los efectos de la QT sobre el estrés oxidativo, la señalización de Keap-1/Nrf-2, el comportamiento y las alteraciones histopatológicas en ratas expuestas al BPA. Un total de 24 ratas Wistar Albinas machos adultos fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n = 6/grupo): control, BPA, BPA + 10 mg/kg de QT (BPA+TQ I) y BPA + 20 mg/kg de QT (BPA+TQ II). El BPA (50 μg/kg) y el QT se administraron de forma intragástrica durante 30 días. La exposición al BPA indujo deterioros conductuales significativos, estrés oxidativo, alteración de la señalización de Keap-1/Nrf-2 y daños histopatológicos marcados en el hipocampo y la corteza cerebral. El tratamiento con TQ mejoró significativamente la actividad locomotora y el comportamiento similar a la depresión, redujo la peroxidación lipídica y los niveles de óxido nítrico, restauró la capacidad antioxidante relacionada con el glutatión y normalizó la expresión de Keap-1 y Nrf-2 (p < 0,001). Estos efectos protectores eran más pronunciados con la dosis de TQ más alta. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la timoquinona mitiga la neurotoxicidad inducida por el BPA mediante la modulación del estrés oxidativo y la vía de señalización Keap-1/Nrf-2, destacando su potencial como agente neuroprotector frente a la exposición al BPA relevante para el medio ambiente.
El bisfenol A (BPA) es un compuesto sintético ampliamente utilizado en plásticos y resinas epoxi y se detecta comúnmente en materiales de envasado alimentario, sistemas de agua, dispositivos médicos y productosdomésticos. La exposición continua al entorno ha generado preocupaciones sobre sus posibles efectos neurotóxicos, especialmente en condiciones crónicas de baja dosis que reflejan la exposición humana real.
Aunque agencias reguladoras como la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) y la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. han definido 50 μg/kg/día como el nivel sin efectos adversos observados, la evidencia experimental y epidemiológica emergente indica que pueden producirse alteraciones conductuales y cognitivas en dosis más bajas. En consecuencia, la ingesta diaria tolerable europea se ha reducido a 4 μg/kg/día, subrayando la necesidad de investigar los efectos mecanicistas de la exposición al BPA relevantepara el medio ambiente 1,2.
El estrés oxidativo se considera un mecanismo central subyacente a la neurotoxicidad inducida por el BPA. El BPA altera el equilibrio redox celular al disminuir defensas antioxidantes como el glutatión (GSH) y aumentar los marcadores de peroxidación lipídica, incluyendo el malondialdehído (MDA)3,4. Sin embargo, los mecanismos reguladores aguas arriba que controlan las respuestas antioxidantes bajo exposición al BPA siguen siendo insuficientemente caracterizados.
La vía de la proteína asociada a ECH similar al kelch (Keap-1)/factor eritroide 2 relacionado (Nrf-2) es un mecanismo de defensa antioxidante endógeno principal. Bajo condiciones de estrés oxidativo, Nrf-2 se disocia de Keap-1, se transloca al núcleo y activa la expresión génica dependiente de elementos de respuestaantioxidante 5. A pesar de su papel establecido en la defensa celular, la modulación específica de la señalización de Keap-1/Nrf-2 en el cerebro durante la exposición a BPA relevante para el medio ambiente no ha sido investigada de forma exhaustiva junto con los resultados conductuales.
La timoquinona (TQ), el principal componente bioactivo del aceite de semilla de Nigella sativa, es una benzoquinona lipofílica capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. TQ presenta propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y apoptóticas, en parte gracias a la activación de la señalización de Nrf-2 y al aumento de la capacidad antioxidanteendógena 5,6. Aunque estudios previos han demostrado los efectos protectores de la TQ en varios modelos de neurotoxicidad, falta un enfoque metodológico integrado que evalúe marcadores de estrés oxidativo, la señalización de Keap-1/Nrf-2 y parámetros conductuales dentro del mismo paradigma de exposición alBPA 5,6,7.
Aquí describimos un protocolo experimental reproducible para evaluar biomarcadores de estrés oxidativo, expresión de la vía Keap-1/Nrf-2 y alteraciones conductuales en un modelo de rata de exposición al BPA ambientalmente relevante, y para evaluar los efectos neuroprotectores de la timoquinona en múltiples regiones cerebrales.
Planteamos la hipótesis de que la exposición a bajas dosis de BPA induce alteraciones conductuales mediante la desregulación mediada por el estrés oxidativo de la vía de señalización Keap-1/Nrf-2, y que la timoquinona mitiga estos efectos restaurando el equilibrio redox y activando respuestas antioxidantes dependientes de Nrf-2.
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Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Local de Ética de Experimentación Institucional con Animales (Aprobación: 68429034/07).
Animales y diseño experimental
Se obtuvieron veinticuatro ratas albinas Wistar machos adultos (200-250 g) del Laboratorio de Investigación Experimental con Animales y alojadas individualmente bajo condiciones controladas (ciclo claro/oscuro de 12 horas, 24 ± 2 °C) con acceso ad libitum a comida estándar y agua del grifo. Los animales se aclimataron a condiciones de laboratorio antes del experimento, que duró 32 días.
Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a grupos experimentales utilizando un método de aleatorización simple generado por ordenador para minimizar el sesgo de selección, asignando el mismo número de animales a cada grupo (n = 6/grupo): control, BPA, BPA + 10 mg/kg de timoquinona (BPA + TQ I) y BPA + 20 mg/kg de timoquinona (BPA + TQ II). El tamaño de la muestra se determinó mediante un análisis de potencia a priori utilizando el software G*Power (versión 3.1). Basándose en los tamaños de efecto reportados en estudios previos 5,6,7 que evaluaban la neurotoxicidad inducida por BPA y las intervenciones antioxidantes, especialmente para medidas de resultados bioquímicas y conductuales, se asumió una potencia estadística de 0,80 para ANOVA unidireccional. En estas condiciones, se requería un mínimo de seis animales por grupo para detectar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales.
BPA (50 μg/kg) y TQ (10 o 20 mg/kg) se administraron intrágicamente por gavage una vez al día durante 30 días. Todos los tratamientos se prepararon y se administraron con un volumen total de 1 mL/kg. La dosis de BPA utilizada en el presente estudio (50 μg/kg/día) fue seleccionada en función de su designación como nivel sin efectos adversos observados y dosis de referencia por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. Esta dosis se ha utilizado ampliamente en estudios experimentales para modelar la exposición al BPA relevante para el medio ambiente y para investigar posibles alteraciones neuroconductuales y bioquímicas que ocurren en niveles de exposición previamente considerados seguros. Es importante destacar que la acumulación de evidencia experimental indica que efectos neurológicos y conductuales adversos pueden ocurrir a esta dosis o por debajo de ella, lo que respalda su relevancia para evaluar la toxicidad de BPA en dosisbajas 1,2. La selección de las dosis de TQ (10 y 20 mg/kg) se basó en estudios experimentales previos que demostraron su eficacia neuroprotectora y antioxidante sin inducir toxicidad 5,6,7. Estas dosis se han utilizado ampliamente en modelos de roedores relacionados con neurotoxicidad, estrés oxidativo y neuroinflamación, y están muy por debajo de los umbrales de toxicidad reportados para administraciones repetidas. No se realizó ningún estudio piloto de localización de dosis; La selección de la dosis se guió por la precedencia de la literatura y estableció perfiles de seguridad para garantizar tanto la eficacia como la relevancia traslacional.
Se administró BPA durante 30 días consecutivos. Las evaluaciones conductuales se realizaron los días 31 y 32 tras la exposición final. Los animales fueron sacrificados al día 32 tras completar todas las pruebas de comportamiento. Este calendario fue diseñado para permitir tiempo suficiente para la evaluación conductual, minimizando al mismo tiempo los posibles efectos de confusión de la manipulación aguda o el estrés procedimental en análisis bioquímicos, moleculares e histopatológicos posteriores. La timoquinona se administró una vez al día inmediatamente después del BPA por la misma vía intragástrica. Se realizaron pruebas de comportamiento tras las administraciones finales de BPA y TQ. La cronología experimental se resume en la Figura 1.
Medición del peso corporal
El peso corporal se midió utilizando una balanza digital calibrada de precisión (sensibilidad ±0,1 g). Cada rata fue pesada individualmente por la mañana antes de la administración del tratamiento, y se registraron mediciones en los días 1, 10, 20 y 32 bajo condiciones estandarizadas para minimizar la variabilidad (Figura 2).
Evaluaciones conductuales
Todos los parámetros de comportamiento fueron puntuados por un solo observador cegado ante la asignación de grupos para minimizar el sesgo y la variabilidad entre observadores. Los animales se acostumbraron a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento para reducir el estrés inducido por la novedad.
El uso combinado de la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST) permite una evaluación exhaustiva de la toxicidad neuroconductual inducida por el BPA, ya que se ha demostrado que el BPA altera tanto la reactividad emocional como la actividad locomotora enroedores 2,3. Se consideraron los resultados locomotores derivados de la OFT durante la interpretación de la inmovilidad de FST para minimizar los posibles efectos de confusión relacionados con la alteración de la actividad motora.
FST: El comportamiento similar a la depresión se evaluó mediante la prueba de natación forzada en el día 32, precedida de una sesión previa a la prueba de 15 minutos realizada 24 horas antes. Las ratas se colocaban individualmente en tanques cilíndricos (35 cm de diámetro, 50 cm de altura) llenos de agua (30 cm de profundidad, 25 ± 1 °C) y se les dejaba nadar durante 5 minutos. Se registraron conductas de inmovilidad, natación y escalada usando una cámara de vídeo y analizadas fuera de línea para evaluar la desesperaciónconductual 7.
OFT: El comportamiento similar a la ansiedad y la actividad locomotora espontánea se evaluaron mediante la prueba de campo abierto en el día 31. Cada rata se colocó individualmente en una arena blanca de Plexiglás (90 cm x 35 cm) dividida en 24 cuadrados iguales y se dejó explorar libremente durante 5 minutos. Los movimientos se grababan mediante una cámara de vídeo. El tiempo pasado en zonas centrales y periféricas y el número de cruces con las cuatro patas se cuantificaron como índices de comportamiento y locomoción relacionados con laansiedad 8.
Recogida de muestras
En el día 32, las ratas fueron profundamente anestesiadas con ketamina intramuscular (45 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se confirmó una profundidad adecuada de anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del pedal. Se recogió sangre mediante punción cardíaca con una jeringuilla estéril, y se obtuvieron aproximadamente 3-5 mL de sangre de cada animal. La eutanasia se completó mediante exanguinación bajo anestesia profunda. Las muestras de sangre se transfirieron a tubos que contenían anticoagulantes y centrifugaron a 3.000 x g durante 10-15 minutos a 4 °C. El plasma separado fue aliquotado y almacenado a −80 °C hasta el análisis bioquímico.
El hipocampo y el hemisferio cerebral izquierdo fueron rápidamente diseccionados, pesados, congelados bruscamente en nitrógeno líquido y almacenados a −80 °C para análisis bioquímicos posteriores, mientras que el hemisferio cerebral derecho se fijó en formalina neutral amortiguada al 10% para evaluaciones histopatológicas e inmunohistoquímicas. Para garantizar la consistencia metodológica y minimizar la variabilidad entre muestras, el hemisferio izquierdo se asignó sistemáticamente para mediciones bioquímicas y el hemisferio derecho para análisis morfológicos en todos los animales. Es importante destacar que la fijación de formalina se limitó estrictamente a tejidos designados para procedimientos histológicos e inmunohistoquímicos, y no se utilizó tejido fijo para ensayos bioquímicos basados en proteínas, evitando así la degradación de proteínas relacionadas con la fijación. Para las evaluaciones bioquímicas, se homogeneizaron cantidades definidas de tejido cerebral congelado (típicamente 50-100 mg por ensayo) utilizando tampones de homogeneización específicos del ensayo y proporciones estandarizadas tejido-tampón según los requisitos de cada parámetro bioquímico. Todos los análisis se realizaron utilizando cantidades tisulares iguales dentro de cada ensayo entre los grupos experimentales.
La concentración total de proteínas en los homogeneados tisulares se determinó mediante un ensayo proteico fluorométrico según las instrucciones del fabricante. Todos los parámetros bioquímicos se midieron utilizando concentraciones estandarizadas e iguales de proteínas en cada ensayo para asegurar la comparabilidad entre muestras y grupos experimentales.
Evaluación de parámetros de estrés oxidativo
La peroxidación lipídica se evaluó midiendo los niveles de MDA utilizando el método de sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) en muestras de plasma ytejido 7. Los niveles reducidos de tiol (RSH) y GSH se determinaron espectrofotométricamente utilizando ensayos basados en 5,5′-ditiobi (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) 7. Los niveles totales de óxido nítrico (NO) en los homogeneados plasmáticos y tisulares se midieron utilizando la reacción de Griess tras la reducciónde nitratos 7. Todos los parámetros bioquímicos se expresan como proteína nmol/g o tejido μmol/g, como se indica en la Figura 3 y la Figura 4. Todos los ensayos bioquímicos se realizaron en duplicado y se utilizaron valores medios para análisis estadísticos.
Además de los análisis del tejido cerebral, se realizaron estimaciones bioquímicas en muestras de sangre para evaluar el estado oxidativo sistémico inducido por la exposición al BPA. Los niveles de peroxidación lipídica plasmática se determinaron mediante el método TBARS, y los resultados se expresaron como equivalentes MDA. Se midieron los niveles reducidos de sulfhidril (RSH) usando DTNB, y los niveles totales de NO se evaluaron usando la reacción de Griess tras la reducción de nitratos, como se describióanteriormente 7. Los valores de absorbancia se registraron espectrofotométricamente a 532 nm (TBARS), 412 nm (RSH) y 540 nm (NO). Todos los ensayos se realizaron en duplicado bajo condiciones estandarizadas.
El BPA es un tóxico ambiental ubicuo que entra en la circulación sistémica y ejerce efectos multiorgánicos; Por lo tanto, los marcadores de estrés oxidativo circulantes proporcionan información complementaria que refleja el desequilibrio redoxgeneral 1,2. La evaluación de parámetros bioquímicos basados en la sangre permite evaluar la relación entre alteraciones oxidativas centrales y periféricas y aumenta la relevancia traslacional de los hallazgos, ya que estos marcadores se utilizan comúnmente en estudios ambientales y clínicos para monitorizar la toxicidad relacionada con la exposición.
Análisis de Western blot
Se realizó un análisis de Western blot para determinar los niveles de proteínas Keap-1 y Nrf-2 en el tejido hipocampal. Aproximadamente 50 mg de tejido se homogeneizaron en 500 μL de buffer RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasas. Los homogeneados se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogieron los sobrenacionantes. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un ensayo de cuantificación fluorométrica de proteínas según las instrucciones del fabricante, y las concentraciones se calcularon a partir de una curva de calibración estándar. Se mezclaron cantidades iguales de proteína (30 μg) con tampón de Laemmli que contenía β-mercaptoetanol, se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas PVDF a 110 V durante 60-90 minutos. Las membranas se bloquearon con un 3% de BSA e incubadas durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Keap-1 y Nrf-2 (1:3000) y β-actina (1:1000), seguidas de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las bandas proteicas se visualizaron mediante quimiluminiscencia, y las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante análisis densitométrico y se normalizaron a β-actina.
Análisis histopatológico
Las muestras de tejido cerebral del hemisferio derecho se fijaron en formalina amortiguada al 10% de neutralidad durante 72 horas, deshidratadas mediante una serie de etanol graduado, eliminadas en xileno e incrustadas en parafina según procedimientos histológicosestándar 9. Los tejidos frescos se reservaron para análisis bioquímicos. Se obtuvieron secciones coronales (5 μm) en los niveles de la corteza hipocampal y entorrinal basándose en un atlas cerebralde rata 10. Se montaron cuatro secciones consecutivas por animal sobre portaobjetos de vidrio para evaluaciones histológicas e inmunohistoquímicas, asegurando un grosor de sección y una localización anatómica consistentes. Las secciones fueron desparafinizadas, rehidratadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) siguiendo los protocolos de tinciónrutinarios 11. El examen histopatológico se realizó mediante microscopía óptica por un único observador entrenado, cegado a los grupos experimentales, para minimizar el sesgo y eliminar la variabilidad entre observadores.
Análisis inmunohistoquímico
Se seleccionaron regiones de interés, incluyendo el hipocampo y la corteza entorrinal, en función de su vulnerabilidad a la neurotoxicidad inducida por el BPA y su papel en la regulación cognitiva y emocional 1,2. Se realizó una tinción inmunohistoquímica para Nrf-2 y Keap-1 en secciones cerebrales incrustadas en parafina. Las secciones se desparafinizaron en xileno, se rehidrataron mediante series graduadas de etanol y se sometieron a la extracción de antígenos inducida por calor en un tampón de citrato (pH 6,0). La actividad endógena de la peroxidasa se extinguió antes de la incubación.
Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Nrf-2 (1:100) y Keap-1 (1:200). La detección se realizó utilizando un sistema de detección de HRP basado en polímeros y disponible comercialmente, que contenía anticuerpos secundarios específicos de la especie conjugados a peroxidasa de rábano picante, según las instrucciones del fabricante. La inmunoreactividad se visualizó usando 3,3′-diaminobenzidina (DAB) como cromógeno, seguida de una contratinción con hematoxilina. Algunas secciones quedaron deshidratadas, limpias y cubiertas de resbalón.
Las secciones control negativas se procesaron en paralelo sin incubación primaria de anticuerpos. Para el análisis cuantitativo, se evaluaron tres secciones no adyacentes por animal. Las imágenes se adquirieron con la misma configuración de exposición para todos los grupos. Se analizaron dieciséis campos no solapados por sección utilizando el software ImageJ. Las regiones de interés se delimitaron manualmente, se restó la tinción de fondo y se expresó la inmunorreactividad como valor gris medio. Se calculó y utilizó el valor medio por animal para análisis estadísticos.
Puntuación histopatológica
Las alteraciones histopatológicas se evaluaron de forma semicuantitativa en secciones tintidas con H&E. Se examinaron diez campos seleccionados al azar y no solapados por sección, y se puntuaron los parámetros patológicos de forma independiente. La gravedad del daño en el hipocampo y la corteza entorrinal se evaluó mediante una escala de cuatro puntos basada en la proporción de células afectadas: puntuación 0 (<5%), puntuación 1 (≤ un tercio), puntuación 2 (de un tercio a dos tercios) y puntuación 3 (> dos tercios). Se utilizaron puntuaciones medias por animal para el análisis estadístico.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el software SPSS (versión 29.0) y se presentan como media ± desviación estándar (SD). El tamaño de la muestra se determinó en base a estudios previos y análisis de potencia, lo que indica que seis animales por grupo proporcionan un >80% de potencia para detectar diferencias biológicamente relevantes. La normalidad de la distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. La homogeneidad de las varianzas se evaluó mediante la prueba de Levene. Las comparaciones de grupo se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey. La significación estadística se estableció en p < 0,05.
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Peso corporal
No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el peso corporal entre los grupos en los días 1 y 32 del estudio (F(3,20)=2,750, p > 0,05; Figura 2).
Resultados de pruebas de comportamiento
El análisis de pruebas en campo abierto reveló que la exposición al BPA redujo significativamente la actividad locomotora, como lo indica un menor número de cruces e...
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El presente estudio evaluó los efectos del BPA, un componente estructural de plásticos policarbonatados considerados seguros por la USEPA a una dosis de 50 μg/kg 1,2, sobre el estrés oxidativo, la señalización de Keap-1/Nrf-2, el comportamiento y las alteraciones histopatológicas en el cerebro de la rata. Además, se investigaron los posibles efectos neuroprotectores de TQ, un compuesto natural con propiedades antioxidantes bien d...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Este proyecto fue apoyado por la Oficina de Coordinación de Proyectos de Investigación Científica de la Universidad (número de proyecto TIP. A4.24.003).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Scientific | 69-78-3 | |
| Benchtop centrifuge NF048 | Nüve | 43560 | |
| Beta_Actin | ThermoFisher Scientific, United States | 7D2C10 | |
| Bisphenol A | Merck | 239658 | |
| BSA solution | Proteintech, United States) | 66201-1-Ig | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma Aldrich | 128-37-0 | |
| Dijital Homojenizatör | Daihan Scientific | https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc | |
| Hematoxylin–eosin | Bio Optica | W01030708 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 7647-01-0 | |
| Image J software program | NIH; Washington, U.S.A. | https://imagej.net/ij/ | |
| Immunohistochemical staining kit | Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalent | HRP, TA-125-HL | |
| Leica Autocut 14051956472 | Germany | https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/ | |
| Light microscope | Nikon, Eclipse | Ni-U, 940728 | |
| N-(1-Naphthyl)ethylenediamine | Thermo Scientific | 1465-25-4 | |
| Nano Microplate Reader | BMG LABTECH | SPECTROstar Nano | |
| phosphate-buffered saline | Merck | P4417 | |
| Primary antibodies Keap-1 | Proteintech | Cat No. 10503-2-AP, 1:200 | |
| Primary antibodies Nrf-2 | Proteintech | Cat No. 16396-1-AP, 1/100 | |
| Qubit Protein BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific-INVITROGEN | Q33211 | |
| sodium citrate | Merck | 03-04-6132 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo Scientific | 151-21-3 | |
| sodium hydroxide | Merck | 1310-73-2 | |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | |
| Streptavidin Peroxidase | Thermo Scientific | SHRP248-B | |
| sulfanilamide | Thermo Scientific | 63-74-1 | |
| thiobarbituric acid | Merck | 504-17-6 | |
| TQ | CAYMAN | 490-91-5 | |
| Tricarballylic acid, 99% | Thermo Scientific Chemicals | 139360500 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Scientific Chemicals | 76-03-9 | |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | |
| Vanadium(III) chloride | Sigma Aldrich | 7718-98-1 | |
| West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750 | Thermo Fisher Scientific system | https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE | |
| Zinc sulfate solution | Merck | 7733-02-0 |
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