Artículo de método

Un modelo de lesión por hipoxia-reoxigenación en cardioides humanos autoensamblantes

DOI:

10.3791/70310

⸱

17 de marzo de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides cardíacos humanos autoensamblantes (hCOs) son un sistema emergente para modelar el desarrollo y las enfermedades cardíacas humanas. Aquí se proporciona una metodología para generar y dañar hCOs mediante hipoxia-reoxigenación y detalles de los resultados histológicos y funcionales esperados tras la lesión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sin una revascularización rápida, la enfermedad cardíaca isquémica conduce a una pérdida irreversible de cardiomiocitos, formación de cicatrices y disminución de la función cardíaca. La capacidad de modelar lesiones por hipoxia-reoxigenación y evaluar posibles intervenciones terapéuticas en tejidos humanos es una necesidad no cubierta. Los organoides cardíacos humanos (hCOs) son un sistema modelo emergente, pero comenzar a trabajar con hCOs puede ser complicado debido a su pequeño tamaño, los requisitos de cultivo en suspensión y la variabilidad en la eficiencia de diferenciación. Este protocolo ofrece una guía fácil de usar para generar y mantener hCOs autoensamblables derivados de iPSC humanos; métodos para procesar e analizar histológicamente los hCOs; y un enfoque para lesionar a los hCOs con hipoxia-reoxigenación que imita la fibrosis y apoptosis observadas en isquemia/reperfusión humana. Este protocolo proporciona orientación para utilizar los hCOs como complemento a modelos animales de lesión por isquemia-reperfusión y podría emplearse para identificar y probar factores que puedan potenciar la recuperación miocárdica humana.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad cardíaca isquémica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, afectando al menos a 20,5 millones de personas solo en EstadosUnidos 1, 2, 3. Sin una perfusión adecuada, la hipoxia prolongada provoca la muerte de los cardiomiocitos (CM) y disfunción miocárdica. La isquemia miocárdica se trata principalmente mediante revascularización mediante intervención percutánea, terapia trombolítica o bypass coronario. Sin embargo, la revascularización es un arma de doble filo y puede causar daños adicionales mediante la liberación de especies reactivas deoxígeno 4,5. Aunque las estrategias de reperfusión han sido inmensamente exitosas, los enfoques para limitar la pérdida de CM durante los insultos isquémicos o después de la reperfusión han sido más difíciles de alcanzar. Aunque muchos intentos de recuperar tejido infarctado resultan efectivos en modelos animales de isquemia-reperfusión, estas mismas terapias en gran medida no han logrado un beneficio significativo en ensayos humanos, lo que genera la necesidad de que los modelos humanos evalúen terapias que preservan o reponen laCM 6,7,8,9,10,11,12.

Las plataformas humanas utilizadas para modelar lesiones cardíacas incluyen tejidos primarios y sistemas derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) 13,14. Debido a que los tejidos primarios están limitados por la disponibilidad de muestras, los sistemas hiPSC se han convertido en la plataforma humana dominante para el modelado de enfermedades cardíacas, con las ventajas claras de ser genéticamente manejables yescalables 15,16,17,18,19. Los cultivos tradicionales de cardiomiocitos derivados de hiPSC en 2D (hiPSC-CM) están limitados por la inmadurez de los CM resultantes, la ausencia de arquitectura tejidular compleja y la incapacidad de reproducir toda la diversidad celular que se encuentra en el corazónhumano 15,20. Para abordar estas carencias, los tejidos cardíacos 3D (EHT) modificados se han adoptadocada vez más 20,21,22,23,24,25,26. Los enfoques EHT incluyen mezclar células cardíacas prediferenciadas enesferoides 24 o sembrar células cardíacas diferenciadas en andamioso moldes 21,22,27. Aunque los EHT pueden modelar mejor interacciones celulares heterotípicas y tienen una madurez relativamente mayor que los cultivos 2D, los requisitos de andamios o biorreactores personalizados para crear y mantener EHTs actualmente limitan su escalabilidad 21,27,28.

Los organoides cardíacos autoensamblantes (hCOs), o cardioides, son un sistema modelo humano in vitro nuevo y potente 20,25,26,29. Los hCOs tienen varias ventajas. En primer lugar, pueden incluir múltiples tipos celulares, incluyendo células endoteliales, fibroblastos y células epicárdicas, sin necesidad de múltiples protocolos especializados de diferenciación 26,29,30. En segundo lugar, la mayor parte de su diferenciación ocurre en el cultivo por suspensión 3D, lo que elimina la necesidad de moldes especializados o matriztisular 25,26,29,30. Finalmente, los hCOs presentan una morfología esférica estereotipada con una cavidad central, lo que permite análisis morfológicos. Así, los hCOs tienen una escalabilidad similar a los sistemas de cultivo 2D, manteniendo parte de la complejidad tisular de los EHT. Los hCOs se han utilizado para pruebas de toxicidad de fármacos, modelado específico de enfermedades por paciente y para modelar aspectos del desarrollocardíaco 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 . Aunque prometedores, los hCOs presentan varias limitaciones en comparación con los EHT, incluyendo la incapacidad de medir directamente la salida de fuerza. Además, no existe una población nativa de células inmunitarias en los modelos hCO descritos, aunque es posible poblar hCOs con macrófagos. No obstante, los hCOs son un sistema modelo humano emergente y en rápidaevolución 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Hasta la fecha, la modelización de lesiones cardíacas con hCOs ha sido limitada. Se ha descrito un modelo de criolesión, pero las lesiones son muy variables y la necesidad de lesionar individualmente a los hCOs limita laescalabilidad 29. Este manuscrito describe un protocolo fácil de usar para generar y lesionar hCOs autoensamblantes con lesiones por hipoxia-reoxigenación (H/R). En comparación con otros protocolos para generar hCOs, este protocolo utiliza un medio de diferenciación simplificado e incorpora la estrategia de diferenciación de mesodermos 2D-3D descrita por Hofbauer et al.29. El protocolo para la lesión H/R puede realizarse en cualquier momento después de que los hCOs comiencen a bater, lo que suele ocurrir alrededor del día 8 (D8) a D11. La duración de la cardiograma puede ajustarse entre 6 y 24 horas para alcanzar el nivel deseado de lesión, que va desde una pérdida mínima hasta casi total de muco cervical (CM). Además, los hCOs desarrollan estereotípicamente un núcleo colágeno con células Vimentin+ tras una lesión H/R, que también aumenta en gravedad con la duración H/R. Este modelo de hCO de alto rendimiento y escalable de lesiones H/R puede abordar la necesidad de que los modelos humanos desarrollen y prueben nuevas vías terapéuticas para promover la recuperación o regeneración de la CM tras una lesión.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos para manejar líneas celulares humanas deben seguir protocolos locales de bioseguridad. Todos los experimentos se realizaron utilizando la línea celular de iPSC DU11, derivada de fibroblastos varones recién nacidos sanos por la instalación central de iPSC de la Universidad de Duke.

1. Generación de hCOs

NOTA: Esta sección describe un protocolo estándar para generar hCOs a partir de iPSCs (Figura 1). Todos los pasos detallados en este protocolo deben realizarse en una campana de flujo laminar para garantizar la esterilidad. Consulta la Tabla 1 para recetas de medios de diferenciación.

DíaConcentración de stockConcentración de trabajoFactor de diluciónMedios de Base
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
10 mg/mL de activina A60 ng/mL de Activina A1:167
D15 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
D25 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
10 mM Tiazovivina2 μM Tiazovivina1:5000
D35 mM IWP2IWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% B27 menos insulina
100 mg/mL de ácido ascórbico50 μg/mL de ácido ascórbico1:2000
D4IWP2 de 5mMIWP2 de 5 μM1:1000RPMI-1640, 2% B27 menos insulina
D6+N/AN/ARPMI-1640, 2% B27 más insulina

Tabla 1: Tabla de medios de diferenciación. Concentraciones de stock, concentraciones de trabajo y factor de dilución para cada factor de diferenciación hasta los días de diferenciación 0-6. Prepara todas las soluciones operativas frescas en el momento de la alimentación.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema de la diferenciación de hCO. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Mantenimiento del iPSC
    1. Cubrir completamente el fondo de cada pozo de una placa de 12 pozos con matriz de membrana basal en una proporción 1:100, diluida en medios fríos DMEM/F12. Incubar placas tratadas a 37 °C durante 1 hora para permitir la polimerización. Si no se usa inmediatamente, las placas pueden sellarse con una película y almacenarse a 4 °C durante hasta 2 semanas e incubarse al menos 60 minutos a 37 °C antes de su uso.
  2. Día de diferenciación -3 (D-3): placado de iPSCs para la diferenciación posterior
    1. Preparar placas recubiertas de matriz de membrana basal como se describe en el paso 1.1.1.
    2. Aspirar medios de mantenimiento de cultivo de iPSC y añadir suficiente solución de desprendimiento celular para cubrir completamente las células (~500 μL por pozo de una placa de 12 pozos o 1 mL por pozo de una placa de 6 pozos). Incubar a 37 °C durante 5 minutos.
    3. Añade un volumen igual de medio de mantenimiento iPSC a cada pozo y golpea suavemente la placa para ayudar a desprender las células. Inclina la placa hacia ti y pipetea suavemente arriba y abajo por el fondo del pozo para desprender aún más las células adheridas, no más de 3 veces. Usa una pipeta para mover la suspensión de celda a un tubo cónico de 15 mL.
    4. Pilular las pilas por centrifugación a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga de cubo giratorio. Aspira el sobrenadante y resuspende suavemente las células en 1 mL de medio de mantenimiento iPSC.
    5. Traslada 10 μL de la suspensión de la celda a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añade 10 μL de azul de Trypan y pipetea para mezclar. Añade 10 μL de la mezcla iPSC/azul de Trypan al hemocitómetro y cuenta las células vivas.
    6. Diluir la suspensión celular hasta una concentración final de 100.000-200.000 células/mL en medios de mantenimiento de iPSC con inhibidor de ROCK (ROCKi). Añadir 1 mL/pozo de la suspensión de la celda a cada pozo de una placa de 12 pozos recubierta con matriz de membrana basal.
      NOTA: La densidad de placas antes de la diferenciación depende de la tasa de crecimiento de una línea celular determinada. Puede que sea necesario ajustar la densidad de chapado para cada línea de iPSC. La concentración de ROCKi puede necesitar una ajustada dependiendo de la marca o formulación que se utilice.
  3. Diferenciación D-2: Intercambio de medios para eliminar ROCKi
    1. Intercambia el medio por 1 mL de medio de mantenimiento iPSC nuevo, sin ROCKi. Las células deberían empezar a formar pequeñas colonias. Las colonias deben parecer planas (Figura 2A). Si las células parecen parecidas a adoquines, delgadas o alargadas, esto es un signo de diferenciación espontánea, y la eficiencia de la diferenciación puede verse afectada.
  4. Diferenciación D-1: Continuar incubando células sin tratamiento.
  5. Diferenciación D0: Inicio de la diferenciación e inducción del mesodermo
    1. Utilizando un microscopio, comprueba la densidad celular para asegurar una confluencia del 70%-90% (Figura 2B) en el momento de la diferenciación. Si es subconfluente, alimenta las células con medios de mantenimiento iPSC y espera 24 horas. Si las células son demasiado confluyentes, divídelas como en el paso 1.2
    2. Preparar 12 mL por placa de 12 pozos de medio de inducción mesodermica D0 (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 60 ng/mL de activina A en RPMI-1640 con suplemento de B27 al 2% menos insulina (RB-)).
    3. Retirar el medio existente y reemplazarlo por 1 mL/pozo de medio de inducción mesoderma D0. Fíjate en la época del intercambio mediático.
  6. Diferenciación D1: Especificación del mesodermo cardíaco
    1. Exactamente 24 horas después de la adición del medio de inducción del mesodermo D0, el medio de intercambio por medios de especificación de mesodermo cardíaco D1 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico en RB).
  7. Diferenciación D2: formación hCO
    1. Añade suficiente reactivo de disociación celular para cubrir las células e incuba a 37 °C durante 5 minutos (Figura 2C). Añade un volumen igual de medios de mesodermo cardíaco D2 a cada pozo y pipetea suavemente arriba y abajo para liberar las células adheridas. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL.
    2. Haz las células de pellet por centrifugación a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Resuspender en 1 mL de medio de especificación de mesodermo cardíaco D2 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico en RB-).
    3. Toma 10 μL de la suspensión de celda y añade 10 μL de azul de Trippan. Cuenta las células con cualquier método preferido. Diluir las células hasta una concentración de 100.000 células/mL en medios de especificación cardíaca D2, con 2 μM de tiazovivina. Utiliza 10 mL de la suspensión de celda por cada placa de sujeción ultra-baja de 96 pozos.
    4. Transfiere la suspensión de la celda a un reservorio de reactivo de tamaño adecuado y utilice una pipeta multicanal para transferir 100 μL a cada pozo de una placa de 96 pozos de unión ultrabaja, para una concentración final de 10.000 celdas por pozo.
    5. Para inducir la formación de hCO en cultivo en suspensión, centrifugar placas a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, habrá un gran pellet de celdas (Figura 2D); si este pellet no está circunscrito, se repite la centrifugación.
      NOTA: No todas las células se incorporarán al hCO, que aparecerá como un pellet celular circunscrito, con células individuales visibles en la microscopía de campo claro. Algunos restos unicelulares en la placa que rodea el hCO son normales.
  8. Diferenciación D3: Adición de medios para diluir ROCKi
    1. Preparar 10 mL de medio D3 (5 μM IWP2, 50 μg/mL de ácido ascórbico en RB-) por placa. Utilizando una pipeta multicanal, añade 100 μL de medio D3 a cada pozo, sin eliminar ningún medio.
      NOTA: En esta etapa, los hCOs se habrán condensado en un esferoide oscuro y bien circunscrito. Las células individuales no serán visibles (Figura 2E).
  9. Diferenciación D4: Intercambio a medios D4
    1. Retirar 100 μL de medio D3 y reemplazar por 100 μL de medio D4 (5 μM IWP2 en RB-). Para reducir el riesgo de aspiración, inclina la placa hacia ti en un ángulo de aproximadamente 45° y sujeta una pipeta multicanal en un ángulo de aproximadamente 90° respecto a la pared lateral de la placa. Coloque la pipeta multicanal firmemente en la pared lateral del pozo y aspire lentamente 100 μL de medio, comprobando intermitentemente las puntas de la pipeta en busca de hCOs aspirados.
      NOTA: los hCOs están en cultivo en suspensión, y es común aspirar hCOs durante la extracción del medio. Para reducir el riesgo de aspiración, inclina la placa hacia ti hacia un ángulo de aproximadamente 45° y sujeta una pipeta multicanal en un ángulo de aproximadamente 90° respecto a la pared lateral de la placa. Coloca la pipeta multicanal firmemente en la pared lateral del pozo y aspira lentamente 100 μL de medio, comprobando intermitentemente las puntas de la pipeta en busca de hCOs aspirados.
    2. Sustituye por 100 μL de medio D4.
  10. Diferenciación D6: medio de mantenimiento hCO
    1. Retirar 100 μL del medio D4 y reemplazarlo por 100 μL de medio D6+ (RPMI-1640 con suplemento al 2% de B27 (RB+)).
  11. Diferenciación D8
    1. Continúa intercambiando el medio cada 2 días retirando 100 μL y reemplazándolo por 100 μL de medio D6+ fresco. Los hCOs deberían crecer, conservar bordes suaves y empezar a batir alrededor de D6-11 si se diferencian con éxito (Figura 2F). Los hCOs seguirán apareciendo como esferoides oscuros y bien circunscritos, y las células individuales no serán visibles.

figure-protocol-2
Figura 2: Cronología de la diferenciación de hCO. Cronología de la diferenciación organoide. (A) Colonias de iPSC 1 día antes del inicio de la diferenciación (D-1). Observa colonias distintas y de aspecto plano. (B) iPSCs en el día de inicio de la diferenciación (D0) a ~90% de confluencia. (C) Organoide en la diferenciación D2 inmediatamente después de la formación del organoide en una placa de fijación ultrabaja de 96 pozos. La flecha indica un ejemplo de cristales IWP2 en forma de aguja. (D) Organoides en la diferenciación D3. Nótese una compactación significativa de organoides debido a la formación de unión célula-célula; Algunos residuos celulares no incorporados son normales en esta etapa. (E) Organoides en la diferenciación D10. (F) Flecha indica colonia de iPSC con células alargadas y delgadas con aspecto de adoquines, lo que indica una posible diferenciación espontánea. Barra de escala = 1000 μm para paneles A-E, barra de escala = 400 μm para panel F. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Recoger y fijar hCOs para inmunotinción

  1. Utilizando una pipeta de 1000 μL con la punta cortada, transfiere los hCOs a un tubo microcentrífuga de 1,7 mL. Una vez transferidos todos los hCOs, espera a que los hCOs se hundan al fondo del tubo y retira suavemente el exceso de medio. Lava los hCOs 1 vez con PBS, espera unos segundos a que los hCOs se hundan al fondo del tubo y elimina suavemente el exceso de PBS.
  2. Corrige los hCOs con un 4% de PFA durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Algunos anticuerpos pueden requerir fijación de acetona o metanol para un rendimiento óptimo. Consulta las directrices del fabricante.

3. Inmunotinción de montaje completo

  1. Transfiere el número deseado de hCOs fijos a un tubo microcentrífuga de 1,7 mL. Retirar la solución fijadora y lavar con PBS que contenga 0,1% Tween-20 (PBS-T).
    1. Para lavar los hCOs, elimina la mayor cantidad posible del fijador en exceso. Ten cuidado de no molestar los hCOs en la parte inferior del tubo. Añade ~1 mL de PBS-T y espera unos segundos a que los hCOs se hundan al fondo del tubo antes de pasar al siguiente paso.
  2. Diluir el anticuerpo primario hasta la concentración deseada en la solución de tinción (suero neonatal para terneros, 1% DMSO en 0,1% PBS-T). Añade entre 50 y 100 μL de solución primaria de anticuerpos por tubo de microcentrífuga (o suficiente volumen para cubrir todos los hCOs de cada tubo).
  3. Incuba durante 24 horas a 4 °C sobre un shaker/rocker. Elimina el exceso de anticuerpo primario y luego realiza tres lavados de 1 h en PBS-T a temperatura ambiente. Realiza un lavado final durante la noche en PBS-T a 4 °C para asegurarte de que se elimina cualquier exceso de anticuerpo.
  4. Diluir el anticuerpo secundario a una concentración deseada en la solución de tinción y añadir entre 50 y 100 μL de solución de anticuerpos por tubo de microcentrífuga (o suficiente volumen para cubrir todos los hCOs de cada tubo).
  5. Incubar los hCOs con el anticuerpo secundario durante 24 horas a 4 °C sobre una plataforma agitadora. Elimina el exceso de anticuerpo secundario y luego realiza tres lavados de 1 hora en PBS-T a temperatura ambiente. Realiza un lavado final durante la noche en PBS-T a 4 °C para asegurarte de que se elimina todo el exceso de anticuerpos.
  6. Para imágenes de montaje completo, transfiere los hCOs usando una pipeta de 1000 μL con la punta cortada a una lámina de vidrio cargada positivamente. Elimina el exceso de PBS-T y añade unas gotas de medio de montaje para cubrir los hCOs. Coloca cuidadosamente un abrigo de cubierta para aplanar los hCOs.
    NOTA: Para preservar la arquitectura 3D del hCO, utiliza una junta de goma o cinta de doble cara alrededor de los bordes de la corredera para elevar la altura del deslizamiento de la tapa. Utilizar un medio de montaje de limpieza puede ser útil para mejorar la imagen a través del hCO, especialmente si los hCOs no están aplanados.

4. Seccionado e incrustado

  1. Tras la fijación, cubre los hCOs con un 30% de sacarosa durante la noche a 4 °C para crioprotección. Utilizando una pipeta de 1000 μL con la punta cortada, transfiere el número deseado de hCOs a un molde plástico de 12 mm x 12 mm. Elimina cuidadosamente el exceso de solución de sacarosa, teniendo cuidado de no aspirar los hCOs.
    NOTA: Es útil pipetear un 30% de sacarosa arriba y abajo en la punta antes de transferirla para evitar que los hCOs se adhieran al lateral de la punta.
  2. Añade una pequeña gota de OCT, justo lo suficiente para cubrir los hCOs. Usando unas pinzas finas o una punta de pipeta, reposiciona suavemente los hCOs en OCT de modo que no se agrupen y no haya hCOs cerca de los bordes del molde. Asegúrate de que todos los hCOs estén lo más cerca posible del fondo del molde con el objetivo de maximizar el número de hCOs encontrados en una sola criosección.
  3. Congela esta capa inicial de OCT colocando el molde en un enfriador de poliestireno con una capa de hielo seco en el fondo. Espera unos minutos a que el OCT endurezca y luego mueve el moho del hielo seco al mostrador. Añade OCT adicional hasta que el molde esté lleno. Espera a que la primera capa de OCT se derrita completamente antes de volver al hielo seco.
  4. Guarda los hCOs congelados e incrustados a -80 °C hasta que estén listos para criosección.
  5. Cuando esté listo para seccionar, alinea el bloque de hCO lo mejor posible y comienza a recortarlo. Coloca periódicamente una sección en un diapositivo cargado e inspecciona visualmente cada sección en busca de hCOs. Cuando se visualizan los hCOs, se cambia a secciones de 6 μm.
    NOTA: La tasa de desgaste de los hCOs durante la incrustación y el seccionamiento es al menos del 10%. Planifica en consecuencia.

5. Secciones de tejido con tunel e inmunotinción

  1. Usa un bolígrafo para dibujar un borde hidrofóbico alrededor de las secciones de tejido que necesitan ser teñidas. Lava una vez en PBS 0,1% Tween (PBS-T) para disolver el OCT.
  2. Añade buffer bloqueante (suero neonatal para terneros, 1% DMSO, en PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  3. Prepara la solución primaria de anticuerpos. Comienza con la concentración recomendada por el fabricante para la inmunofluorescencia, pero puede que sea necesario ajustarla empíricamente.
    NOTA: Alternativamente, la tinción con TUNEL puede realizarse en este momento siguiendo el protocolo del fabricante.
  4. Quita el buffer bloqueante del deslizamiento. Añade suficiente solución primaria de anticuerpos para cubrir las secciones de hCO. Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C o 3 horas a 37 °C. Lava las láminas 3 veces durante 5 minutos cada una en un tarro Coplin lleno de PBS-T a temperatura ambiente.
  5. Preparar una solución secundaria de tinción por anticuerpos en un tampón bloqueador, incluyendo DAPI u otro marcador pan-nuclear. Añade suficiente solución secundaria de tinción por anticuerpos para cubrir las secciones de hCO. Incuba protegido de la luz durante 1 hora a temperatura ambiente.
  6. Lava las láminas 3 veces durante 5 minutos en un tarro Coplin lleno de PBS-T a temperatura ambiente. Montaje con un portaobjetos y el medio de montaje deseado.

6. Cuantificación de la colocalización nuclear con CardioCount

NOTA: CardioCount es un método basado en aprendizaje profundo para puntuar núcleos de CM a partir de imágenesmicroscopicas 40. Desarrollado originalmente para evaluar el ciclo de CM, CardioCount funciona bien para múltiples tinciones nucleares, incluyendo TUNEL40.

  1. Para usar CardioCount, descarga el paquete de CardioCount desde GitHub o impórtalo a Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Versión 1 funciona en un entorno Python 3.
  2. Exportar imágenes para cuantificación como archivos individuales de 512 x 512 píxeles .tif con canales rojo, azul y verde fusionados, donde el canal rojo es un marcador nuclear CM, el azul un marcador nuclear general y el verde un marcador nuclear en ciclo (es decir, Ki67) o marcador apoptótico (es decir, TUNEL). Crea una carpeta principal en Google Drive para este experimento y sube tiffs fusionados como subcarpeta.
    NOTA: CardioCount se entrenó con tinciones nucleares que llenan el núcleo. Los marcadores de ciclismo más puntuados, como Aurora B o PH3, pueden no ser compatibles con CardioCount.
  3. Abre el cuaderno de CardioCount en Google CoLab. Ejecuta la celda 1.1 para comprobar el acceso a la unidad de procesamiento gráfico (GPU). Ejecuta Cell 1.2 para conectar CoLab Notebook a Google Drive.
  4. Ejecuta Cell 1.3 para cargar CardioCount y Dependencias en Google Colab. Edita el archivo kFile para leer el nombre de ruta hacia donde se guardó la carpeta PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries al descargarla.
  5. En la celda 2.0, edita base_folder para leer el nombre de ruta de la carpeta padre que contiene la subcarpeta de imágenes a analizar. Ejecuta la celda 2.0 para vincular esta carpeta a CoLab.
  6. En la celda 2.1.1, edita orig_image_folder para que coincida con el nombre de la carpeta que contiene imágenes para análisis. Edita channel_to_remove para leer verde y new_image_folder para nombrar la subcarpeta bajo base_folder donde se guardarán todas las imágenes con el canal verde eliminado (rojo/azul). Repite este paso para eliminar el canal rojo, asegurándote de editar new_image_folder para distinguir la subcarpeta que contiene imágenes con el canal rojo eliminado (verde/azul).
  7. En la celda 2.1.2, recorta las imágenes a 512 x 512 para las imágenes rojas/azules. Asegúrate de que el uncropped_image_folder coincida con el nombre new_image_folder creado en el paso 6.6. Para imágenes rojas/azules. Nombra destination_image_folder para designar la subcarpeta donde se guardarán las imágenes recortadas, rojas/azules. Repite este paso para recortar las imágenes verde/azul. Finalmente, repite este paso para recortar los tiffs fusionados originales de 3 canales alojados en base_folder.
  8. Ejecuta la celda 2.2 para generar mapas de probabilidad. Nombre data_specific_folder el nombre de las imágenes roja/azul y verde/azul generadas en destination_image_folder a partir de la celda 2.1.2. Para model_dir, introduce la ruta de archivo hacia una carpeta que contenga modelos de segmentación. Para segmentar núcleos rojos, usa el modelo erg_rb_opt e introduce 200 para la época. Renombra probmap_directory_name para designar la carpeta donde se guardarán los mapas de probabilidad rojo/azul. Repite este paso para imágenes verdes/azules. Para segmentar núcleos verdes, usa el modelo edu_mouse_bg_opt e introduce 100 para la época.
  9. En la celda 2.3.1, se crearán mapas de objetos basándose en los mapas de probabilidad generados en el paso 6.8. El input_folder llevará el nombre del destination_image_folder de la Celda 2.1.2 que contiene imágenes de mapas de probabilidad roja/azul generadas en la Celda 2.1.2. Nombra los output_folder donde se almacenarán imágenes rojas/azules con umbral. Establezca un umbral para el nivel de confianza en la segmentación nuclear (rango de 0,0-1,0). Ejecutar Cell 2.3.1. Repite este paso para imágenes verdes/azules.
    NOTA: Los umbrales para el nivel de confianza sobre los núcleos dependerán del conjunto de datos. Empieza con un umbral de 0,9 y ajusta más alto si es demasiado flexible y más bajo si es demasiado estricto, basándote en la inspección aleatoria de los mapas de probabilidad.
  10. En la celda 2.3.2, el número de celdas en los mapas de objetos generados en el paso 6.10 se contará y exportará a un archivo .csv. El count_folder llevará el nombre del output_folder de la celda 2.3.1, donde se guardan las imágenes rojas/azules con umbral. Para excluir objetos que toquen el borde de una imagen, asegúrate de que ignore_border_cells lea Verdadero. Renombra csv_path al nombre de ruta de la base_folder donde se almacenan todas las subcarpetas. Edita el nombre del csv para reflejar los conteos de objetos rojos/azules. Repite este paso para imágenes azules/verdes.
  11. En la Celda 2.4, se contarán los núcleos dobles positivos verde/rojo. Renombra img_folder al nombre de la subcarpeta generada en el paso 6.8 que contiene imágenes recortadas de 3 canales. Renombrar childcell_folder a la output_folder desde la celda 2.3.1, donde se guardan las imágenes rojas/azules con umbral. Renombra parentcell_folder a la output_folder desde la celda 2.3.1, donde se guardan las imágenes verde/azul con umbral. Renombra dest_folder para designar la carpeta donde se guardarán los mapas de objetos dobles positivos. Renombra csv_path para designar el nombre de ruta y el nombre del archivo a la base_folder donde se almacenan todas las subcarpetas y edita el nombre del csv para reflejar los conteos de objetos doblemente positivos.
  12. Verifica la segmentación precisa comparando los recuentos positivos rojos, verdes y dobles generados por imagen con la imagen en bruto.
    1. Si CardioCount sobreestima consistentemente el número de núcleos en una imagen en relación con lo que contaría un revisor ciego, repite el paso 6.9 con un umbral de confianza más alto y repite los pasos 6.10-6.11. Si CardioCount subestima el número de núcleos en una imagen en relación con lo que contaría un revisor ciego, repite el paso 6.9 con un umbral de confianza más bajo y repite los pasos 6.10-6.11.
  13. Suma todos los conteos de cada hCO para núcleos rojos, verdes y núcleos doblemente positivos. Calcular el % de núcleos en ciclo como (núcleos doblemente positivos / núcleos rojos totales de CM) x 100 para cada organoide.

7. Lesión por hipoxia-reoxigenación

  1. Preparar medios para hipoxia (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mMNaH 2PO4, 1,3 mM MgSO4, 0,5 mMMgCl 2, 0,9 mMCaCl 2, 20 mM lactato sódico y 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. A un matraz de cultivo celular, transfiere 5 mL de medio de hipoxia por cada placa de hCO de 96 pozos. Coloca el matraz de cultivo celular dentro de la cámara de hipoxia y enjuaga con gas anóxico (5% CO2, 95%N 2) durante 3 minutos. Incuba a 37 °C durante al menos 1 hora antes de iniciar la hipoxia.
  3. Elimina todos los medios de los hCOs. Empieza eliminando ~150 μL con una pipeta multicanal de todos los pozos. Luego, se utiliza una pipeta de 200 μL para retirar cuidadosamente el medio restante de los pozos individuales, sin alterar los hCOs.
    NOTA: La eliminación de todo el medio de todos los pozos es fundamental para lograr daños reproducibles.
  4. Añade 50 μL de medios de hipoxia a cada pozo. Coloca la placa de hCO en la cámara de hipoxia y enjuaga con gas anóxico (5% CO2, 95%N 2) durante 3 minutos. Coloca la cámara de hipoxia en la incubadora a 37 °C durante 6 horas.
  5. Para iniciar la reoxigenación, retirar los hCOs de la cámara de hipoxia y alimentar con 150 μL de medio RB+ precalentado. Permitir al menos 3 horas de reoxigenación a 37 °C antes de realizar ensayos aguas abajo.

8. Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa

  1. Recoger 20 μL de medios de pozos de hCOs dañados y no dañados en el momento deseado tras iniciar la reperfusión. Diluir 1:10 en 180 μL de tampón de almacenamiento de LDH (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10% de glicerol, 1% de BSA). Guarda a -20 °C hasta estar listo para realizar el ensayo. Pipetea varias veces para mezclar el medio antes de la recogida
  2. Descongelar medios congelados. Añadir 45 μL de buffer de almacenamiento LDH a un pozo de una placa de pared negra con fondo transparente de 96 pozos para cada muestra de medio a analizar. Añade 5 μL de medio diluido 1:10 a cada pozo para una dilución final de 1:100. Prepara el reactivo de detección de LDH mezclando 50 μL de mezcla enzimática de detección LDH y 0,25 μL de sustrato de reductasa para cada muestra a analizar.
  3. Añadir 50 μL de reactivo de detección de LDH a cada pozo que contenga un medio diluido 1:100. Incuba a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante 60 minutos. Ensayo para señal bioluminiscente en un lector de placas compatible.

9. Imagen de calcio

  1. Prepara una solución de tinción de tinte de calcio con RPMI-1640 sin fenol rojo, plürónico al 0,04% y Cal520-AM de 5 μM. Protege las muestras de la luz.
  2. Retirar 100 μL de medio de cada pozo destinado a la imagen de calcio. Añade 100 μL de solución tintora de tinte de calcio e incuba a 37 °C, protegida de la luz, durante 30 minutos.
  3. Retirar 100 μL de medio de cada pozo con tinte de calcio y sustituir por 100 μL de RPMI-1640 sin fenol rojo. Incubar durante 30 minutos - 1 hora a 37 °C para permitir el lavado del tinte.
  4. Utilizando un microscopio con capacidades de imagen/transmisión continua, coloca la placa de fijación ultrabaja de 96 pozos en posición de trabajo. Con un objetivo de 10x, identifica la base de un hCO y observa los transitorios de Cal520.
  5. Captura registros de 30 s de transitorios de calcio a temperatura ambiente. Si se utiliza un microscopio confocal, no será posible obtener imágenes a través de todo el hCO. Selecciona un plano focal cerca de la base del hCO, donde los contornos celulares sean visibles durante los transitorios de calcio.

10. Análisis de transitorios de calcio (Figura 3)

  1. El análisis de transitorios de calcio puede realizarse utilizando una variedad de programas de análisis de picos. A continuación se muestran instrucciones para el análisis utilizando el plugin SpikyImageJ 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Añade cinco regiones de interés (ROIs) de 2 x 2 píxeles al Gestor de ROI a lo largo de celdas visibles en cada hCO. Ten cuidado de no solaparse los ROI con los núcleos o límites celulares, ya que el movimiento del hCO puede afectar al análisis de transitorios.
  3. En Analizar > Establecer Mediciones, seleccione Intensidad Gris Media. En el gestor de ROI, selecciona Multi-Measure para capturar la intensidad gris media en todos los ROI y en todos los fotogramas de la grabación.
  4. Guarda un archivo .csv que contiene la intensidad gris media para todos los retornos de inversión. Guarda todas las posiciones de retorno de inversión de cada imagen para referencia posterior.
  5. En una nueva hoja de cálculo, añade una columna para el tiempo(s). Calcula el tiempo en cada fotograma dividiendo los 30 s por el número total de fotogramas y luego multiplicando por el número de fotogramas. Guarda esto como una .csv editada.
  6. Abre el archivo de .csv editado en Fiji y abre el Plugin Spiky. En Opciones de Análisis, selecciona los parámetros de análisis deseados.
  7. Tiempo(s) de trazado en el eje X, e intensidad gris media para el ROI #1 en el eje Y. Selecciona Analizar picos y confirma la anotación correcta de la línea base, inicio/final del pico y amplitud del pico. Si se identifica el número incorrecto de picos, cambiar los parámetros en las Opciones de Análisis, incluyendo la amplitud mínima del pico desde la línea base, y comenzar el umbral de pico hasta que la identificación de picos sea exitosa.
  8. Guarda todos los archivos intermedios. Los latidos por minuto (bpm) pueden calcularse dividiendo 60 por la media del intervalo pico a pico para cada ROI.
  9. Repite el análisis anterior para todos los ROI por hCO.

figure-protocol-3
Figura 3: Análisis de transitorios de calcio. (A) El recuadro rojo indica el botón que abre el menú desplegable para elegir parámetros de análisis. (B) La casilla roja indica el botón para representar el Tiempo (s) frente a la Intensidad Gris Media a partir de un ROI dentro de un hCO representativo no lesionado. (C) El recuadro rojo indica el botón para seleccionar análisis de picos. (D) Análisis representativo de trazas y picos de transitorios de calcio de un hCO no lesionado. Los triángulos rojos indican el máximo máximo, los cuadrados rosas representan la pendiente máxima para el pico ascendente y descendente, el recuadro verde indica el inicio del pico y el recuadro azul indica la línea base. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siguiendo el protocolo anterior, se deberían producir hCOs bien formados que comienzan a latir entre los días de diferenciación 7-12 (D7-12). A medida que los hCOs maduran después del día 25, es posible que las contracciones espontáneas dejen de ser visibles sin estimulación eléctrica. La lesión de H/R puede realizarse en cualquier momento después de que los hCOs empiecen a bater; normalmente realizamos lesiones en hCOs de 15 días (D15) o más tarde.

Co...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo paso a paso para generar y lesionar hCOs autoensamblantes con H/R. Las enfermedades cardíacas isquémicas se caracterizan por remodelación fisiopatológica, incluyendo muerte de cardiomiocitos, remodelación fibrótica, disfunción eléctrica y deterioro funcional. Estas perturbaciones se observan en el sistema modelo de hCO, incluyendo un aumento de los CM de TUNEL+ , un aumento en la liberación de LDH, un aumento en la superficie tisular de Vimen...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo está respaldado por R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) y el programa de Formación de Científicos Médicos de la Universidad de Duke T32 5T32GM145449-03 (LP).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de accutasaSigma-AldrichA6964-500ML
Anticuerpo anticardíaco Troponina TAbcamEPR20266
Suplemento de B-27 (50X), sin sueroGibco17504044
Suplemento de B-27, sin insulinaGibcoA1895602
Lector de placas BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabPMID: 38984052
Línea celular (Homo sapiens, masculino) - Línea iPSC DU11Núcleo de células madre de la Universidad de Duke
Portaobjetos de microscopio cargados, vidrio blancoVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRTecnologías STEMCELL5888
Microplacas de Corning 96-Well Clear Ultra Low AttachmentFisher7007
Depósitos desechables de pipetosVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
Microscopio Fluorescente EVOSEVOS
Matriz basal basal de Geltrex con factor de crecimiento reducido, libre de LDEV, cualificada para células madreGibcoA1413302
Activina humana, una proteína recombinantePEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2Tecnologías STEMCELL72124
Ácido L-Ascórbico (Cristalino/ACS certificado)Fisher ScientificA61-100
Anti-Vimentina para ratonesDSHBAMF-17b
mTeSR PlusTecnologías STEMCELL100-0276
Placas de cultivo celular multipozo y ndash; 12 pozoVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRTecnologías STEMCELL100-0483
RPMI 1640 MedioGibco11875119
RPMI 1640 Media, sin rojo fenólicoGibco11835-030
TiazovivinaTecnologías STEMCELL72254
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.SAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Microscopio Confocal Zeiss Spinning DiskZeiss

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Artículos relacionados