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Artículo de método

Medición de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares epiteliales traqueales de ratón diferenciados en la interfaz aire-líquido

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DOI:

10.3791/70311

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3 de julio de 2026

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1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para cuantificar la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) midiendo nitrito en secreciones apicales mediante un ensayo de quimioluminiscencia basado en triioduros.

Resumen

Los cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) proporcionan un modelo fisiológicamente relevante para estudiar la señalización de óxido nítrico (NO) en células ciliadas. Aquí describimos un protocolo para cuantificar la producción de NO midiendo nitrito (NO₂⁻), un producto de oxidación estable del NO, en muestras recogidas de células epiteliales traqueales de ratón diferenciadas por ALI. Se recogen y analizan lavados apicales, medios basales y lisados celulares utilizando un ensayo quimioluminiscencia a base de triyoduro acoplado a un analizador de óxido nítrico (NOA). Al inyectarse en el recipiente de reacción, el nitrito se reduce químicamente a NO, que se detecta mediante quimioluminiscencia basada en ozono. La intensidad de la señal se cuantifica y se convierte en picomoles de nitrito usando una curva de calibración estándar, y los valores se normalizan al contenido total de proteínas celulares. El rendimiento del ensayo se valida mediante modulación farmacológica de los niveles de NO. Tras el tratamiento con el NO de donante de dietilenotriamina NONOato (DETA-NONOato) y el inhibidor de la NO sintasa N(ω)-Nitro-L-arginina éster metilo (L-NAME), observamos diferencias significativas en los niveles de nitritos entre las condiciones. La señal más robusta y reproducible se observa en lavados apicales, correspondiente a la cantidad de NO liberada por el epitelio de las vías respiratorias. Este método detecta de forma fiable el NO en muestras de epitelios de las vías respiratorias diferenciadas por ALI, proporcionando una plataforma in vitro precisa para cuantificar la producción de NO y modelar enfermedades asociadas con un metabolismo anormal del NO.

Introducción

Una característica distintiva de varias enfermedades de las vías respiratorias, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ) y discinesia ciliar primaria (DCP), es la alteración de la homeostasis del óxido nítrico (NO), medible como cambios en los niveles de NO exhalados, que pueden variar mucho en estas enfermedades, siendo elevadas en EPOCy asma 1,2, mientras que drásticamente reducidas en FQ yDCP 3. 4. Estas enfermedades suelen presentar anomalías en los cilios móviles epiteliales de las vías respiratorias, los principales efectores de la depuraciónmucociliar 5. Dado que el NO y sus vías de señalización posteriores son reguladores críticos de la motilidad ciliar, entender cómo se alteran la producción y señalización del NO en estos contextos es esencial para dilucidar los mecanismos de la disfunción mucociliar. Por ello, un método que permita la detección precisa de la producción y liberación de NO en epitelios de las vías respiratorias proporciona una herramienta valiosa para analizar la regulación y el papel fisiológico de esta molécula de señalización. Estos enfoques son especialmente útiles en entornos experimentales donde la medición directa del NO resulta difícil debido a su corta vida media y rápida reactividad.

El NO regula la biogénesis y función de los cilios de las vías respiratorias influyendo en la polaridad celular ciliada y en el batido coordinado de los ciliosmóviles 6,7,8. Sin embargo, los mecanismos que mantienen LA AUSENCIA de homeostasis en las vías respiratorias siguen siendo incompletos comprendidos. Los cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) proporcionan un valioso sistema in vitro para investigar estos mecanismos. Actualmente, este modelo se utiliza ampliamente para estudiar el impacto de los insultos ambientales en el epitelio de las víasrespiratorias 9,10,11 y para esclarecer la fisiopatología de las enfermedades de las víasrespiratorias 12. En comparación con los cultivos sumergidosconvencionales 13,14, los epitelios diferenciados por ALI reproducen de forma más fiel la arquitectura y función de la vía aérea nativa, incluyendo la polarización epitelial, la diferenciación mucociliar y el intercambio realista gas-líquido, lo que los hace especialmente adecuados para estudiar la liberación apical de NO, la señalización y la función ciliar relacionada. Por tanto, este sistema es muy adecuado para experimentos destinados a cuantificar metabolitos derivados del NO liberados en el lumen de las vías respiratorias, especialmente bajo condiciones de diferenciación epitelial o manipulación farmacológica.

Es esencial una medición precisa de la concentración de NO, ya que tanto niveles excesivos como deficientes de NO pueden afectar la función ciliar. Actualmente, los métodos basados en sondas fluorescentes (por ejemplo, diaminofluoresceínas, DAFs) disponibles para detectar NO son solo semicuantitativos y están limitados por la sensibilidad al pH, la dependencia del ogénio y la falta de especificidad, ya que pueden reaccionar con oxidantes y antioxidantes celulares, lo que resulta en medicionessemicuantitativas 15. Además, los sensores electroquímicos (por ejemplo, electrodos amperométricos sensibles al NO) permiten la detección en tiempo real delNO 16, pero pueden ser difíciles de implementar en sistemas biológicos complejos debido a la ausencia de vida media corta, interferencias por la incrustación bioactiva de especies redox en la superficie del electrodo y dificultades para mantener una calibraciónestable 17. También se han descrito enfoques alternativos basados en quimioluminiscencia, incluyendo la detección directa de NO en fase gaseosa y ensayos reductivos dirigidos a diferentes especies de óxidos de nitrógeno, pero su aplicación a cultivos epiteliales de las vías respiratorias sigue sin explorar. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de métodos sensibles y cuantitativos que puedan detectar de forma fiable bajos niveles de especies derivadas del NO en muestras biológicas de pequeño volumen. Para superar estas limitaciones, establecimos un protocolo para cuantificar el NO en secreciones apicales recogidas de epitelios de las vías respiratorias diferenciadas por ALI utilizando un Analizador de Óxido Nítrico (NOA). El NOA es un detector altamente sensible basado en quimioluminiscencia, tradicionalmente utilizado para medir metabolitos NO en muestras químicas y más recientemente adaptado para el análisis de muestras biológicas, incluyendo sangre, homogeneados tisulares y sobrenadantes de cultivoscelulares 7,18,19. El NO es una molécula de señalización altamente reactiva que se oxida rápidamente a nitritos en los tejidos bajo condiciones de oxígeno normales, con una vida media excepcionalmente corta. Así, el nitrito como producto final de la oxidación del NO sirve como indicador de la producción total de NO en sistemasbiológicos 20,21,22. Este método de quimioluminiscencia sensible y reproducible permite la detección de nitrito/NO en nivelespicomolares 23,24, lo que lo hace ideal para medir pequeños cambios en muestras biológicas de bajo volumen, como las derivadas de cultivos MTEC ALI. Sin embargo, este enfoque es más adecuado para condiciones donde la acumulación de nitritos refleja la producción reciente de NO y puede verse influenciada por factores como la manipulación de la muestra, la contaminación por nitritos de fondo y el estado de diferenciación epitelial. Por ello, se requieren controles adecuados y un diseño experimental cuidadoso para garantizar una interpretación precisa de los resultados.

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Protocolo

Todos los procedimientos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland (Protocolo # AUP–00004632).

NOTA: El protocolo requiere aproximadamente 2 días para el aislamiento de células epiteliales traqueales de ratón (MTEC), seguidos de 7–10 días para la expansión, 5–6 días para la proliferación en insertos transwell, 21 días para la diferenciación (tiempo necesario para adquirir suficientes células multiciliadas), 24 horas de tratamiento farmacológico y un día adicional para la recogida de muestras, calibración de la NOA, inyecciones y adquisición de datos.

1. Preparación de medios y soluciones

NOTA: Consulte la Tabla 1 para detalles sobre los ingredientes del medio.

  1. Medios F–12 de Ham
    1. Prepara la solución dentro de una campana de flujo laminar estéril. Añade 5 mL de antibióticos 100× penicilina/estreptomicina y 0,5 mL de Anfoterecina B (Fungizone) a 500 mL de medio F12 de Ham en un frasco estéril.
    2. Mezcla invirtiendo suavemente la botella 5–10 veces para asegurar una mezcla completa. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles y almacenarla a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: La penicilina/estreptomicina y la anfotericina B son agentes antimicrobianos que pueden causar irritación o reacciones alérgicas. Manipula el uso de equipos de protección personal adecuados, incluidos guantes y bata de laboratorio.
  2. Solución pronasa
    1. Añadir 15 mg de pronasa a 10 mL de medio F12 de Ham's estéril en un tubo estéril para obtener una solución de pronasa al 0,15%. Mezcla invirtiendo suavemente o pipeteando arriba y abajo hasta que la pronasa esté completamente disuelta. Prepáralos frescos justo antes de usarlos.
  3. Solución DNasa I
    1. Añade 5 mg de DNasa pancreática cruda I a 9 mL de medio F12 de Ham y 1 mL de solución de albúmina sérica bovina (BSA) de 10 mg/mL en un tubo estéril para obtener una solución de 0,5 mg/mL de DNasa I.
    2. Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo hasta que la DNasa I esté completamente disuelta, evitando la formación de burbujas. Una vez completamente disuelta, se pone la solución en tubos estériles de microcentrífuga de 1 mL y se almacena a -20 °C.
  4. Medios F12 de Ham's con suero fetal bovino (FBS)
    1. Prepara la solución a temperatura ambiente dentro de una campana laminar estéril. Añadir 10 mL de suero fetal bovino (FBS) a 40 mL de medios F12 de Ham con antibióticos en un tubo cónico estéril para obtener un 20% de FBS en medio F12.
    2. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 5–10 veces hasta que la solución quede homogénea. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles y almacenarla a 4 °C.
  5. Medios de expansión MTEC
    1. Prepara el medio de expansión MTEC a temperatura ambiente dentro de una campana de flujo laminar estéril combinando los componentes listados en la Tabla 1 en una botella estéril.
    2. Mezcla bien girando suavemente o invirtiendo el recipiente hasta que todos los componentes estén completamente combinados. Esteriliza la solución con un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles.
    3. Añadir el inhibidor de ROCK Y–27632 (solución stock de 5 mM) a una concentración final de 10 μM y el inhibidor de la γ-secretasa Notch DAPT (solución stock de 10 mM) a una concentración final de 5 μM inmediatamente antes de su uso, y mezclar suavemente por inversión.
  6. Medios de proliferación MTEC
    1. Prepara el medio de proliferación MTEC a temperatura ambiente dentro de una campana de flujo laminar estéril combinando los componentes listados en la Tabla 1.
    2. Mezcla bien mediante una suave inversión o remolino hasta que todos los componentes estén completamente combinados. Filtra el medio usando un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles.
    3. Inmediatamente antes de su uso, añadir el inhibidor de ROCK Y–27632 (solución de stock de 5 mM) a una concentración final de 10 μM y ácido retinoico (solución stock de 5 μM) a una concentración final de 0,05 μM. Mezclar suavemente por inversión antes de su uso.
  7. Medios de diferenciación MTEC
    1. Prepara el medio de diferenciación MTEC a temperatura ambiente dentro de una campana laminar estéril combinando los componentes listados en la Tabla 1 en un recipiente estéril.
    2. Mezcla bien mediante una suave inversión o remolino hasta que todos los componentes estén completamente combinados. Filtra el medio usando un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles.
    3. Inmediatamente antes de usar, añade ácido retinoico a una concentración final de 0,05 μM y mezcla suavemente por inversión.

2. Aislamiento de células epiteliales traqueales de ratón (MTEC)

  1. Eutanasiar a tres ratones adultos (de 8 a 20 semanas) mediante inhalación de dióxido de carbono (CO2) en una cámara de eutanasia aprobada según las directrices institucionales de la IACUC. Confirma la muerte antes de la recogida de tejido.
  2. Coloca al animal dorsalmente (con el pecho hacia arriba) sobre una superficie aséptica. Con pinzas limpias, levanta suavemente la piel y córtala con tijeras quirúrgicas desde el labio inferior hasta el abdomen para exponer la tráquea.
  3. Aparta las glándulas salivales y retira el tejido conectivo y el músculo traqueal para exponer los anillos del cartílago. Disecciona toda la longitud de la tráquea y colócala en una placa de Petri que contiene el medio F12 de Ham's estéril. Combina tres tráqueas en un solo plato.
  4. Transfiere el plato a una campana laminar y coloca la tráquea en otro plato con el medium F12 de jamón fresco. Retira cualquier tejido extratraqueal y corta la tráquea longitudinalmente a través de la luz.
  5. Transfiere todas las tráqueas a un tubo cónico de 50 mL con tapa de rosca que contiene una solución estéril de 10 mL de pronasa al 0,15%. Incubar a 4 °C durante 16–18 horas.

3. Aislamiento de la celda y expansión inicial

  1. Al día siguiente, invierte el tubo que contiene los tejidos 10–15 veces para desalojar las células epiteliales e incubar a 4 °C durante 45 minutos. Detiene la reacción pronasa añadiendo 10 mL de medio de Hams que contenga un 20% de FBS y mezcla invirtiendo 10–15 veces.
  2. Añade 10 mL de F12 medium de Ham con FBS a tres tubos de 15 mL. Con una pipeta Pasteur transfiere secuencialmente el tejido traqueal desde el tubo de 50 mL al primer, segundo y tercer tubo de 15 mL e invierte 10–15 veces en cada tubo para desalojar las células epiteliales traqueales. Desecha el tejido tras la transferencia final.
  3. Combina todo el medio de los tres tubos cónicos de 15 mL con el medio del tubo de 50 mL. Centrifugar a 360 × g durante 10 minutos a 4 °C. Retira cuidadosamente el sobrenadante y añade 0,5 mL de solución de DNasa I de 0,5 mg/mL. Incuba en hielo durante 5 minutos.
  4. Centrifugar a 360 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender la pastilla en 7–10 mL de medio de expansión MTEC.

4. Expansión y diferenciación del MTEC

  1. Prepara un matraz de cultivo celular T75 recubierto de colágeno usando 10 mL de colágeno I (cola de rata) a 50 μg/mL e incuba a 37 °C durante 16–18 horas. Aspira la solución de colágeno del matraz T75 y lava el frasco tres veces con PBS (1×). Deja que el frasco se seque completamente.
  2. Siembra la suspensión celular que consiste en 7–10 mL de medio de expansión MTEC que contiene las células en el matraz recubierto de colágeno. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Cambia el medio de expansión cada 2 o 3 días y monitoriza el número de células hasta que haya un 70% de confluencia.
  3. Con una confluencia del 70%, añadir 1 mL de solución de Accutasa e incubar durante 10–15 minutos a 37 °C para desprender la monocapa celular. Resuspende las células en 10 mL de medio de proliferación MTEC. Centrifuga a 1057 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Descarta el sobrenadante, vuelve a suspender las células en el medio de proliferación y cuenta las células.
  5. Semilla 2 × 105 células en un volumen de 0,5 mL por inserto transwell (12 mm de diámetro de membrana, 0,4 μm de poro de membrana) pre-recubierta con colágeno. Añade 1,5 mL de medio a la cámara basal de cada inserto y coloque el transpozo en la incubadora a 37 °C.
  6. Cambiar el medio tanto en la cámara apical como en la basal en el día 3 y permitir que las células alcancen la confluencia del 100%, normalmente en el día 5 o 6. Incluye un inserto sin celdas como control.
  7. Una vez confluyidos, lava las células apicicamente con 0,5 mL de medio de diferenciación MTEC. Inicia la interfaz aire-líquido (ALI) añadiendo 0,75 mL de medio de diferenciación solo a la cámara basal, dejando las células de la cámara apical expuestas al aire.
  8. Cada 2–3 días, lava las células de la superficie apical con medio diferenciador y reemplaza el medio basal. Permite que las células se diferencien en la ALI durante 21 días.

5. Inmunomarcaje e imagen de células epiteliales ciliadas

  1. En los días 7, 14 y 21 de la ALI, fijar las células con paraformaldehído (PFA) al 4%.
  2. Realizar inmunomarcaje de células con anticuerpo anti-FoxJ1 para detectar FoxJ1, un factor de transcripción esencial para la ciliogénesismóvil 25,26, y anticuerpo anti-α-tubulina acetilado para detectar la α–tubulina acetilada, un marcador estructural de los cilios móviles según los protocolospublicados 27,28,29.
    PRECAUCIÓN: El PFA es un químico peligroso, así que lleva el EPI adecuado (como mínimo guantes de nitrilo y bata de laboratorio) al fijar las células.
  3. Obtén imágenes de las células inmunomarcadas mediante microscopía confocal utilizando un objetivo del 40× o 60×. Recoge pilas Z que abarcan una profundidad de 10 μm con cada paso de 0,5 μm.
  4. Ajusta la potencia del láser, la ganancia del detector y los ajustes de exposición para evitar la saturación de la señal y mantener parámetros de adquisición comparables entre muestras.
  5. Cuantifique las células FoxJ1–positivas o tubeina acetiladas como porcentaje de células totales (DAPI–positivas) por región de interés (ROI) utilizando el plugin de contador celular en el software de imagen FIJI.
  6. En el software GraphPad Prism (v. 10.0) genera gráficos y realiza análisis estadísticos usando una prueba t de Student de dos colas tras evaluar la distribución de datos para comprobar la normalidad usando la prueba de Shapiro-Wilk.

6. Tratamiento farmacológico de epitelios diferenciados de las vías respiratorias

  1. En el día 21 de la ALI se prepara el medio de diferenciación (3 mL para células en tres insertos) en un tubo estéril a temperatura ambiente.
  2. Añadir 7,5 μL de dietileno triamina–NONOato o DETA/NO de una solución stock de 100 mM (preparada en 10 mM de NaOH) al medio de diferenciación para lograr la concentración final de 250 μM en 3 mL. Mezcla suavemente por inversión y úsalo inmediatamente.
  3. Añadir 750 μL de la solución final a cada una de las tres cámaras basales de células diferenciadas e incubar durante 24 horas a 37 °C.
  4. Preparar 1 mM de éster metilo Nω-Nitro-L-Arginina (L–NAME) añadiendo 30 μL de la solución original L-NAME de 100 mM (preparada en DMSO) a un medio de diferenciación MTEC para un volumen total de 3 mL.
  5. Añade 750 μL de la solución final a cada una de las tres cámaras basales e incuba durante 24 horas a 37 °C.
  6. Añadir 30 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) solo (grupo no tratado) a 3 mL de medio basal (1% v/v).
  7. Añadir 750 μL de la solución final en la cámara basal de tres insertos (sin tratar).

7. Recogida de muestras

NOTA: Para el análisis de NOA es necesario agrupar muestras de medios, lavado apical y lisado celular de tres insertos.

  1. En el día 22 de la ALI, se recogen muestras de los epitelios diferenciadores de las vías respiratorias comenzando con 750 μL de medios basales de cada uno de los tres insertos por grupo experimental.
  2. Recoger medios basales incubados en insertos sin células para servir como control en blanco que tengan en cuenta la posible contaminación externa por nitritos.
  3. Agrupa el medio basal de tres insertos y almacena inmediatamente a -20 °C hasta la inyección en NOA.
  4. Para recoger el nitrito/NO presente en el moco apical del epitelio, añade 50 μL de PBS (1×) de amortiguador precalentado (estéril, aliculado y congelado) sobre las células de cada inserto e incubar durante 30 minutos a 37 °C.
    NOTA: Durante los 30 minutos de incubación de las células con PBS para recoger el lavado apical, también se puede añadir PBS en la cámara basal para mantener la hidratación en ambos lados de las células.
  5. Recoge el PBS que contiene el moco que cubre el epitelio.
  6. Agrupar los lavados de PBS de tres insertos para obtener alrededor de 150 μL de moco apical/PBS de cada condición experimental, lo que será suficiente para dos inyecciones de NOA.
  7. Guarda las muestras de lavado apical a -20 °C hasta que se use más.
  8. También guarda el buffer de lavado PBS para usarlo como control en blanco durante las inyecciones de NOA.
  9. Lava dos veces los lados apical y basal de las células en tres insertos con 500 μL de PBS precalentado.
  10. Añade 500 μL de solución de Accutasa apicamente e incuba durante 15–20 minutos hasta que las células se desprendan completamente de las membranas.
  11. Una vez completamente desacoplado, añadir medio RPMI-1640 sin suero a las células (con una proporción de medio 3:1 a Accutasa).
  12. Reúne las celdas separadas de los tres insertos en un solo tubo.
  13. Centrifuga las células a 3000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  14. Resuspende el pellet celular en 50 μL de solución lisisable (buffer RIPA + cóctel inhibidor de proteasas Halt 1×) e incuba sobre hielo durante 45 minutos.
  15. Centrifuga el lisado a 14.800 × g durante 20 minutos a 4 °C y recoge el sobrenadante.
  16. Utiliza 3 μL de lisato de célula entera para determinar la concentración de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinquinínico (BCA).
  17. Diluir la solución de lisato restante 1:1 en el tampón RIPA para obtener suficiente volumen para dos inyecciones de NOA de 50 μL.
  18. Conserva los lisados a -80 °C hasta inyectar en el NOA a -20 °C.
  19. Almacena el tampón RIPA utilizado para resuspender el pellet celular a -20 °C para usarlo como blank y control de contaminación para muestras de lisato.

8. Calibración de NOA e inyecciones de muestras

  1. Prepara el reactivo triyoduro disolviendo 400 mg de yoduro potásico y 250 mg de yodo en 28 mL de ácido acético glacial y 8 mL de agua ultrapura.
  2. Realizar la preparación con reactivo triyoduro en una campana extractora química utilizando el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular).
    PRECAUCIÓN: El yodo y el ácido acético glacial son peligrosos y pueden causar irritación y corrosión en la piel y los ojos.
  3. Guárdalos a temperatura ambiente y úsalo en un plazo de 2 semanas desde la preparación.
  4. Prepara 1 mM de solución de nitrito de sodio en agua sin nitritos.
  5. Guarda la solución de base a -20 °C hasta su uso.
  6. Preparar nuevos estándares de trabajo (0,125–4,0 μM) en PBS inmediatamente antes de las inyecciones.
    NOTA: Para la calibración de NOA, utilice PBS estéril y con tapón firme para minimizar la contaminación por nitritos.
  7. Activa el gas portador de nitrógeno (N2) e inicia el flujo de gas a través del sistema.
  8. Monta el recipiente de purga de vidrio y añade 4 mL de reactivo triyoduro en el recipiente con 20 μL de espuma anti-espuma diluida 1:10.
  9. Tapa firmemente con un tabique sujeto por la tapa de rosca para asegurar un sellado hermético.
  10. Vierte 10 mL de hidróxido de sodio (NaOH) en el sifón de NaOH.
  11. En la pantalla del instrumento NOA (nCLD 88) selecciona Medición, selecciona Gas y Cocina.
  12. Configura el instrumento a MR2:50.00, correspondiente a un rango de medición entre 0 y 50 partes por billón de NO, y selecciona Rápido para la configuración del filtro.
  13. Ajustar la presión del gas nitrógeno hasta que la presión del reactor se estabilice entre 27–29 psi (186–200 kPa).
  14. Abre el software de gráficos eDAQ en el ordenador conectado al NOA.
  15. Ajusta el rango de adquisición a 10/s y el voltaje a 10 V.
  16. Navega a Configuración > Configuración de canal, selecciona Canal 1.
  17. Configura la escala de visualización a 2:1 en el software NOA.
  18. Inicia la adquisición de datos en el instrumento NOA y en el software.
  19. Controla la línea base hasta que se estabilice.
  20. Inyectar 10 μL de PBS a través del tabique en el vaso de purga utilizando una jeringuilla Hamilton para confirmar la estabilidad basal.
  21. Registra la señal quimioluminiscente de cada inyección.
  22. Inyectar 10 μL del estándar de nitrito de 0,125 μM en el recipiente de purga.
  23. Repite dos veces para cada patrón de nitritos, para obtener mediciones duplicadas que luego se promediarán.
  24. Anota cada inyección en la pestaña de comentarios (por ejemplo, 10 μL 0,5 μM nitrito).
  25. Limpia la jeringuilla sobre un pañuelo sin pelusa y enjuaga 3 o 4 veces con agua estéril sin nitritos para eliminar el exceso de triyoduro.
  26. Repite este paso de limpieza después de cada inyección.
  27. Permite que la señal vuelva a la línea base entre inyecciones (20–30 s).
  28. Abre la ventana de Análisis de Flujo .
  29. Revisa los valores de altura y tiempo de pico para cada inyección en la tabla de análisis.
  30. Resalta cada pico y ajusta la selección para calcular el área bajo la curva (AUC).
  31. Alterna la pantalla de S a C para activar el modo de calibración.
  32. Introduce las cantidades conocidas de nitritos para cada estándar en la columna de Cantidad .
  33. Haz clic en el botón de curva de calibración para generar la curva estándar.
  34. Verifica que la curva de calibración cumpla los criterios de aceptación (R2 ≥ 0,99).
  35. Deshielo de muestras biológicas previamente recogidas de cultivos ALI sobre hielo.
  36. Inyectar 50 μL de medio sin células en blanco en el recipiente de purga.
  37. Inyectar 50 μL de cada muestra de medio basal en el recipiente de purga.
  38. Registra la señal de quimiluminiscencia para cada inyección.
  39. Realiza inyecciones duplicadas (50 μL cada una) para cada muestra.
    NOTA: Las inyecciones de 50 μL provocan la formación frecuente de burbujas. Para limitar este problema, sustituye regularmente el reactivo triyoduro por antiespuma en el recipiente de purga.
  40. Anota cada muestra en la pestaña de comentarios antes de la inyección.
  41. Inyectar 50 μL de PBS libre de células (blank apical) en el recipiente de purga.
  42. Inyectar muestras de lavado apical (dos inyecciones de 50 μL por muestra) y registrar los picos de señal correspondientes.
  43. Inyectar el tampón RIPA dos veces, seguido de muestras de lisado (dos inyecciones de 50 μL por muestra) y registrar los picos de señal correspondientes.
    NOTA: Permite siempre que la traza quimioluminiscente regrese a la línea base y se estabilice. Espera entre 20 y 30 segundos y luego inyecta la siguiente muestra.
  44. Al final de las inyecciones de muestras, abre la ventana de Análisis de Flujo .
  45. Resalta cada pico de muestra para calcular el área bajo la curva (AUC).
  46. Determinar las concentraciones de nitritos para cada muestra utilizando la curva de calibración generada a partir de soluciones estándar.

9. Recogida, normalización y análisis de datos

  1. Exporta los datos, incluyendo la altura del pico (V), el área bajo la curva (V.s) y el área media bajo la curva desde la función de Análisis de Flujos en el software eDAQ a un archivo Excel. El archivo exportado tabulará la altura (V) frente al tiempo (s) de las trazas de señal para todo el experimento NOA.
  2. Determina los picomoles (pmol) de nitrito inyectados en el NOA multiplicando la concentración de nitrito (μM) por el volumen de inyección (μL).
  3. Promedia los picomoles (pmol) de nitrito medidos en controles (medios libres de células, tampón de lavado PBS o tampón RIPA).
  4. Resta los valores de control correspondientes del PMOL medido en cada inyección de 50 μL de muestra.
  5. Determina el total de picomoles (pmol) de nitrito en cada muestra multiplicando el pmol medido en la parte inyectada de la muestra por el volumen total exacto de la muestra recogida. Utiliza 750 μL para el medio, 150 μL para el lavado apical y alrededor de 90–100 μL para el lizado.
  6. Además, solo para los lisados, multiplica el pmol total de nitrito por 2 para tener en cuenta el factor de dilución.
  7. Normaliza el pmol de nitrito obtenido para cada muestra dividiendo estos valores por la cantidad total de proteína (μg) presente en el lisado de la muestra correspondiente, obtenido previamente mediante el ensayo BCA.
  8. Promedia los niveles de nitritos (pmol/μg) de inyecciones duplicadas para cada muestra.
  9. Grafica los niveles normalizados de nitritos (pmol/μg de proteína total) para cada muestra usando el software GraphPad Prism.
  10. Evalúa la distribución de datos para comprobar la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk.
  11. Realizar un análisis estadístico utilizando una prueba t de estudiantes de dos colas.

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Resultados

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de óxido nítrico (NO) en cultivos de células epiteliales traqueales de ratón (MTEC) diferenciadas en la interfaz aire-líquido (ALI). Las células primarias se aíslan y diferencian según los protocolosestablecidos 27,28. Durante 21 días en ALI, las células se diferencian en un epitelio pseudoestratificado de la vía aérea que contienecélulas cilia...

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Discusión

Las células multiciliadas dentro del epitelio de las vías respiratorias son críticas para la síntesis y señalización de NO, que a su vez es esencial para regular el latido ciliar, la limpieza mucociliar y la homeostasisde las vías respiratorias 6,7,8. El NO es una molécula altamente reactiva e incluso pequeños cambios en los niveles de NO se asocian con enfermedades de la...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Mark T. Gladwin (Decano y Profesor de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland) por su orientación sobre el diseño de los estudios. También agradecemos al Núcleo de Microscopía Confocal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland (Baltimore, MD) por acceder a los recursos de microscopía confocal. Este trabajo fue financiado por la subvención 5R01HL168775 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a la Dra. Paola Corti.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248diluted 1:2000 para inmunotinción
50 mL Tubo de centrífuga filtro (0.22 µm)CellTreat229710Para la preparación de soluciones estériles
Unidades de filtro de 500 mLThermoFisher Scientific566-0020Para la preparación de medio estéril
AccutaseSigmaA6964
Anfotericina BThermoFisher Scientific15290026
Extracto pituitario bovinoThermoFisher Scientific13028014
Albúmina sérica bovinaSigmaA7906
Toxina del cóleraSigmaC8052
Colágeno IThermoFisher ScientificA1048301
Microscopio confocalNikonMicroscopio Ti2 invertido con disco giratorio W1 con cámara sCMOS Hamamatsu
Insertos Corning TranswellSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
Medio DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11330032
DNAsa ISigmaDN25
Suero fetal bovinoSigmaF4135
Cocktail inhibidor de proteasas Halt 1XThermoFisher Scientific1860932
Mezcla de nutrientes Ham's F1-12ThermoFisher Scientific11765054
Solución de insulinaSigmaI0516
Clorhidrato de isoproterenolSigmaI6504
Medio libre de suero para queratinocitosThermoFisher Scientific17005042
Factor de crecimiento epidérmico murinoSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginina metiléster (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicilina-estreptomicinaSigmaP4333
Tampon fosfato salino (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Kit de ensayo de proteína Pierce BCAThermoFisher Scientific23227
PronasaSigma10165921001
Ácido retinoicoSigmaR2625
Inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632 clorhidrato)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
Tampon RIPASigmaR0278
Medio RPMI-1640ThermoFisher Scientific11875093
Nitrito de sodio SigmaS2252
TransferrinaSigmaT8158
Anticuerpo anti-tubulina alfa acetilada (ratón)SigmaT6793diluted 1:200 para inmunotinción
Anticuerpo anti-FoxJ1 alfa (ratón)ThermoFisher Scientific14-9965-80diluted 1:200 para inmunotinción
Anticuerpo secundario Cy3 anti-ratónThermoFisher ScientificA10521diluted 1:1000 para inmunotinción
Inhibidor gamma-secretasa IX (DAPT)SigmaD5942

Referencias

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