$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
No se requirió aprobación ética para este estudio, ya que no involucró participantes humanos ni muestras clínicas. Todos los procedimientos que involucraron líneas celulares se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones de bioseguridad institucional. La línea celular epitelial prostática utilizada en este estudio fue obtenida de un proveedor comercial certificado.
NOTA: Todos los reactivos, instrumentos y software utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales. El diagrama de flujo de este estudio se presenta en la Figura 1.
1. Cribado de ingredientes activos
- Accede a la base de datos TCMSP.
- Selecciona "Nombre de hierba" en el cuadro de búsqueda, introduce "Huangbo" y haz clic en "Buscar".
- Haz clic en el filtro "OB", pon "≥30" y aplica.
- Haz clic en el filtro "DL", pon "≥0.18" y aplica.
- Copia los resultados filtrados a una hoja de cálculo de Excel.
- Aplica el mismo método de cribado para obtener los ingredientes activos de "Cangzhu".
- Elimina los ingredientes activos duplicados importando todos los conjuntos de datos en Microsoft Excel (versión 2019) y fusionando las listas compuestas en formato Excel.
- Elimina los ingredientes activos duplicados estandarizando nombres compuestos e identificando entradas idénticas. Cuando múltiples registros correspondían al mismo compuesto, solo se conservaba una entrada representativa.
- Establecer asociaciones entre "Huangbo", "Cangzhu" y los ingredientes activos.
2. Obtener los objetivos correspondientes a los ingredientes activos
- Accede a la base de datos TCMSP.
- Selecciona "Nombre del químico" en el cuadro de búsqueda, introduce los ingredientes activos y haz clic en "Buscar".
- Copia el nombre del objetivo correspondiente a cada ingrediente activo.
- Elimina los nombres duplicados de los Target y establece asociaciones entre los ingredientes activos y los nombres de los Target.
- Accede a la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/)18, recupera los símbolos genéticos oficiales de cada nombre de Target y reemplácelos sistemáticamente.
3. Adquisición de objetivos de enfermedades
- Accede a la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org)19.
- Introduce "Prostatitis" en el campo de búsqueda y pulsa el icono de búsqueda para obtener la lista genética correspondiente.
- Ordena los genes en orden descendente según la puntuación de Relevancia.
- Exporta los genes relevantes en formato Excel.
- Se seleccionaron objetivos con una puntuación ≥1 como objetivos relacionados con la prostatitis.
4. Preparación para la construcción de una red reguladora de fármacos-principio activo-enfermedad-objetivo
- Obtén la intersección entre los objetivos relacionados con los principios activos y los objetivos relacionados con la prostatitis, y defínyelos como los objetivos de la EMP para tratar la prostatitis.
- Establece la asociación entre los principios activos y los objetivos terapéuticos del EMP para la prostatitis.
- Crea un archivo de Excel llamado "Red" con las tres primeras columnas llamadas "Node1", "Node2" y "Net".
- Pega las asociaciones entre el EMP y el fármaco en las columnas "Node1" y "Node2", mientras introduces "droga" en la columna "Net" para todas las filas.
- Pega las asociaciones de ingrediente activo medicamentoso en las columnas "Node1" y "Node2", mientras introduces "ingrediente" en la columna "Net" para todas las filas.
- Llena las columnas "Nodo1" y "Nodo2" con las asociaciones principio activo-objetivo para objetivos de EMP para tratar la prostatitis, con "objetivo" introducido en la columna "Net".
- Pega los objetivos terapéuticos de la EMP para la prostatitis en la columna "Nodo1", mientras que pones "prostatitis" en la columna "Nodo2" y "enfermedad" en la columna "Net" para todas las filas.
- Guarda el archivo de Excel "Red" como un archivo en formato txt.
- Crea un archivo de Excel llamado "Type" con las dos primeras columnas llamadas "Node" y "Type".
- Llena la columna "Nodo" con "EMP", con "fórmula" introducida en la columna "Tipo".
- Introduce "Huangbo" y "Cangzhu" en la columna "Nodo"; introduce "droga" en la columna "Tipo" para todas las filas.
- Introduce los ingredientes activos en la columna "Nodo ", mientras que "ingrediente" en la columna "Tipo" para todas las filas correspondientes.
- Llena la columna "Nodo" con los objetivos terapéuticos del EMP para la prostatitis, con "objetivo" introducido en la columna "Tipo".
- Introduce los objetivos relacionados con la prostatitis en la columna "Nodo", mientras que "enfermedad" aparece en la columna "Tipo" para todas las filas correspondientes.
- Guarda el archivo de Excel "Type" como un archivo de formato .txt.
5. Visualización de la red reguladora "Fármaco-Ingrediente Activo-Enfermedad-Objetivo" por Cytoscape
- Lanza Cytoscape.
- Ve a "Archivo > importar > red desde el sistema de archivos" y abre el archivo "network.txt".
- Abre el panel de "Estilo". Selecciona "Shape", elige "Type" en el desplegable "Column" y pon "Mapping Type" como "Discrete Mapping".
- Asignar formas de nodos distintas a las siguientes categorías: fórmula, fármaco, ingrediente, objetivo, enfermedad.
- Selecciona "Color de relleno", elige "Tipo" en el desplegable "Column" y establece "Mapping Type" como "Discrete Mapping".
- Asignar colores de nodos distintos a las siguientes categorías: fórmula, fármaco, ingrediente, objetivo, enfermedad.
- Selecciona "Altura" y "Ancho", elige "Tipo" en el desplegable "Column" y establece "Tipo de Mapeo" como "Mapeo discreto".
- Asigna tamaños de nodo distintos a las siguientes categorías: fórmula, fármaco, ingrediente, objetivo, enfermedad.
- Selecciona "Etiqueta tamaño de fuente", elige "Tipo" en el desplegable "Column" y configura "Mapping Type" como "Discrete Maping".
- Asignar tamaños de fuente de etiqueta distintos a las siguientes categorías: fórmula, medicamento, ingrediente, objetivo, enfermedad.
- Reposiciona manualmente los nodos para optimizar el diseño de la red.
- Ve a "Archivo > exportar > imagen de red a archivo" y guarda la red como imagen.
6. Análisis y visualización de redes PPI
- Accede a https://cn.string-db.org/ y ve al módulo "Múltiples Proteínas".
- Introduce la lista de genes objetivo en el cuadro de búsqueda, selecciona "Homo sapiens" como organismo y haz clic en "Buscar".
- Después de cargar los resultados, haz clic en "Continuar".
- Abre el panel de "Configuración", pon "puntuación mínima requerida de interacción" en "alta confianza (0.700)" y marca "ocultar nodos desconectados en la red".
- Haz clic en "Actualizar" y luego exporta los datos de asociación PPI en formato TSV a través del menú "Exportar".
- Abre Cytoscape, navega al menú de Archivos y selecciona "Importar red desde el sistema de archivos" para abrir tu archivo TSV.
- Navega al menú "Herramientas" y luego selecciona "NetworkAnalyzer > Análisis de Red > Interpretación de Red > Tratar la red como no dirigida".
- Navega al menú "Archivo", selecciona el sistema "Exportar tabla al archivo" y exporta los datos de red.
- Navega al panel "Estilo" y configura los atributos "Forma", "Color de relleno", "Altura" y "Ancho".
- Ajusta la disposición de la red PPI reposicionando los nodos.
- Navega al menú "Archivo", selecciona "Exportar imagen de red a archivo" y exporta la red visualizada como una imagen.
- Abre los datos de red PPI exportados con WPS y ordénalos en orden descendente por la columna "Grado".
- Selecciona los 20 objetivos principales ordenados, genera un gráfico de barras y guarda el gráfico como imagen.
7. Análisis de enriquecimiento de vías KEGG
- Abre un terminal o símbolo de comandos, escribe R y pulsa Enter.
- En la consola R, ejecuta los siguientes comandos uno por uno:
install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
- Convierte los símbolos génicos de los objetivos de EMP para tratar la prostatitis en identificadores Entrez usando org. Hs.eg.db.
- Lee los IDs de Entrez y realiza análisis de enriquecimiento KEGG usando el paquete clusterProfiler con parámetros: organismo = "tiene", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
- Tras eliminar las vías relacionadas con enfermedades humanas y el metabolismo de los resultados obtenidos del análisis de enriquecimiento KEGG, se clasifican las vías restantes según el recuento de genes enriquecidos.
- Establece la asociación entre las 15 vías de señalización mejor clasificadas y los objetivos.
- Prepara un archivo de dos columnas con asociaciones de "pathway" y "target", y luego impórtalo a Cytoscape mediante "File > Import > Network from File".
- Configura las formas y colores de los nodos para distinguir caminos de objetivos usando el panel "Estilo".
- Ajusta el diseño manualmente y exporta la red como una imagen.
8. Preparación farmacéutica
NOTA: La formulación EMP está compuesta por 15 g de corteza Phellodendri chinensis (Huangbo) y 15 g de Atractylodis Rhizoma (Cangzhu). Se empleó el método de extracción de agua y precipitación de alcohol para obtener el extracto en experimentos celularesposteriores 20.
- Sumerge el fármaco en una masa de agua de 10 veces durante 1 hora.
- Decocción durante 1 hora, luego filtra a través de gasas para obtener la decocción.
- Añade una masa de agua diez veces más al fármaco, descafetúalo durante 30 minutos y filtra a través de una gasa para obtener la decocción.
- Añade una masa diez veces más de agua al fármaco, decocción durante 30 minutos y filtra a través de una gasa para obtener la decocción.
- Combina las tres decocciones filtradas y luego filtra la mezcla con papel de filtro.
- Concentra la decocción a presión reducida hasta el 10% de su volumen original.
- Enfría el concentrado, añade lentamente etanol al 75% con la revuelta, seguido de sellar y almacenar a 4 °C durante 12 horas.
- Centrifuga la mezcla y recoge el sobrenadante.
- Continúa con la destilación a presión reducida.
- Finalmente, liofiliza el producto usando un liofilizador al vacío.
NOTA: El polvo liofilizado puede almacenarse a –20ºC durante hasta 3 meses, lo que sirve como punto de pausa seguro. Para reanudar, reconstituye el polvo en un disolvente adecuado según sea necesario.
9. Descongelación y cultivo celular
NOTA: Las células adquiridas se entregaron al laboratorio en hielo seco. Antes del inicio del experimento, se preparó previamente el Medio Libre de Sérum de Queratinocitos (K-SFM) suplementándolo con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (rEGF) hasta una concentración final de 5 ng/mL, extracto de la hipófisis bovina hasta una concentración final de 50 μg/mL, y 1% de penicilina-estreptomicina.
- Activa el baño maria y ajusta la temperatura a 37 °C.
- Retira las células del hielo seco y agitalas inmediatamente en el baño maria hasta que estén completamente descongeladas.
- Añade 5 mL de K-SFM a las celdas. Mezcla suavemente y luego centrifuga la mezcla (4 °C, 500 × g, 5 minutos).
- Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en K-SFM completo.
- Transfiere las células a un matraz de T-25 y colócalas en una incubadora de cultivos celulares.
NOTA: Los parámetros ambientales de la incubadora de cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C, 5% CO₂ y ≥ 95% de humedad relativa.
10. Subcultura celular
NOTA: La subcultura se realizó cuando las células alcanzaron una confluencia del 80–90%, con una proporción de subcultivo de 1:2 a 1:3.
- Aspirar el supernadante del medio de cultivo, seguido de dos lavados de células con PBS sin calcio ni magnesio.
- Introduce 2 mL de tripsina-EDTA y deja reposar las células durante 3 minutos para la disociación enzimática.
PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el uso de reactivos peligrosos, incluyendo lipopolisacáridos (LPS), cloroformo, etanol y reactivo TRIzol. Todos los procedimientos que impliquen productos químicos peligrosos deben realizarse en una campana extractora certificada para productos químicos mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular). Los materiales biológicos deben manipularse conforme a las directrices de bioseguridad institucional.
- Añadir un medio K-SFM suplementado con suero fetal bovino al 10% para terminar la digestión.
- Transfiere la mezcla de la celda a un tubo centrífuga de 15 mL, centrifugadora (4 °C, 500 × g, 5 min) y retire el sobrenadante.
- El perdigón celular fue resuspendido en K-SFM completo y posteriormente transferido a nuevos frascos de cultivo.
11. Determinación de la concentración máxima de tratamiento farmacológico mediante ensayo MTS
NOTA: Cada concentración de fármaco fue analizada con 5 réplicas técnicas.
- Digiera las células RWPE-1 en la fase de crecimiento logarítmico.
- Resuspende las células en un medio completo de K-SFM y luego determina la concentración celular contando.
- Ajusta la suspensión de celdas a una densidad de 1 × 105 celdas/mL con medio K-SFM completo.
- Dispensar la suspensión de la celda en una placa de 96 pozos con 100 μL por pozo.
- La placa de 96 pozos se colocó en una incubadora de cultivo celular para su cultivo.
- Tras 24 horas, una vez que las células se habían adherido completamente, el medio de cultivo se aspiraba y descartaba.
- Sustituye el medio por un medio completo de K-SFM que contenga diferentes concentraciones de solución EMP.
- Coloque la placa de nuevo en la incubadora de cultivo celular para otras 24 horas de incubación.
- Aspira el medio y luego enjuaga las células dos veces con PBS.
- Añadir 100 μL de medio K-SFM completo a cada pozo e incubar la placa en la incubadora de cultivos celulares durante otras 4 horas.
- Dispensar 10 μL de solución MTS en cada pozo y determinar el OD a 490 nm tras una incubación de 1 hora.
- Utilizando el grupo de control en blanco (células cultivadas en medio completo sin estimulación LPS ni tratamiento farmacológico) como línea base, se calculó la proliferación celular bajo cada concentración de tratamiento.
NOTA: La concentración más alta que no mostró un efecto significativo sobre la proliferación celular se definió como el tratamiento de dosis altas, seguida de su concentración a mitad como tratamiento de dosis medias y a un cuarto de concentración como tratamiento a dosis bajas.
12. Intervención celular
- Digiera las células RWPE-1 en la fase de crecimiento logarítmico.
- Las células se resuspendieron en un medio completo de K-SFM, y la concentración celular se determinó mediante el recuento celular.
- La suspensión de la celda se ajustó a una densidad de 5 × 105 celdas/mL utilizando un medio completo K-SFM.
- La suspensión de celdas se siembló en una placa de 6 pozos a 2 mL por pozo.
- La placa se colocó en una incubadora de cultivo e incubada durante 12 horas para permitir la adhesión celular.
- Las células se trataron con concentraciones bajas (150 μg/mL), medias (300 μg/mL) y dosis altas (600 μg/mL), respectivamente.
- Tras 1 hora, se añadió una solución de LPS de 10 μg/mL al medio de cultivo.
- Tras 24 horas de tratamiento, se recogió el sobrenadante para ELISA y las células se extrajeron para el análisis RT-PCR.
NOTA: Se seleccionó LPS para inducir una respuesta inflamatoria debido a su bien establecida capacidad para activar vías de señalización proinflamatorias en células epiteliales prostáticas; la concentración (10 μg/mL) se eligió basándose en estudios previos que demostraron una inducción robusta de citocinas.
13. Aislamiento del ARN total
NOTA: Para evitar la degradación del ARN, se usaron guantes y mascarillas durante todo el procedimiento experimental, y se emplearon puntas de pipeta libres de RNasa y tubos centrífuga.
- Tras la intervención, enjuaga las células dos veces con PBS.
- Añade 1 mL de reactivo Trizol a las células y mezclarlo repetidamente con una pipeta para asegurar la homogeneización.
PRECAUCIÓN: Realizar todos los procedimientos en una campana extractora química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.
- Transfiere el lisato a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y déjalo incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Posteriormente, añade 0,2 mL de cloroformo y vórtice la muestra con vigor.
- Después de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, centrifuga la muestra a 10.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
- Tras la centrifugación, transfiera cuidadosamente la fase acuosa superior incolora a un tubo nuevo de microcentrífuga.
- Introduce un volumen igual de isopropanol preenfriado, mezcla bien y luego incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Centrifuga la muestra una vez más (4 °C, 10.000 × g, 10 min), luego descarta la fase líquida y retiene el precipitado.
- Enjuaga el pellet con 1 mL de etanol preenfriado al 75% y vuelve a suspender suavemente pipeteando.
- Realizar una centrifugación final a 4 °C y 7.500 × g durante 10 minutos, luego retirar el sobrenadante y dejar que el pellet de ARN se seque al aire en un armario de bioseguridad.
- Disuelva el ARN purificado en 50 μL de agua tratada con DEPC.
- Determinar la concentración de ARN, la relación A260/A280 y la relación A260/A230 usando un espectrofotómetro NanoDrop para evaluar la pureza del ARN y asegurar una contaminación mínima por proteínas y disolventes antes de los análisis posteriores.
14. RT-PCR
- Utiliza 1 μg de ARN total para preparar un sistema de reacción de transcripción inversa de 20 μL.
- Incubar el sistema de reacción a 42 °C durante 15 minutos, seguido de 95 °C durante 5 minutos, y después enfriar hasta 4 °C.
- Diluye el ADNc resultante 10 veces más usando agua destilada.
- Prepara un sistema de reacción PCR de 20 μL usando el ADNc diluido.
- Programa el ciclador térmico y establece una retención inicial a 95 °C durante 60 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s.
- Realizar un análisis de curva de fusión y registrar los valores de TC para todos los genes objetivo y genes de referencia tras finalizar.
- Utiliza el método 2(-ΔΔCT) para determinar los niveles de expresión normalizados de los genes objetivo.
15. Ensayo ELISA
NOTA: Recupera el kit ELISA del almacén y déjalo equilibrarse a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo.
- Preparar la solución estándar según las instrucciones del fabricante y realizar las diluciones adecuadas para estándares, anticuerpos biotinilados, conjugados enzimáticos y tampón de lavado.
- Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular recogido (4 °C, 10.000 × g, 10 min) y recoger el sobrenadante.
- Transfiere 100 μL de las diluciones estándar y muestras de prueba a los pozos prerecubiertos.
- Sella los pozos con una tira adhesiva e incuba la placa a 37 °C durante 90 minutos.
- Descarta el líquido de los pozos y lava la placa usando una lavadora automática.
NOTA: Ajusta los parámetros de la lavadora automática a: 350 μL de tampón de lavado por pozo, tiempo de remojo de 15 segundos entre la dispensación y la aspiración, 5 ciclos completos.
- Dispensar 100 μL de solución activa de anticuerpos biotinilados en cada pozo. Dejar incubar a 37 °C durante 60 minutos.
- Descarta la solución y lava la placa como se describe en la 15.5.
- Pipetear 100 μL de enzima conjuga la solución de trabajo por pozo, luego incubar a 37 °C durante 60 minutos.
- Descarta la solución y lava la placa como se describe en la 15.5.
- A cada pozo, añade 100 μL de sustrato cromogénico. Mantén a 37 °C durante 15 minutos protegiéndote de la luz.
- Pipetea 100 μL de solución de parada por pozo y luego mezcla suavemente.
- Mide inmediatamente la densidad óptica (OD) a 450 nm.
- Establece una curva estándar graficando los valores medios de OD frente a las concentraciones estándar usando el software Curve Expert.
- Determina la concentración de cada muestra mediante interpolación desde la curva estándar usando su valor OD.
16. Análisis estadístico
- Operar el software SPSS (Versión 20.0).
- Importa el conjunto de datos en SPSS Statistics y define las variables adecuadamente. Utiliza Analizar > Estadística Descriptiva> Explorar para calcular la media y la desviación estándar (DS).
- Utiliza Analizar > Comparar Medias > ANOVA unidireccional para comparaciones de varios grupos.
- Obtén los valores p directamente de las tablas de salida de prueba e infórmalos en consecuencia.
- Presentar todos los resultados como media ± DE y considerar diferencias estadísticamente significativas cuando p < 0,05.