Expresión de HMGA1 y HAND1 y su importancia en los tejidos del cáncer de larina

Resumen

Esta investigación descubrió niveles aumentados de HMGA1 y disminución de la expresión de HAND1 en el cáncer de laringe, lo que indica una relación inversa y asociaciones significativas con la metástasis y la fase clínica, lo que sugiere que ambos contribuyen a la progresión tumoral.

Resumen

Este estudio investigó los perfiles de expresión de los genes HMGA1 y HAND1 en carcinoma escamoso laríngeo (LSCC), así como en tejidos mucosos laríngeos normales adyacentes, mediante la aplicación de inmunohistoquímica y metodologías RT-PCR. El objetivo era investigar sus posibles roles en la iniciación, avance, invasión y metástasis del LSCC. Tanto HMGA1 como HAND1 se detectaron en tejidos cancerosos y en tejidos normales adyacentes. No obstante, HMGA1 mostró una expresión significativamente elevada en los tejidos de LSCC, mientras que HAND1 mostró niveles de expresión considerablemente reducidos. La expresión elevada de HMGA1 se asoció positivamente con metástasis ganglionaria (100,0% frente a 50,0%) y en estadio clínico avanzado (91,7% frente a 44,4%), pero no se asoció con el grado histológico tumoral, el tipo clínico ni la edad del paciente. En contraste, la reducción de la expresión de la proteína HAND1 se asoció con metástasis ganglionaria, estadio clínico y grado patológico, lo que sugiere un papel en la progresión y metástasis tumoral. Además, se observó una correlación lineal negativa entre las expresiones de HMGA1 y HAND1, lo que sugiere una posible interacción reguladora en la que HMGA1 podría suprimir la expresión de HAND1. Estos resultados implican que HMGA1 y HAND1 tienen funciones complementarias en la patogénesis de las CCL, siendo HMGA1 potencialmente facilitando el desarrollo tumoral y HAND1 actuando como supresor. La interacción entre estos dos genes puede ofrecer nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que impulsan la progresión y metástasis de las LSCC.

Introducción

El cáncer de laringe es el segundo tumor maligno primario más común en cabeza y cuello, después del cáncer nasofaíngeo, representando entre el 26% y el 30% de todos los tumores de cabeza y cuello en^{todo el mundo.} Más del 90% de los cánceres de laringe se clasifican como carcinoma escamoso de células laríngeas (LSCC⁾². Los tratamientos principales para el cáncer de laringea son la cirugía y la radioterapia. La recurrencia local y la metástasis ganglionar son las principales causas de muerte en pacientes con cáncer de laringe. Por lo tanto, el manejo eficaz de la recurrencia y la metástasis sigue siendo un gran desafío clínico. Con el avance de la biología molecular, se han identificado varios genes con expresión anormal en el cáncer de laringe. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de laringe siguen sin estar claros y siguen siendo un área que requiere más investigaciones.

Las proteínas del grupo A de alta movilidad (HMGA) son proteínas que se unen a la cromatina no histonas y se encuentran en el núcleo celular. HMGA1 se une al ADN y a las proteínas asociadas, induciendo alteraciones estructurales de la cromatina que regulan la transcripción^{génica 3}. Como regulador transcripcional asociado a la cromatina, HMGA1 modula la expresión de múltiples genes relacionados con tumores implicados en la proliferación y metástasis. Estudios previos han demostrado que HMGA1 está sobreexpresado en una amplia gama de cánceres humanos, incluyendo tiroides, colorectal, páncreas, y malignidades de cabeza y^cuello 4,5,6,7, así como en otros tumores epiteliales y sólidos reportados en la literatura. HMGA1 regula la tumorogénesis modulando la expresión de múltiples genes diana aguas abajo implicados en la proliferación y metástasis⁸.

Los genes expresados por el corazón y la cresta neural (HAND) son miembros de la familia bHLH (hélice–bucle básico–hélice), incluyendo HAND1 y HAND2. HAND1, como factor de transcripción, desempeña un papel en la diferenciación de trofoblastos y el desarrollo del^{corazón 9}. Sin embargo, el mecanismo de expresión de HAND1 en la capa celular extraembrionaria sigue sin estar claro. Se ha confirmado que HMGA1 se une directamente al promotor HAND1, inhibiendo su actividad tanto in vivo como in^{vitro 10}. HAND1, como proteína represora, ha estado implicada en la regulación de la diferenciación celular y la formación del cáncer. Los estudios han encontrado que la expresión de HAND1 está silenciada e hipermetilada en el cáncer gástrico humano¹¹, cáncer de^{páncreas 12}, cáncer de^{ovario 13} y cáncer de^{tiroides 14}. Sin embargo, hasta donde sabemos, pocos estudios han investigado la expresión de HAND1 en tejidos de cáncer de laringe.

En el presente estudio, se utilizaron inmunohistoquímica (método de detección en dos pasos) y reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR) para detectar la expresión de proteínas HMGA1 y HAND1 y ARNm en LSCC y tejidos mucosas normales adyacentes. La inmunohistoquímica permite la visualización de la localización de proteínas dentro de la arquitectura tisular, mientras que la RT-PCR permite la detección sensible de la expresión génica a nivel transcripcional, proporcionando información complementaria sobre los patrones de expresión de proteínas y ARNm. En comparación con la PCR cuantitativa (qPCR), que ofrece mayor sensibilidad y cuantificación precisa, Western bloting, que permite la validación a nivel de proteína pero carece de contexto espacial, y la secuenciación de ARN (RNA-seq), que proporciona un perfil transcriptómico completo pero requiere análisis computacional avanzado, el uso combinado de inmunohistoquímica y RT-PCR representa una estrategia rentable y clínicamente aplicable para la investigación de biomarcadores. El estudio tuvo como objetivo explorar el papel y la correlación de estos dos factores en la ocurrencia, desarrollo, progresión y metástasis de las CCL. Además, evaluar la expresión de HMGA1 y HAND1 puede proporcionar biomarcadores para el diagnóstico y la evaluación pronóstica en el cáncer de laringe, mejorando potencialmente la estratificación del riesgo y facilitando la toma de decisiones clínicas.

Protocolo

Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital Popular Shijiazhuang (Aprobación: Nº YKLS 2026 Nº 041; 27 de marzo de 2026). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Reglamento sobre la Revisión Ética de la Investigación Biomédica que Involucra a Sujetos Humanos, el Reglamento sobre la Revisión Ética de las Ciencias de la Vida y la Investigación Médica que Involucra a Sujetos Humanos, la Declaración de Helsinki y las Directrices Éticas Internacionales para la Investigación Relacionada con la Salud que Involucra a Humanos. Se obtuvieron muestras de tejido humano de muestras quirúrgicas archivadas en cumplimiento de los requisitos éticos institucionales, garantizando la anonimización y confidencialidad de los datos de los pacientes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes, o el comité de ética concedió una renuncia al consentimiento para el uso de especímenes archivados anonimizados, según corresponda.

Materiales experimentales

Origen de los ejemplares

Se obtuvieron un total de 42 casos de tejidos de LSCC y 25 casos de mucosa laríngea normal adyacente a partir de muestras de resección quirúrgica de LSCC en el Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello de Hebei entre febrero de 2011 y agosto de 2012. Entre ellos, 25 casos de mucosa normal adyacente (tomados de un sitio > 1,0 cm del borde del cáncer) fueron confirmados patológicamente como mucosa inflamatoria o normal. Las 42 muestras de LSCC fueron todas confirmadas patológicamente como carcinoma de células escamosas. Todos los pajidos se almacenaban a -80 °C. Los 42 pacientes eran hombres, sin pacientes mujeres. Entre los casos de LSCC, 15 estaban bien diferenciados, 18 moderadamente diferenciados y 9 poco diferenciados. Dieciocho casos presentaron metástasis ganglionarias, mientras que 24 no. La estadificación clínica se basó en el sistema de clasificación y estadificación TNM (UICC, 2002), con 20 casos en las etapas I y II, y 22 casos en las etapas III y IV. Hubo 30 casos de tipo supragótico, 11 casos de tipo glótico y 1 caso de tipo subgótico. El rango de edad de los pacientes era de 40 a 75 años, con una edad media de 60 años. Ninguno de los pacientes recibió radioterapia ni quimioterapia antes de la cirugía, y los datos clínicos estaban completos.

Métodos y pasos experimentales

Procedimiento de tinción con HE

Preparación de portaobjetos y tinción por hematoxilina–eosina

Las láminas de vidrio para inmunohistoquímica se remojaban primero en ácido concentrado durante 24 horas, seguidas de un lavado a fondo bajo agua del grifo corriente durante al menos 10 minutos para eliminar el ácido residual, y una inmersión en agua destilada durante 30 minutos dos veces con una agitación suave para asegurar un enjuague completo. Tras remojarlos en etanol al 95% durante 2 horas, las láminas se secaron en un horno a 60 °C y luego se sumergieron en una mezcla de acetona APES (1:49, v/v) durante 1 minuto, agitando suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme, seguido de un enjuague con acetona pura. Finalmente, se secaron al aire a temperatura ambiente (20–25 °C) para asegurar la correcta adhesión tejidal durante los procedimientos de tinción posteriores.

Las secciones de tejido incrustadas en parafina se sumergieron secuencialmente en xileno I y xileno II durante 10 minutos cada una para eliminar la parafina, seguidas de rehidratación mediante etanol graduado (100%, 95%, 80%) durante 5–10 minutos cada una, y después se enjuagaron en agua destilada durante 2 minutos. Las secciones se sometieron luego a tinción por hematoxilina–eosina (HE) de la siguiente manera: tinción con hematoxilina durante 4 minutos, enjuague bajo agua del grifo corriente durante 3 minutos con flujo continuo para eliminar el exceso de tinte, diferenciación usando ácido clorhídrico al 1% en etanol durante 30 segundos, lavado tres veces con agua del grifo para terminar la diferenciación y tinción con eosina durante 10 segundos. La deshidratación graduada rutinaria se realizó secuencialmente utilizando sucesivamente 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, etanol anhidro I y etanol anhidro II durante 5 minutos cada uno. Tras secarse, la corredera se montaba usando bálsamo neutro.

Procedimiento inmunohistoquímico

Se cortaron secciones de parafina de 4 μm de grosor, se colocaron planas sobre portaobjetos recubiertos con APES y se colocaron en un horno a 67 °C durante la noche, seguidas de una deparafinización con Xylene I y II durante 10 minutos cada una. Se realizó una deshidratación gradual con alcohol al 100%, 90% y 70% durante 5 minutos cada uno, seguida de lavado con agua del grifo y agua destilada durante 3 minutos. Para bloquear la actividad endógena de la peroxidasa, se incubaron las láminas con una solución recién preparada de metanol-peróxido de hidrógeno al 3%, asegurando una cobertura completa de la sección tisular a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 20 minutos, seguida de tres lavados con agua destilada durante 5 minutos en 0,01 M PBS.

La extracción de antígenos se realizó sumergiendo las láminas en un tampón de citrato (pH 6,0) y calentando en una olla a presión a ~95–100 °C durante 8 minutos para HMGA1 y 10 minutos para HAND1 con las tapas bien cerradas para mantener condiciones de presión constantes. Las secciones se enfriaron a temperatura ambiente (20–25 °C) y se lavaron tres veces en 0,01 M PBS durante 3 minutos cada una bajo una agitación suave. Los anticuerpos primarios contra HMGA1 y HAND1 se diluyeron en diluyente de anticuerpos (1:150 y 1:100, respectivamente) y se mezclaron suavemente mediante pipeteo antes de aplicarse de forma uniforme para cubrir completamente cada sección de tejido. Las láminas se incubaron durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Tras una incubación nocturna, las láminas se retiraron de la cámara humidificada y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las láminas se lavaron tres veces con 0,01 M PBS (5 min por lavado) bajo una agitación suave para eliminar los anticuerpos no unidos. Se eliminó el exceso de líquido y se añadió un anticuerpo secundario (polímero anti-conejo/ratón marcado con HRP) para cubrir completamente las superficies de las secciones tisulares. Se realizó una incubación adicional a 37 °C durante 35 minutos.

Se aplicó una solución de sustrato de DAB gota a gota para cubrir el tejido, y se monitorizó el desarrollo del color al microscopio durante 1–3 minutos hasta que apareció la mancha marrón y cesó inmediatamente enjuagando con agua destilada una vez alcanzada la intensidad óptima de tinción. Se realizaron re-tinciones de hematoxilina, diferenciación de alcohol con ácido clorhídrico y solución de amoníaco para la reversión del azul. A esto le siguió la deshidratación graduada rutinaria de alcohol, transparencia de xileno y montaje con bálsamo neutro para observar bajo el microscopio. Se utilizó PBS como control en blanco en lugar del anticuerpo primario. Además, se utilizaron secciones de tejido escamoso de carcinoma de cabeza y cuello previamente confirmadas para HMGA1 y secciones de tejido placentario positivo para HAND1 como controles positivos para garantizar la calidad y consistencia de la tinción.

Determinación del resultado

El cromógeno utilizado en este experimento es el sistema DAB-H2O2. Tras la re-tinción con hematoxilina, se observa principalmente en el núcleo celular una tinción positiva por HMGA1 y HAND1, con cierta tinción citoplasmática. Para la evaluación, se identificó la región con mayor densidad de células teñidas positivamente bajo bajo aumento (×40). Con una ampliación ×100, se seleccionaron cinco campos con la mayor densidad celular positiva y se contaron 100 celdas en cada campo. El porcentaje medio de celdas positivas de los cinco campos se utiliza como resultado para cada diapositiva. Los criterios de clasificación fueron los siguientes: no células teñidas (-), células positivas < 25% (+), células positivas 25%–50% (++) y células positivas > 50% (+++), basadas en un método de puntuación porcentual semicuantitativa comúnmente utilizado en análisis inmunohistoquímicos. La evaluación fue realizada de forma independiente por dos patólogos cualificados de manera doble^{ciega 15, 16, 17}. Si sus opiniones difieren, deberían discutir y llegar a una conclusión¹⁸.

Método RT-PCR

Primers

Los cebadores se diseñaron utilizando software de diseño de cebadores basado en secuencias génicas objetivo, prestando atención a la especificidad del cebador, la compatibilidad con la temperatura de fusión y el tamaño esperado del producto. Las secuencias detalladas de cebadores, tamaños de producto y temperaturas de recocido se resumen en la Tabla 1. Los cebadores se sintetizaron hasta una concentración de 2 OD, se dividieron en dos tubos y se diluyeron a 10 pmol/μL con agua tratada con DEPC para su almacenamiento a -20 °C. La temperatura de recocido se calculó usando la fórmula: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)

Tratamiento con RNasa de materiales y equipos experimentales:

Artículos de plástico (por ejemplo, puntas de pipeta, tubos EP): Los objetos de plástico se colocaban en una botella esterilizada de reactivo de boca ancha, se añadía agua preparada tratada con DEPC hasta que los objetos quedaban completamente sumergidos y los materiales se incubaban durante la noche en una campana extractora a temperatura ambiente (20–25 °C). Luego se esterilizaron bajo presión durante 120 minutos y se secaron a 65 °C.

Artículos de vidrio: La cristalería se remojó toda la noche en ácido, se enjuagó bien, se secó, se envolvió en papel de aluminio y se horneó en un horno a 200 °C durante 6 horas y se guardó en un lugar limpio para su uso futuro.

Objetos metálicos (por ejemplo, tijeras, pinzas): Los objetos metálicos se limpiaban, se horneaban en un horno a 200 °C durante 6 horas y se almacenaban en un lugar limpio para uso futuro.

Preparación de soluciones

0,1% (v/v) Solución DEPC: Se añadió 1 mL de DEPC a 1000 mL de agua destilada para lograr una concentración final del 0,1% (v/v), se agitó bien, se incubó a 4 °C durante la noche, se esterilizó mediante autoclav y se almacenó a 4 °C.

75% (v/v) Solución de etanol: Se mezclaron 75 mL de etanol absoluto con 25 mL de agua tratada con DEPC para lograr una concentración final del 75% (v/v), y se almacenaron a 4 °C.

Extracción total de ARN del tejido

Tras la extracción de ARN, se evaluó la integridad del ARN antes de la transcripción inversa y el análisis posterior. Se pesaban 80 mg de tejido con una balanza electrónica, se cortaban en pequeños trozos y se colocaban en un homogeneizador de vidrio pretratado. Se añadió 1 mL de reactivo de extracción de ARN preenfriado a 4 °C, y la muestra se homogeneizó sobre hielo mediante molienda repetida hasta obtener un lisado uniforme sin fragmentos de tejido visibles, evitando la formación de burbujas. La mezcla homogeneizada se transfirió a un tubo EP libre de RNasa de 1,5 mL y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. Se añadió cloroformo de 400 μL a cada tubo, se vórtizó vigorosamente durante 10–15 segundos para asegurar la mezcla completa de fases, seguido de incubación sobre hielo durante 5 minutos. Los tubos se centrifugaron a 4 °C, 12.000 x g durante 15 minutos. Tras la centrifugación, la fase acuosa superior se aspiró cuidadosamente utilizando una pipeta libre de RNasa sin alterar la capa de interfase en un nuevo tubo. Se añadió un volumen igual de isopropanol, mezclado invirtiendo suavemente el tubo 8-10 veces hasta que las capas desaparecieron, e incubado a -20 °C durante al menos 10 minutos. La mezcla se centrifugó a 4 °C, 12.000 x g durante 10 minutos. Se descartó la capa sobrenadante, se añadieron 400 μL de etanol al 75% de helado para suspender el pellet de ARN. La mezcla se centrifugó de nuevo a 4 °C, 12.000 x g durante 5 minutos. La capa sobrenadante fue descartada y el pellet de ARN quedó ligeramente seco. El pellet de ARN se disolvió en agua libre de RNasa y se almacenó a -80 °C para su uso futuro.

Detección de integridad de ARN

Para la detección de la integridad del ARN, se mezclaron 5 μL de muestra de ARN con 5 μL de tampón de carga azul de bromofenol, y se realizó electroforesis sobre un gel de agarosa al 2%. La integridad del ARN se consideraba aceptable cuando se veían bandas claras de 28S, 18S y 5S sin difuminación evidente.

Transcripción inversa (RT) para sintetizar ADNc

Se precalentaron 6 μL de ARN a 70 °C durante 10 minutos, luego se añadieron 25 mM de_MgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV Buffer (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) y agua desionizada secuencialmente sobre hielo para lograr un volumen final de reacción de 20 μL, seguido de una mezcla suave y una breve centrifugación. Las condiciones de reacción fueron 25 °C durante 1 minuto, 42 °C durante 60 minutos, 98 °C durante 5 minutos y luego almacenadas a 4 °C indefinidamente. Una vez que la reacción alcanzaba los 4 °C, el producto se extraía de la máquina de PCR, se usaba como plantilla de ADNc para la siguiente reacción de PCR y se almacenaba a -20 °C para su uso posterior.

Amplificación por PCR

Para cada reacción PCR, la mezcla contenía plantilla de cDNA (1 μL), cebador directo específico para HMGA1, HAND1 o GAPDH (1 μL), cebador inverso específico para el gen objetivo o GAPDH (1 μL), mezcla maestra PCR (10 μL) y agua tratada con DEPC (7 μL), para un volumen total de 20 μL. Se prepararon reacciones separadas para cada gen objetivo (HMGA1, HAND1) y el gen de control interno (GAPDH), con cada reacción conteniendo su respectivo par de cebadores directos y inversos específicos de cada gen.

El volumen total de reacción era de 20 μL. Tras mezclar suavemente los componentes de la reacción y centrifugar brevemente durante 5–10 segundos a baja velocidad, el tubo se colocó en una máquina de PCR precalentada y se amplificaba según las condiciones de reacción de la Tabla 2.

Confirmación y análisis de productos amplificados por PCR

Preparación del gel

Se pesaban 2 g de agarosa y se colocaban en un frasco triangular. Se añadieron 2 mL de tampón de electroforesis al 50× TAE y 100 mL de agua destilada (preparar un gel de agarosa al 2%), luego se calentó en un microondas con giros intermitentes (intervalos de 15–20 s) hasta que la agarosa se disolvió completamente. Tras enfriar hasta aproximadamente 55 °C, se añadieron 10 μL de solución EB y se mezclaron a fondo. Luego, el gel se vertía en una bandeja de gel limpia a temperatura ambiente (20–25 °C), se lavaba con agua destilada y se insertaba un peine para crear pozos de muestra. El grosor del gel era de 0,4 cm. La bandeja se colocó sobre una superficie plana a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 30 minutos hasta que el gel se solidificó completamente. El peine fue retirado con cuidado.

Carga de muestras

Se añadieron 4 μL de cada muestra de ADN en los pozos del gel, y el marcador de ADN se añadió al pozo más a la izquierda.

Electroforesis

La bandeja de gel cargada se colocó en un tanque de electroforesis lleno con buffer de electroforesis TAE, asegurando que el nivel del tampón se mantuviera aproximadamente 1 mm por encima de la superficie del gel. Un extremo de los pozos estaba en el cátodo (para permitir que el ADN migre hacia el ánodo). El sistema de electroforesis se conectaba a una fuente de alimentación y funcionaba a 120 V y 60 mA durante aproximadamente 45 minutos, hasta que el buffer de carga migraba más allá de la línea media del gel, tras lo cual se apagaba la alimentación.

Observación e imagen de resultados

Tras la electroforesis, el gel fue retirado cuidadosamente y los resultados se observaron bajo un transiluminador UV y se compararon con el Marcador de ADN para determinar si el peso molecular de los fragmentos amplificados apareció en las posiciones esperadas. El sistema de imagen en gel se utilizaba para capturar imágenes y guardar los resultados en el ordenador.

Configuración de controles

Se utilizó agua destilada en lugar de ADNc como control negativo.

Análisis semicuantitativo

Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se analizaron y capturaron utilizando el sistema de imagen en gel. Se utilizó software de análisis de imágenes para analizar el brillo de las bandas. Se midieron los valores absolutos integrados de OD de la banda de amplificación génica objetivo y de la correspondiente banda de amplificación génica de control interna. Los resultados se expresaron como la relación entre el valor absoluto integrado de OD de la banda objetivo y el valor absoluto integrado de OD de la banda interna de control correspondiente.

Es decir, expresión relativa = valor OD del gen objetivo / valor OD del gen de control interno.

Análisis estadístico

Todos los datos se organizaron usando Excel y se analizaron mediante software estadístico. Las variables continuas se expresaron como media ± desviación estándar (DS) y comparadas entre dos grupos utilizando la prueba t de muestras independientes. Se analizaron variables categóricas nominales, incluidas las tasas de expresión positiva inmunohistoquímica, utilizando la prueba χ² . Se analizaron variables ordinales categóricas, incluyendo grado patológico y estadio clínico, utilizando la prueba de suma de rangos (prueba U de Mann-Whitney para comparaciones de dos grupos, cuando corresponda). La correlación entre la expresión de HMGA1 y HAND1 se evaluó mediante análisis de correlación lineal. Todas las pruebas eran de dos colas; Se consideró estadísticamente significativo P < 0,05 y P. < 0,01 se consideró altamente significativo.

Resultados

Resultados de detección inmunohistoquímica

Se muestran imágenes representativas de coloración de hematoxilina–eosina (HE) que ilustran la morfología histológica de la mucosa laríngea normal adyacente y de LSCC con distintos grados de diferenciación (bueno, moderada y pobre). Específicamente, la Figura 1A muestra la mucosa laríngea normal adyacente, la Figura 1B muestra las CCL bien di...

Discusión

El cáncer de laringe, uno de los tumores más comunes en la cabeza y el cuello, ha mostrado una incidencia creciente en los últimos años, probablemente asociada a factores ambientales y relacionados con el estilo de vida. Como otros tumores malignos, su recurrencia y metástasis siguen siendo las principales causas de muerte. Con los avances en biología molecular, se han identificado muchos factores asociados al desarrollo del cáncer de laringe, pero los mecanismos de inicio y metástasis a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Máquina automática de incrustación de tejidos	Sakura Finetek, Tokio, Japón	Tissue-Tek TEC 5	Incrustación de parafina
Microtomo	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	RM2135	Seccionamiento (4 y mu; m)
Secador de correderas	Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., China	CS-VI	Secado por corredera
Incubadora de calefacción	Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., China	303-4A	Incubación controlada por temperatura
Microscopio óptico	Olympus Corporation, Tokio, Japón	BX41	Observación histológica
Sistema de Captura de Imágenes	QImaging, Canadá	QCapture Pro 7	Imágenes por microscopía
Banca limpia	Fábrica de Equipos de Semiconductores Pekín Xicheng, China	SW-CJ-1FD	Espacio de trabajo estéril
Centrífuga refrigerada	Fábrica de Reparación de Instrumentos Médicos de Pekín, China	LXJ-64-01	Separación de ARN
Centrífuga de mesa	Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., China	PQ-1600A	Procesamiento de ARN/ADN
Agitador magnético	Fábrica de Instrumentos Médicos Jintan de Jiangsu, China	HJ-3	Preparación de la solución
Mini mezcladora	Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., China	H-1	Mezcla de muestras
Balance electrónico	METTLER Toledo, Suiza	PB3002-S	Pesaje de muestra
Amplificador de PCR	Eppendorf AG, Alemania	Mastercycler 5333	Amplificación por PCR
Fuente de alimentación por electroforesis	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pekín, China	DYY-6C	Control de voltaje
Tanque de electroforesis	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pekín, China	DYCZ-24DN	Electroforesis en gel
Microondas	Instituto de Investigación de Aplicaciones Médicas Zhongda de Shanghái, China	WD800SL23	Preparación de la agarosa
Transiluminador UV	Fábrica de Instrumentos Liuyi de Pekín, China	WD-9403B	Visualización del ADN
Sistema de imagen en gel	Anlai Co., Ltd., China	AlphaImager HP	Documentación de gel
Frigorífico (4 y grados; C)	Haier Biomedical, China	BC-165D	Almacenamiento de muestras
Congelador de ultra baja temperatura	Haier Biomedical, China	DW-86L388	Almacenamiento (-80 y grados; C)
Caja de hielo	Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., China	FZ-IB-20L	Transporte de muestras
Bolsas de almacenamiento criogénicas	Shanghai Yili Technology Co., Ltd., China	YL-ULT-50	Preservación de muestras
Pipetas de investigación	Eppendorf AG, Alemania	Research Plus	Manipulación de líquidos
Reactivo de Extracción de ARN (TRIzol)	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), EE. UU.	15596026	Extracción de ARN
Kit de transcripción inversa	Takara Bio Inc., Japón	RR037A	Síntesis de ADNcDNA
Mezcla Mastera PCR	Takara Bio Inc., Japón	RR820A	Amplificación por PCR
dNTP Mix	Takara Bio Inc., Japón	4030 (típico)	Componente de PCR
Inhibidor de RNasa (RNasin)	Promega, EE. UU.	N2111	Protección de ARN
Imprimador Oligo(dT)	Takara Bio Inc., Japón	3806 (típico)	Cebador de síntesis de cDNA
Agarose	Sigma-Aldrich, EE. UU.	A9539	Preparación del gel
TAE Buffer (50 y más veces)	Sigma-Aldrich, EE. UU.	TAE50X-1L (típico)	Amortiguador de electroforesis
Marcador de ADN (escalera)	Takara Bio Inc., Japón	DL2000 (3421A)	Referencia de tamaño
Bromuro de etidio (EtBr)	Bio-Rad, EE. UU.	1610433	Visualización del ADN
PBS Buffer	Gibco (Thermo Fisher Scientific), EE. UU.	10010023	Amortiguador de lavado
Agua tratada con DEPC	Invitrogen, EE. UU.	AM9916	Protección de ARN
Cloroformo	Sigma-Aldrich, EE. UU.	C2432	Extracción de ARN
Isopropanol	Merck, Alemania	109634	Precipitación de ARN
Etanol (absoluto)	Merck, Alemania	100983	Deshidratación
Metanol	Merck, Alemania	106009	Bloqueo de peroxidasa
Peróxido de hidrógeno (H2O2)	Sigma-Aldrich, EE. UU.	H1009	Bloqueo de peroxidasa endógena
Xileno	Sigma-Aldrich, EE. UU.	534056	Deparafinización
Amortiguador de recuperación de antígenos de citrato	Abcam, Reino Unido	ab93678	Recuperación de antígenos
Diluyente de anticuerpos	Dako, Dinamarca	S3022	Dilución de anticuerpos
Anticuerpo primario de HMGA1	Abcam, Reino Unido	ab129153	Dilución 1:150
Anticuerpo primario HAND1	Abcam, Reino Unido	ab200040	Dilución 1:100
Anticuerpo secundario (conjugado con HRP)	Dako, Dinamarca	K5007	Sistema de detección
Kit de sustrato DAB	Dako, Dinamarca	K3468	Detección cromogénica
Mancha de hematoxilina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	H9627	Tinción nuclear
Mancha de eosina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	E4009	Tinción citoplasmática
Medio de montaje de bálsamo neutro	Sinopharm Chemical Reagent Co., China	10004160	Montaje de corredera
HMGA1 Primers	Sintetizados a medida (por ejemplo, IDT/Sangon)	N/A	Amplificación génica
Cebadores HAND1	Sintetizados a medida (por ejemplo, IDT/Sangon)	N/A	Amplificación génica
Cebadores GAPDH (control interno)	Sintetizado personalizado	N/A	Gen de limpieza
APES (Aminopropiltrietoxisilano)	Sigma-Aldrich & nbsp;	N/A	Recubrimiento de corredera
Tubos microcentrífugas libres de RNasa	Eppendorf y Eppendorf;	N/A	Manipulación de ARN
Puntas para pipetas sin RNasa	Eppendorf y Eppendorf;	N/A	Manipulación de líquidos
Bandeja y peine para colar gel de agarosa	Genérico	N/A	Preparación del gel
Software de diseño de imprimaciones	Tecnologías Integradas de ADN, EE. UU.	Herramienta PrimerQuest	Diseño de cebadores
Software de análisis de imágenes	Media Cybernetics, EE. UU.	Image-Pro Plus 6.0	Cuantificación de bandas
Software de Análisis Estadístico	IBM Corp., EE. UU.	SPSS Versión 13.0	Análisis estadístico