Desarrollo de nanovesículas envueltas en membrana de células madre mesenquimales para mejorar la entrega génica

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo introducir un método para producir y purificar biomiméticos extracelulares derivados de células madre mesenquimales (MSC) para la terapia génica. La nanovesícula está confinada con bicapas lipídicas derivadas de MSC y encapsula los AAVs recombinantes que portan el gen de interés en la luz. Esta nanovesícula ofrece un vector mejorado para la entrega de genes in vivo .

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células madre mesenquimales (MSC) presentan un gran potencial para aplicaciones terapéuticas y medicina regenerativa. Los EV son vesículas a escala nanométrica secretadas por todos los tipos celulares conocidos, transportando cargas diversas, incluyendo proteínas ancladas a membranas, factores solubles, múltiples especies de ARN y metabolitos que regulan la fisiología y el comportamiento de las células receptoras. Aunque los EV derivados o modificados en MSC pueden suministrar proteínas terapéuticas y ARN, la entrega de ADN mediada por EV sigue siendo un reto debido a la falta de mecanismos eficientes para clasificar las secuencias de ADN en vesículas. Trabajos previos de nuestro grupo y otros demostraron que los VE que contienen virus adeno-asociado (AAV) permiten la entrega nuclear dirigida y la expresión génica sostenida in vitro e in vivo. Sin embargo, su producción y aislamiento han estado limitados por procedimientos de bajo rendimiento y que requieren mucho tiempo. Aquí informamos del desarrollo de nanovesículas envueltas en membrana de MSC generadas por un método de extrusión definido por tamaño para una entrega eficiente de génis. Estas vesículas, de aproximadamente 200 nm de diámetro, imitan las propiedades de los EVs naturales mientras encapsulan vectores AAV recombinantes que portan secuencias génicas terapéuticas. En comparación con los AAV convencionales, las vesículas MSC diseñadas mejoraron la eficiencia de la administración génica y lograron rendimientos significativamente mayores con menor tiempo y coste en comparación con los EV-AAV secretados naturalmente. En resumen, presentamos una novedosa plataforma de nanovesículas de membrana basada en MSC que combina las ventajas de estructuras que imitan la EV con la transferencia génica mediada por AAV. Este enfoque mejora la eficiencia en la administración y la escalabilidad de la producción, ofreciendo una estrategia prometedora para avanzar la terapia génica hacia la traducción clínica.

Introducción

La terapia génica representa un enfoque transformador para tratar enfermedades genéticas y adquiridas mediante la introducción, reemplazo o silenciamiento de genes específicos para restaurar la función celular normal. En las dos últimas décadas, los avances en la ingeniería vectorial y las estrategias de administración han ampliado significativamente el panorama terapéutico de la terapia génica. Entre los diversos sistemas vectoriales desarrollados, el virus adeno-asociado (AAV) ha emergido como una de las plataformas más exitosas y ampliamente adoptadas debido a su perfil de seguridad favorable, transducción eficiente y expresión génica a largo plazo tanto en células en división como en^{no división 1,2}. Hasta la fecha, múltiples terapias basadas en AAV han recibido aprobación regulatoria para uso clínico, incluyendo tratamientos para atrofia muscular espinal, distrofias retinianas y hemofilia, marcando hitos importantes en la medicina^{traslacional 3}. El tropismo amplio y la baja inmunogenicidad de los vectores AAV también han permitido su aplicación en una variedad de tejidos, incluyendo el hígado, el músculo, el sistema nervioso central y^{el ojo 4}. Como resultado, AAV se ha convertido en una plataforma líder para la entrega de genes in vivo, apoyando estudios preclínicos y clínicos en curso dirigidos a trastornos metabólicos, neurológicos y cardiovasculares.

A pesar de su notable éxito clínico, la terapia génica basada en AAV enfrenta varios desafíos intrínsecos que siguen limitando su aplicación más amplia. Una limitación importante radica en la limitada capacidad de empaquetado genómico del cápside AAV (~4,7 kb), lo que restringe su uso para administrar genes terapéuticos grandes o^{múltiples 5,6}. Además, la biodistribución y el tropismo celular de los vectores AAV están en gran medida determinados por sus serotipos, cada uno mostrando afinidades distintas por tejidos específicos. Aunque se han empleado extensas estrategias de ingeniería de cápsides y exhibición de péptidos para mejorar la orientación tisular y la eficiencia de la transducción, lograr tropismos precisos y predecibles en diversos contextos biológicos sigue siendo un obstáculo^importante. Otra limitación crítica es la prevalencia de anticuerpos neutralizantes (NAb) preexistentes contra los serotipos naturales de AAV en la población humana. Incluso títulos bajos de NAbs pueden reducir sustancialmente la eficiencia de la transducción vectorial, limitando la elegibilidad del paciente y complicando la dosificación^{repetida 8,9}. Se han explorado diversas estrategias, como el rediseño racional de la cápside, regímenes inmunosupresores e intercambio plasmático transitorio, para mitigar la neutralización mediada por^{anticuerpos 10,11}, pero estos enfoques solo ofrecen alivio parcial o transitorio. En conjunto, estas limitaciones reducen la eficacia terapéutica global y la reproducibilidad de la administración génica mediada por el VA en entornos clínicos.

En los últimos años, se ha explorado el AAV envolvido por vesícula extracelular (EV-AAV) como un vector alternativo con el potencial de superar varias limitaciones clave de los AAV^{convencionales} 12,13,14,15. Durante el empaquetado vectorial, una parte de las partículas de AAV puede ser secretada a través de vías de tráfico vesicular y quedar encerrada dentro de vesículas extracelulares. Se cree que este proceso implica la proteína accesoria asociada a membranas (MAAP) codificada por AAV, que facilita la salida viral y promueve la asociación con^{membranas 16,17}. Las partículas resultantes de EV-AAV presentan una mejor eficiencia de transducción y una mayor resistencia a los anticuerpos neutralizantes en comparación con el AAV convencional, principalmente debido a la membrana vesicular que promueve la captación celular y proporciona un apantallamiento parcial frente al reconocimiento^{de anticuerpos 18}. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, la producción de vehículos eléctricos AAV sigue siendo ineficiente. Normalmente, solo una pequeña fracción de los genomas de vectores (aproximadamente 0,5%-12%) se secreta en el medio de cultivo como AAVs asociados a EV, mientras que la mayoría permanecen intracelulares o existen como AAVs libres^12,13. En consecuencia, se requiere una producción a gran escala para obtener un rendimiento vectorial suficiente. Además, la generación de EV-AAV se ha demostrado principalmente utilizando células productoras de HEK293T, cuyos EVs pueden presentar una rápida eliminación hepática, vida media de circulación corta y posibles preocupaciones de bioseguridad. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de una estrategia de envolvimiento de membrana más eficiente y personalizable, lo que motiva el desarrollo de la plataforma de AAVA envuelto en membrana celular (CME-AAV) presentada en este estudio.

Las células madre mesenquimales (MSC) y sus EVs han sido estudiadas extensamente por su potencial regenerativo y propiedades evasivas del sistema inmunitario. Más allá de terapias basadas en células o en vehículos eléctricos secretados de forma natural, estudios recientes han demostrado un enfoque alternativo para mejorar la administración de fármacos utilizando nanopartículas cubiertas con membranas^MSC 19,20,21. El recubrimiento de membrana MSC confiere capacidad de dirigimiento activo, reduce la eliminación inmunitaria y prolonga el tiempo de circulación, cuyos efectos probablemente se atribuyen a la composición molecular intrínseca de las membranas derivadas de^{MSC 22,23}. Basándonos en este concepto, utilizamos material de membrana derivado de MSC para construir una nanovesícula de AAV envolvida en membrana celular (CME-AAV) para la entrega de genes. Para lograrlo, fragmentos purificados de membrana MSC se mezclaron con partículas AAV recombinantes y se sometieron a un proceso de extrusión controlado, una técnica establecida originalmente para la fabricación de^{liposomas 24,25}. Mediante extrusión definida por tamaño, los componentes de la membrana se ensamblan espontáneamente en vesículas a nanoescala que encapsulan partículas de AAV. Los CME-AAV resultantes se purificaron aún más a partir de AAVs libres y no encapsulados mediante centrifugación basada en gradiente de densidad. Esta estrategia permite una preparación eficiente y reproducible de vectores AAV envueltos en membrana, que muestran una eficiencia de transducción notablemente mejorada en comparación con los AAV convencionales y mantienen una resistencia comparable a los anticuerpos neutralizantes que los EV-AAV. Al sustituir diferentes transgenes, la plataforma CME-AAV tiene un amplio potencial para el tratamiento de diversas enfermedades genéticas y adquiridas.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso animal de la Universidad Normal de Pekín en Zhuhai, China. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación y formación de CME-AAV mediante extrusión definida por tamaño de poro

1. Producción de vectores AAV recombinantes
   NOTA: El protocolo de producción de AAV sigue procedimientos previamente publicados y ampliamente utilizados. En estudios previos se han descrito pasos detallados de optimización^{y variaciones 12,26}.
   1. Cultiva HEK293T células en un medio de crecimiento completo y mantenlas en una confluencia del 70%-80% el día de la transfección.
   2. Preparar tres plásmidos que codifiquen (i) el vector de transferencia AAV que transporta el transgen de interés, (ii) los genes rep/cap AAV correspondientes al serotipo deseado, y (iii) las funciones auxiliares adenovirales.
   3. Co-transfección de HEK293T células con los tres plásmidos utilizando un método de transfección establecido (por ejemplo, fosfato de calcio o transfección a base de polímeros), siguiendo la práctica estándar de laboratorio.
   4. Incubar las células transfectadas durante 48-72 horas para permitir el ensamblaje y acumulación del AAV.
   5. Recoge células y cultiva el medio, y libera partículas de AAV mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación o un método equivalente de lisis celular.
   6. Centrifugar el lisado a baja velocidad para eliminar los restos celulares y recoger el sobrenadante que contiene partículas AAV.
   7. Purificar partículas AAV mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad u otro enfoque de purificación establecido.
   8. Intercambia vectores AAV purificados por solución salina estéril amortiguada con fosfato (PBS) y almacena las alicuotas a −80 °C hasta su uso.
2. Preparación de la fracción de membrana MSC
   NOTA: Las células madre mesenquimales humanas (MSC) fueron aisladas en cumplimiento de las directrices institucionales. Las células se cultivaron y expandieron bajo condiciones establecidas o protocolos modificados en laboratorio. La identidad de la MSC puede confirmarse evaluando la expresión de marcadores fenotípicos como CD73, CD90 y CD105 mediante citometría de flujo. La multipotencia de las MSC se verifica por su capacidad para diferenciarse en osteoblastos, condrocitos y adipocitos in vitro. Las células están listas para la recogida cuando alcanzan una confluencia del 70%-90%. No es necesario realizar los siguientes procedimientos en condiciones estériles.
   1. Retira el medio de cultivo y desconecta los MSC de la placa de cultivo usando un raspador de celdas.
   2. Recoge las células separadas en un tubo cónico que contenga PBS y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C para pelletar las celdas.
   3. Lava las células dos veces con PBS, centrifugando cada vez a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   4. Resuspende el último pellet celular en PBS suplementado con un cóctel inhibidor de proteasas.
   5. Someter la suspensión celular a tres ciclos de congelación-descongelación para alterar la membrana plasmática y generar un lisado celular tosco.
   6. Pipetear el lisado a fondo para homogeneizar, luego centrifugar a 1.000 × g durante 20 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares.
   7. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifuga a 18.000 × g durante 1 hora a 4 °C para pelletar la fracción de membrana.
   8. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet de membrana resultante en PBS. Esta suspensión representa la fracción de membrana burda de MSC y se utilizará para la encapsulación de AAV.
   9. Homogeneizar la suspensión de membrana pasándola secuencialmente por jeringuillas equipadas con agujas de 20 G a 27 G.
   10. Determina la concentración de proteínas de la suspensión de membrana homogeneizada mediante un ensayo BCA. Alicuota y almacena la suspensión a −80 °C, o procede directamente a los siguientes pasos. Rehomogeneizar la suspensión de membrana usando una jeringuilla de 27 G después de cada ciclo de descongelación.
3. Formación de CME-AAV mediante extrusión
   1. Mezclar la suspensión de membrana preparada con AAVs en una proporción definida de 150 μg de proteína de membrana por cada 1 ×¹⁰ copias genómicas (g.c.) de AAV. Incuba la mezcla a 37 °C durante 30 minutos con un suave agitado.
   2. Carga la mezcla membrana-AAV en un mini-extrusor equipado con una membrana de policarbonato (PC) de 400 nm. Pasa la muestra por el extrusor 20 veces para promover la encapsulación membrana-AAV.
   3. Sustituye la membrana PC de 400 nm por una de 200 nm y repite el proceso de extrusión 20 veces para reducir aún más la heterogeneidad del tamaño de la vesícula.
   4. Recoge la mezcla procesada. Si se requiere una mayor cantidad, agrupa varios lotes de extrusión. La suspensión resultante contiene CME-AAVs, junto con AAVs sin encapsular y vesículas de membrana vacías. Proceda inmediatamente a la purificación CME-AAV.

2. Purificación de CME-AAV mediante centrifugación por gradiente de densidad

NOTA: Este paso describe la separación de CME-AAV puro a partir de AAVs no encapsulados, agregados proteicos y ácidos nucleicos residuales mediante ultracentrifugación de gradiente de densidad basada en iodixanol. El CME-AAV purificado obtenido de este paso es adecuado tanto para estudios in vitro como in vivo . Se recomienda realizar todos los procedimientos bajo una capucha de cultivo de tejido estéril.

1. Preparación del gradiente de iodixanol
   1. Preparar soluciones de iodixanol al 40% y al 25% diluyendo la solución original con 10× PBS y agua desionizada estéril para lograr una concentración final en 1× PBS.
   2. En un tubo ultratransparente de pared fina abierta con 13,2 mL, establezca cuidadosamente un gradiente de densidad discontinuo subponiendo 1 mL de iodixanol al 40% y 3 mL de iodixanol al 25% desde la parte inferior.
   3. Superpone suavemente 7 mL de la suspensión que contiene CME-AAV obtenida del paso 1.14 sobre la parte superior de la pendiente. Equilibra los tubos y cárgalos en un rotor de ultracentrífuga con cubo oscilante.
2. Ultracentrifugación y recogida de fracciones CME-AAV
   1. Centrifugar el gradiente a 150.000 × g durante 3 horas a 4 °C usando aceleración rápida y desaceleración lenta (nivel 9 y nivel 1, respectivamente).
   2. Retira cuidadosamente los tubos del rotor sin alterar el gradiente. Recoge fracciones de 1 mL desde arriba hacia abajo del tubo en tubos microcentrífugas de 1,5 mL etiquetados (F1-F11). Mantén todas las fracciones en hielo.
   3. Identificar y agrupar las fracciones F7 y F8, que contienen los CME-AAV purificados, en un nuevo tubo ultracentrífuga abierto. Añade PBS a un volumen total de 11 mL y mezcla suavemente con una pipeta de 1 mL.
3. Lavado y recuperación de CME-AAV
   1. Centrifugar de nuevo las fracciones acumuladas a 150.000 × g durante 3 horas a 4 °C usando aceleración rápida y desaceleración rápida (nivel 9 para ambos ajustes).
   2. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el pellet CME-AAV en 50-200 μL de PBS estéril, dependiendo de la concentración deseada.
   3. Alícuota según sea necesario y almacenado a −80 °C hasta su uso adicional.

3. Caracterización de CME-AAV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utiliza para visualizar la morfología, tamaño y estructura de membrana de las partículas CME-AAV. El procedimiento sigue un protocolo estándar de tinción negativa similar al utilizado para las vesículas extracelulares. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente, salvo que se indique lo contrario.

1. Preparación y fijación de muestras
   1. Diluir la suspensión purificada de CME-AAV obtenida desde el paso 2 a una concentración de aproximadamente 1 ×^{10 9-1} × 10 partículas^{de 10} por mL en PBS.
   2. Fija la muestra añadiendo un volumen igual de paraformaldehído recién preparado al 4% (concentración final del 2%) e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   3. Coloca una rejilla de cobre recubierta de Formvar/carbono (malla 200) sobre una lámina de parafina, con el lado de carbono hacia arriba.
   4. Pipetear 10 μL de la suspensión fija CME-AAV sobre la rejilla y permitir la adsorción durante 30 minutos a temperatura ambiente. Evita secar durante la adsorción.
   5. Retira suavemente el exceso de líquido del borde de la rejilla usando papel filtro sin tocar el centro.
2. Lavado y post-fijación
   1. Haz flotar la rejilla, con el lado de la muestra hacia abajo, en una caída de 50 μL de PBS durante 2 minutos para lavarla. Repite dos veces.
   2. Transfiere la rejilla a una gota de 50 μL de glutaraldehído al 1% durante 5 minutos para estabilizar la estructura de la membrana.
   3. Lava secuencialmente la rejilla 5 veces con gotas de agua desionizada (30 s cada una) para eliminar las sales tampón. Seca suavemente después del lavado final.
3. Tinción negativa
   1. Coloque la rejilla sobre una gota de 50 μL de acetato de uranilo acuoso al 2% durante 1 minuto para lograr una tinción negativa.
   2. Elimina el exceso de tinte tocando suavemente el borde de la rejilla con papel de filtro y deja que se seque completamente al aire a temperatura ambiente.
4. Imagen
   1. Examina las rejillas teñidas usando un microscopio electrónico de transmisión operado a 200 kV.
   2. Capturar imágenes representativas con aumentos entre 30.000× y 120.000× para evaluar la morfología CME-AAV y la integridad de la membrana.
   3. Opcionalmente, mida los diámetros de las partículas utilizando un software de análisis de imágenes TEM para confirmar la consistencia del tamaño de la vesícula con los resultados de NTA.
      NOTA: Concentración de muestra - Ajustar la concentración de CME-AAV para obtener una densidad de partículas moderada; Muestras excesivamente concentradas provocan solapamiento de partículas, mientras que muestras excesivamente diluidas producen pocas vesículas detectables. Evitar artefactos: un lavado incompleto puede dejar cristales de sal que dificultan la visualización de partículas. Asegúrate de que las rejillas se mantengan hidratadas durante todo el teñido para evitar el colapso de la membrana. Coloraciones alternativas - El ácido fosfotongstico (PTA, 1%-2 %, pH 7,0) puede usarse como alternativa al acetato de uranilo si se aplican restricciones de manipulación radiactiva. Almacenamiento - Las rejillas preparadas pueden almacenarse en un recipiente libre de polvo a temperatura ambiente durante varios días antes de la imagen, aunque se recomienda la observación inmediata para lograr el mejor contraste.

4. Cuantificación de CME-AAV usando qPCR

NOTA: Este paso describe un método basado en qPCR para cuantificar copias genómicas CME-AAV (g.c./μL). El protocolo enfatiza la preparación de muestras específicas de CME-AAV y la presentación de datos. Todos los demás aspectos de la configuración y ciclado de la qPCR deben seguir la práctica estándar de laboratorio y las instrucciones del fabricante para el kit de qPCR seleccionado.

1. Preparación de muestra y estándar
   1. Descongelar alícuotas de CME-AAV purificado sobre hielo y mezclar suavemente pipeteando. Evita el vórtice.
   2. Preparar las diluciones estándar AAV de 1 × 10⁶ a 1 × 10³ g.c./μL mediante diluciones secuenciales de 10 veces usando agua desionizada libre de nucleasas o tampón TE. Preparar los estándares frescos o alicuotas y almacenarlos a −20 °C para uso a corto plazo.
   3. Prepare los siguientes controles: un control sin plantilla (NTC; agua), un control negativo (PBS o matriz en blanco) y un control positivo (muestra de AAV con concentración conocida), si está disponible.
   4. Prepara la mezcla maestra qPCR sobre hielo según las instrucciones del fabricante para la química elegida (a base de colorante o sonda).
2. Ciclo de qPCR y análisis de datos
   1. Ejecuta la qPCR usando los parámetros de ciclo recomendados por el fabricante de la mezcla maestra de qPCR.
   2. Genera una curva estándar representando C_t (eje y) frente a_{log 10} (concentración estándar en g.c./μL) (eje x). Ajusta una regresión lineal para obtener pendiente (m) y intersección y (b).
   3. Calcula la concentración del genoma CME-AAV para cada replicación de muestra usando la ecuación de regresión:
      o
      
      donde C son copias genómicas por μL.
   4. Réplicas técnicas medias e informes de concentración final de CME-AAV como g.c./μL.
      NOTA: Debido a que la desnaturalización térmica durante la preparación de la qPCR altera tanto la membrana envolvente como las cápsides AAV, no es necesaria una extracción separada de ADN. No realizar tratamiento con DNasa en muestras antes de la lisis térmica; La DNasa puede acceder y degradar los genomas de AAV una vez que los cápsides/membranas están alterados, pero antes de que la muestra alcance temperaturas que inactivan la DNasa. Los estándares deben coincidirse cuando sea posible: preparar una curva estándar a partir de un estándar AAV bien caracterizado. Si tus muestras o estándares difieren en la configuración del genoma (AAV monocatenario vs AAV auto-complementario/doble hebra), ajusta los valores reportados en consecuencia. Diseño de cebador/sonda: los cebadores pueden dirigirse a cualquier secuencia AAV conservada; por ejemplo, se utilizan comúnmente cebadores dirigidos al promotor CMV (aguas arriba del transgen).

5. Cuantificación de perfiles de partículas CME-AAV

1. Utiliza análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), detección de pulsos resistivos sintonizables (TRPS) o técnicas comparables de análisis de partículas para determinar la distribución de tamaño y concentración de partículas de las preparaciones CME-AAV.
2. Descongela muestras purificadas de CME-AAV sobre hielo y homogeneiza suavemente pipeteando antes del análisis. Realizar mediciones siguiendo la práctica estándar de laboratorio y las instrucciones del fabricante para el instrumento seleccionado, tal como se describe en los protocolos^{previamente publicados 12, 27, 28 y 29}.

6. Análisis in vitro de transferencia génica mediada por CME-AAV

NOTA: Este paso describe el procedimiento para evaluar la administración génica mediada por CME-AAV y la expresión de transgenes en células cultivadas. El ensayo se demuestra utilizando células HEK293T y CME-AAV9. EGFP, pero puede adaptarse a otros tipos celulares o constructos reporteros. AAV9 convencional (sin envoltura de membrana). El EGFP actúa como control positivo, mientras que las partículas AAV vacías o PBS se utilizan como controles negativos.

1. Preparación celular
   1. Cultivar HEK293T células bajo condiciones estándar (DMEM con 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina) a 37 °C y 5% CO₂.
   2. Convertir las células semilla en placas de 48 o 96 pozos para alcanzar aproximadamente el 70% de confluencia en el momento de la transducción (normalmente 24 horas después de la siembra). Ajusta la densidad de siembra según el tamaño del pozo (por ejemplo, ~5 × 10⁴ celdas/pozo para placas de 48 pozos o ~1 × 10⁴ celdas por pozo para placas de 96 pozos).
   3. Permite que las células se unan y se equilibren durante 24 horas antes de añadir vectores.
2. Aplicación vectorial
   1. Prepara CME-AAV9. EGFP y AAV9. Soluciones de trabajo EGFP en PBS estéril. Dosis viral típica: 5 × 10⁸ g.c. por 48 pozos (ajustar según la fuerza del promotor, el gen objetivo y los objetivos experimentales).
   2. Para cada pozo, añade copias genómicas iguales (g.c.) de CME-AAV9. EGFP o AAV9. EGFP directamente al medio de cultivo.
   3. Incluye pozos de control negativos con un volumen equivalente de PBS o partículas AAV vacías.
   4. Gira suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme y vuelve a la incubadora.
   5. Continúa la incubación durante 24-72 horas, dependiendo de la actividad del promotor y la cinética de expresión del transgénico. Para el EGFP impulsado por CMV en células HEK293T, normalmente se observa una fluorescencia fuerte en 48 horas.
3. Imagen y análisis de células vivas
   1. Cuando esté listo para la imagen, aspira suavemente el medio de cultivo y lava las células dos veces con PBS para eliminar las partículas no unidas. Evita desalojar las células.
   2. Tinte núcleos de células con Hoechst 33342 (compatible con células vivas) siguiendo las instrucciones del fabricante. No uses DAPI para células vivas.
   3. Realizar imágenes de fluorescencia de células vivas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con filtros apropiados (por ejemplo, excitación 488 nm/emisión 513 nm para EGFP; excitación 350 nm/emisión 460 nm para Hoechst).
   4. Utilizar objetivos del 10× o 20× para cuantificar la eficiencia de la transducción y del 63× objetivo para localización subcelular de alta resolución si es necesario.
   5. Adquiere al menos cinco campos de visión por pozo (por ejemplo, cuatro esquinas y un centro) usando parámetros de imagen idénticos (tiempo de exposición, ganancia, apertura, etc.).
   6. Guarda todas las imágenes en formatos raw y en escala de grises para análisis cuantitativo.
4. Análisis cuantitativo de imágenes
   1. Imágenes abiertas en ImageJ (FIJI) o software equivalente.
   2. Mide la intensidad media de fluorescencia tanto para los canales EGFP como Hoechst para cada campo.
   3. Determina la intensidad de fondo seleccionando una región sin señal fluorescente y promediando los valores de los píxeles.
   4. Calcula la intensidad corregida para cada canal:
      _Corregí =_{quiero decir} -_{I background}
   5. Calcular la intensidad normalizada para cada campo como:
      
   6. Normalizaron las intensidades medias de al menos cinco campos por pozo, y reportaron la media ± SD en tres réplicas biológicas independientes.
      NOTA: CME-AAV suele mostrar una intensidad de fluorescencia aumentada en comparación con el AAV convencional cuando se aplican copias genómicas iguales, reflejando una mejor captación celular y/o protección frente a anticuerpos neutralizantes. La eficiencia óptima de la transducción depende de la calidad de preparación de CME-AAV, el tipo celular, la fuerza del promotor y el título viral. Si se observan señales débiles, aumenta la entrada de copias genómicas, confirma la integridad del vector mediante qPCR y verifica la calibración del microscopio. Se pueden usar otros reporteros fluorescentes (por ejemplo, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) o constructos luciferasas dependiendo de las necesidades experimentales. Al trabajar con células primarias o no adherentes, ajusta las condiciones de siembra e imagen en consecuencia (por ejemplo, recubriendo placas con poli-L-lisina o usando portaobjetos de cámara).

7. Evaluación de la administración génica mediada por CME-AAV en un modelo murino

NOTA: Este paso describe la evaluación de la administración génica mediada por CME-AAV in vivo utilizando un modelo murino.

1. Preparación animal
   1. Usa ratones salvajes como el C57BL/6. Asegurarse de que todos los procedimientos animales sean aprobados por el comité institucional de cuidado y uso animal y se realicen conforme a las normativas pertinentes.
   2. Selecciona ratones de entre 4 y 6 semanas para lograr una consistencia óptima entre experimentos.
   3. Mantener a los animales bajo condiciones estándar de alojamiento con acceso improvisado a comida y agua antes de la inyección.
2. Preparación y administración de vectores
   1. Seleccione un serotipo de AAV según el propósito del estudio y el tejido objetivo. En este estudio se utilizan AAV9 y CME-AAV9.
   2. Preparar vectores virales que codifican un gen reportero de luciferasa (por ejemplo, CME-AAV9. luciferasa) para imágenes no invasivas.
   3. Diluir los vectores virales en solución salina estéril hasta una concentración final de 1 × copias genómicas de 10¹° (g.c.) por cada 50 μL para cada ratón.
   4. Calienta la cola suavemente usando una almohadilla térmica o agua tibia para dilatar la vena antes de la inyección.
   5. Carga 50 μL de suspensión viral en una jeringuilla de insulina 31-G e inyecta lentamente en la vena lateral para minimizar la fuga y la rotura de la vena.
   6. Después de la inyección, devuelven a los ratones a sus jaulas y vispóndalos hasta que se recuperen completamente.
3. Imagen bioluminiscencia in vivo
   1. Dos semanas después de la administración, anestesiar a los ratones con isoflurano (según los protocolos institucionalmente aprobados) e inyectar D-luciferina (150 μg/g de peso corporal; Sigma) intraperitonealmente en PBS.
   2. Colocar a los ratones anestesiados en un sistema de imagen por bioluminiscencia.
   3. Adquiere imágenes de luminiscencia cada 2 minutos tras la inyección hasta que la señal alcance un estancamiento.
   4. Cuantifica la bioluminiscencia usando el software adecuado. Define las regiones de interés (ROI) alrededor de las áreas luminiscentes y calcula el flujo total de fotones (fotones/s) para cada animal.
   5. Incluir grupos tratados con AAV9.luc e inyectados con PBS como controles positivos y negativos, respectivamente, para comparación.
4. Imagen ex vivo
   NOTA: Este paso es opcional.
   1. Inmediatamente después de la imagen in vivo , se sacrifica a los ratones y se recogen los órganos principales (hígado, corazón, bazo, riñón y cerebro).
   2. Obtener imágenes de los órganos aislados bajo parámetros de imagen idénticos usando el mismo sistema IVIS para determinar la expresión específica de luciferasa en el tejido.
      NOTA: Se pueden adoptar vías alternativas de administración (por ejemplo, inyección intramuscular, intracerebral o intraperitoneal) dependiendo de los objetivos experimentales. La intensidad de la bioluminiscencia refleja tanto la eficiencia de la administración génica como la biodistribución tisular. La expresión de luciferasa mediada por CME-AAV suele mostrar un inicio más temprano y un pico aumentado en comparación con el AAV libre debido a la endocitosis mediada por membrana por células que absorben la superficie. Asegura que la dosis, el tiempo y la configuración de imagen de luciferina sean consistentes entre las muestras para una comparación precisa. La dosis viral descrita (1 × 10¹° g.c. por ratón) suele proporcionar una señal detectable entre 2 y 4 semanas después de la inyección, aunque puede ser necesaria optimización para diferentes vectores o modelos animales.

Resultados

Las CMM utilizadas en este estudio se aislaron del tejido del cordón umbilical humano bajo protocolos de acuerdo con las directrices éticas pertinentes. Las fracciones de membrana de la CMS se prepararon según el protocolo descrito. AAV9. El EGFP se produjo internamente utilizando un sistema transitorio de transfección de doble plásmido en HEK293T células, como se informó^{previamente en 12,26}. Para fabricación de CME-AAV, preparac...

Discusión

Pasos críticos del protocolo CME-AAV

Este protocolo describe un método para generar AAVs envueltos en membrana MSC, y varios pasos son críticos para la formación exitosa de CME-AAV. En primer lugar, es esencial un preprocesamiento cuidadoso de la membrana celular. El objetivo de este paso es obtener fragmentos de membrana adecuados para la extrusión minimizando la contaminación por ADN nuclear, proteínas citosólicas y orgánulos subcelulares. A...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de imagen por bioluminiscencia	PerkinElmer	Sistema de imagen óptica IVIS Spectrum (Lumina III)
D-Luciferina, sal potásica	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Suero bovino fetal	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axio Observer 7
Rejilla de cobre recubierta de formvar/carbono de 200 mallas	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehído	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
Medio de Eagle modificado de Dulbecco de alta glucosa	Hyclone	SH30243
Centrífuga de alta velocidad	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
Instrumento NTA	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Tubo ultra-claro de pared delgada con tapa abierta para ultracentrífuga	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehído 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicilina-estreptomicina	Millipore-Sigma	V900929
Instrumento qPCR	Applied Biosystems	Sistema de PCR en tiempo real QS6
Rotor para centrífuga de alta velocidad	Beckman Coulter	JA-25.50
Rotor SW 41 Ti de balde oscilante para ultracentrífuga	Beckman Coulter	331362
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XE-100
Acetato de uranilo	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Filtros de membranas de policarbonato Whatman Nuclepore (200 nm)	Cytiva	10417004
Filtros de membranas de policarbonato Whatman Nuclepore (400 nm)	Cytiva	10417104