Análisis multiómico integrativo de Buti huatan tang en enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Resumen

El perfilado multiómico de Buti Huatan Tang (BTHTT) en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica revela su potencial para modular el eje metabólico de la hormona tiroidea IL-1R2/IL-1β. Este trabajo proporciona un marco para una validación mecanicista adicional de los componentes bioactivos de BTHTT, estableciendo una base para futuros estudios de intervención causal necesarios para confirmar este eje.

Resumen

Este estudio utilizó un marco multiómico y biológico computacional para investigar el potencial terapéutico de la fórmula de la Medicina Tradicional China (MTC) Buti Huatan Tang (BTHTT) frente a la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Se observaron mejoras fisiológicas significativas en un modelo de rata tras la intervención con BTHTT. El análisis histológico mostró una reversión del daño patológico pulmonar, mientras que los ensayos bioquímicos y la transcriptómica confirmaron la normalización de los niveles de IL-1β e IL-1R2 . Además, el perfil metabólico reveló que el BTHTT corrigió las alteraciones en los niveles de hormonas tiroideas T3 y T4. Se observó una correlación negativa entre el eje IL-1β/IL-1R2 y estas hormonas tiroideas, lo que indica que su regulación está asociada al efecto terapéutico de la fórmula. Más allá de mediciones directas, los algoritmos de aprendizaje automático identificaron diez genes signature de la EPOC a partir de bases de datos clínicas. El análisis de enriquecimiento de vías sugiere que la BTHTT podría actuar a través de interacciones citocina-citocina-receptor y vías de síntesis de hormonas tiroideas. Además, aunque se identificaron 283 componentes in vivo, compuestos como la tanshinona IIA y la criptostinona, actualmente se consideran sustancias activas candidatas. Su papel como motores principales se apoya en un modelo en el que se acoplan de forma estable a IL-1R2; esta inferencia se basa en simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular (MD) en lugar de aislamiento experimental directo. En conjunto, los datos apoyan un modelo en el que el BTHTT ejerce un efecto multi-objetivo sobre la EPOC al modular la inflamación y la homeostasis metabólica. Este enfoque integrado proporciona una base científica refinada para la aplicación clínica de BTHTT y destaca vías específicas para futuras validaciones experimentales.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), una de las enfermedades respiratorias más comunes en la práctica clínica, se ha convertido en la tercera causa principal de muerte a nivel mundial debido a su tasa extremadamente alta de discapacidad y exacerbaciones agudas^recurrentes. La EPOC fue un factor significativo que condujo a la pérdida de capacidad laboral en la población y a un fuerte aumento en los costes de atención familiar, con pérdidas sociales y económicas muy superiores a las de la mayoría de las enfermedades^{crónicas 2}. En la "Iniciativa China Saludable 2030", la EPOC ha sido catalogada como una enfermedad clave para la prevención y el tratamiento. Debido a una comprensión incompleta de los mecanismos subyacentes a la EPOC, el uso combinado de broncodilatadores y corticosteroides siguió siendo el tratamiento principal. Aunque este enfoque proporcionó un alivio relativamente evidente de los síntomas, no puede evitar el deterioro progresivo de la función pulmonar. Además, el uso prolongado de corticosteroides inevitablemente aumenta la incidencia de reacciones adversas, afectando aún más la eficacia a largo plazo de los fármacos y la tolerancia de^{los pacientes 3}. Los estudios han demostrado que, incluso con la triple terapia, entre el 28% y el 31% de los pacientes siguen experimentando exacerbaciones agudas o empeoramiento de los síntomas. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos eficaces para la EPOC sigue siendo un tema clave y principal en la investigación actual sobre^{la EPOC 4}.

Para responder a estas necesidades, se han desarrollado fórmulas clásicas de MTC como Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin y Bu Fei Tang. Entre ellas, el BTHTT fue especialmente notable por sus efectos significativos en la tonificación pulmonar, el aumento de la energía y la resolución de flema para aliviar la tos 5,6,7,8. La BTHTT se utilizó ampliamente en el tratamiento clínico de la EPOC, no solo por su notable eficacia y efectos secundarios mínimos, sino también por su potencial para revertir el declive progresivo de la función pulmonar. Tenía un gran potencial en contextos clínicos y sociales y tenía potencial para un "desarrollo secundario" como medicamento principal, con un valor científico y económico significativo ^9,10,11,12. Sin embargo, debido a la falta de investigación científica sistemática y a largo plazo, los estudios sobre BTHTT han sufrido generalmente de una comprensión poco clara de su base componente y de objetivos centrales de acción no identificados. Fundamentalmente, esto se debió a deficiencias significativas en la investigación sobre el mecanismo principal y la posible base terapéutica de la BTHTT.

En respuesta a esta característica, integrar múltiples tecnologías ómicas como la metabolómica y la transcriptómica, así como métodos de minería multialgoritmo, centrándose en las principales correlaciones entre genes clave característicos y vías metabólicas clave en el microentorno del^{cuerpo, no solo} puede explorar la esencia del tratamiento, sino también evaluar la eficacia sinérgica de los componentes activos. Se pone especial atención en el eje hormonal tiroideo, ya que investigaciones emergentes indican que la disfunción tiroidea es una comorbilidad frecuente en la EPOC, que a menudo se correlaciona con un aumento de la inflamación sistémica y una función respiratoria deteriorada. Modular este eje puede representar una nueva vía para restaurar la homeostasis metabólica en la enfermedad pulmonar ^16,17.

En resumen, este estudio adoptó un enfoque de tres frentes que combina integración multiómica con biología computacional, basado en la premisa de la correspondencia entre síndrome y fórmula. Por un lado, utilizó técnicas farmacoquímicas séricas de la MTC para identificar los componentes sanguíneos del BTHTT en condiciones efectivas. Por otro lado, centrándose en genes característicos clave de la EPOC, utilizó una metabolómica tisular completa para descubrir biomarcadores de enfermedades a partir de pequeñas moléculas endógenas y construir una evaluación precisa de los efectos generales de la fórmula. Mientras tanto, combinado con minería multialgoritmo y análisis de identificación transcriptómica, identificó los genes característicos clave regulados por BTHTT bajo condiciones efectivas y realizó un análisis de correlación entre los genes característicos clave y las vías metabólicas clave. La base potencial de la sustancia terapéutica fue evaluada mediante acoplamiento molecular y análisis de dinámica molecular.

Basándose en nuestro marco multiómico y el perfil farmacológico de BTHTT, este estudio propone las siguientes predicciones comprobables. Modulación antiinflamatoria: La intervención con BTHTT reducirá significativamente los marcadores inflamatorios sistémicos y pulmonares, concretamente normalizando el eje de expresión IL-1β/IL-1R2 para mitigar el daño tisular. Restauración metabólica: La BTHTT alterará las señales en la vía de síntesis de hormonas tiroideas, lo que conduce a una corrección medible de los niveles de T3/T4 y a una mejora posterior en el estado metabólico del microambiente pulmonar. Restauración metabólica: La BTHTT alterará las señales en la vía de síntesis de hormonas tiroideas, lo que conduce a una corrección medible de los niveles de T3/T4 y a una mejora posterior en el estado metabólico del microambiente pulmonar.

Protocolo

NOTA: Los reactivos y el equipo utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

Adquisición y preprocesamiento de datos clínicos

Para investigar las firmas moleculares de la EPOC, se extrajeron conjuntos de datos transcriptómicos de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). Se seleccionaron un total de cinco conjuntos de datos: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 y GSE222965. Los datos en bruto y los archivos de anotación de la plataforma se descargaron para el mapeo de sonda a gen. Cuando múltiples sondas atacaban un solo gen, se mantenía el valor máximo de expresión. Las matrices de expresión génica resultantes (filas como genes, columnas como muestras) se fusionaron en un único conjunto de datos de descubrimiento. Para tener en cuenta las variaciones técnicas entre diferentes plataformas de microarrays y cohortes de estudio, se realizó corrección por lotes utilizando el algoritmo ComBat del paquete sva R. La eficacia de la corrección se validó mediante gráficos de Análisis de Componentes Principales (PCA). Tras la corrección por lotes, se utilizó el conjunto de datos de descubrimiento fusionado para el análisis diferencial. Se identificaron genes diferencialmente expresados (DEGs) entre pacientes con EPOC y controles sanos utilizando el paquete limma. Los umbrales de significancia se establecieron en |logFC| ≥ 1 y p ≤ 0,05.

Para identificar los genes característicos más robustos, se integraron tres algoritmos independientes de aprendizaje automático. Para garantizar la fiabilidad de los modelos y evitar fugas de datos, el proceso de selección de características se encajaba dentro de los bucles de validación cruzada cuando era aplicable, y el conjunto de datos de descubrimiento se separaba estrictamente de los conjuntos de validación independientes. El modelo LASSO se aplicó a los DEG usando el paquete glmnet. Empleamos una validación cruzada de 10 veces para determinar el parámetro de penalización óptimo. Se seleccionó el valor óptimo del parámetro de penalización correspondiente al error mínimo de validación cruzada como umbral para identificar los genes de características principales. La SVM se utilizó para clasificar genes según su poder discriminatorio. Se implementó una estrategia de validación cruzada de 10 veces para identificar el punto de error mínimo de generalización, determinando así el número óptimo de genes característicos. El paquete randomForest se utilizó para clasificar los DEGs según su Precisión Promedio Disminutiva y su índice de Gini. Los genes con las puntuaciones de mayor importancia fueron seleccionados como características relacionadas con la enfermedad.

La intersección de las características identificadas por LASSO, SVM y randomForest se tomó para definir los genes característicos centrales finales. El rendimiento diagnóstico de estos genes se evaluó mediante análisis de curvas de Características Operadoras del Receptor (ROC). El Área Bajo la Curva (AUC) y los Intervalos de Confianza (IC) del 95% asociados se calcularon utilizando el paquete pROC. Se consideraba que un gen tenía un valor diagnóstico alto si la AUC > 0,70. Finalmente, los niveles de expresión y la precisión diagnóstica de estos genes se validaron aún más en un conjunto de validación independiente para asegurar la generalización de los hallazgos.

Utilizando PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) y drugbank (https://go.drugbank.com/), se obtuvieron un total de 12 perfiles específicos de fármacos, como LABAs, LAMAs, SABAs, SAMAs, Fluticasone propionate, Budesonida, Beclometasona, Fluticasona, Salmeterol, Umeclidinium, Vilanterol y Teofilina. Los objetivos compilados se calibraron utilizando la base de datos Uniprot (https://www.uniprot.org/), durante la cual se eliminaron genes no humanos y se eliminaron objetivos duplicados inválidos para obtener nombres estandarizados de los gens. Al introducir las palabras clave "enfermedad pulmonar obstructiva crónica", "EPOC" en las bases de datos GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) y DisGENET (https://www.disgenet.org/), se obtuvieron objetivos relacionados con enfermedades. Todos los objetivos de las tres bases de datos se consolidaron en un archivo Excel, se eliminaron genes duplicados y los datos se calibraron usando la base de datos Uniprot para obtener la información final del gen objetivo de la enfermedad.

Desarrollo de modelos de aprendizaje automático

Se construyó un marco de aprendizaje automático multialgorítmico utilizando secuencialmente los paquetes R glmnet, e1071 y randomForest. Específicamente, se realizó regresión LASSO para la reducción de dimensionalidad basada en penalizaciones, se empleó análisis con Máquina de Vectores de Soporte (SVM) para evaluar errores de validación basados en agrupaciones muestrales, y Random Forest para filtrar características según puntuaciones de importancia. Este proceso produjo visualizaciones diagnósticas correspondientes, incluyendo curvas de validación cruzada y gráficos de burbujas de importancia génica. Tras la construcción del modelo, se realizó un análisis del diagrama de Venn sobre los conjuntos génicos identificados por estos múltiples algoritmos para extraer los genes de características de "intersección" superpuestos, mejorando así la fiabilidad de los posibles biomarcadores. La matriz de expresión de estos genes de intersección se extrajo para visualizar las diferencias de expresión entre grupos mediante gráficos de violín. Finalmente, se generaron curvas ROC mediante bucles iterativos para cada gen para calcular el Área Bajo la Curva (AUC), validando su valor diagnóstico como biomarcadores candidatos.

Inducción de modelos animales

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Guizhou (2303411) y seguía las directrices de ARRIVE y las normativas de bienestar animal. Un total de 72 ratas machos Sprague-Dawley (SD) de grado SPF (230 ± 20 g). Tras 1 semana de alojamiento adaptativo bajo condiciones estándar (25 ± 1 °C, 50 ± 5% de humedad, 12 horas de ciclo claro-oscuro), las ratas se dividieron aleatoriamente en el grupo Control (grupo C) (n = 24) y el grupo Modelo (grupo M) (n = 48).

El grupo M fue sometido a modelado de doble factor: exposición intermitente al humo de cigarrillos (9 semanas, 6 días por semana, 3 cigarrillos de grado de investigación al día divididos en 2 sesiones, 30 minutos por sesión) e instillación intratraqueal de LPS (200 μg por instillación, una vez cada dos semanas^)18,19. El grupo C recibió un volumen equivalente de solución fisiológica normal. Tras un modelado exitoso, los grupos se dividieron aleatoriamente en el grupo M (n = 12), el grupo BTHTT de dosis altas (grupo H) (dosis alta, 1× dosis clínica, n = 12) y el grupo BTHTT de dosis baja (grupo L) (dosis baja, 1/2× dosis clínica, n = 12), con intervención gavage continua durante 2 semanas. A los grupos C y M se les administró agua destilada de forma sincrónica.

El peso corporal y los parámetros de actividad espontánea se registraron semanalmente. Al finalizar la modelización y el tratamiento, se recogieron tejido pulmonar, suero, suero y líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Los niveles de marcadores inflamatorios (es decir, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN y MCP-1) se midieron usando ELISA según las instrucciones del kit. También se realizaron análisis de patología tisular y multiómica.

Administración del tratamiento

Buti Huatan Tang (BTHTT) consta de nueve hierbas medicinales tradicionales chinas: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix de Astragali, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 g), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Semen de Raphani, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g), y Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Los materiales herbales se remojaron en agua a 10 veces su peso combinado durante 30 minutos y posteriormente se decoctaron durante 1 hora. La decocción se filtraba, y el filtrado se recogía y se dividía en tres porciones iguales para su administración oral.

Según la seguridad clínica y eficacia, la dosis estándar de BTHTT en adultos fue de 1,57 g∙^kg-1∙^day-1 según las directrices clínicas de medicación. Considerando el factor de conversión de dosis en ratas, que indicaba que la dosis estándar de fármaco en ratas era 6,3× la dosis estándar humana, el grupo H correspondiente para ratas se estableció en 9,9 g∙kg-1∙day-1, y el grupo L en la mitad de esta dosis (4,95 g∙^kg-1∙^day-1). Dado que el volumen concentrado final de BTHTT fue de 50 mL, el volumen administrado para el grupo H en ratas fue aproximadamente 1,6 mL, y para el grupo L, aproximadamente 0,8 mL. El medicamento se administraba una vez al día mediante gavage oral.

Colección de tejido y BALF

En los extremos experimentales (semana 9 y semana 11), las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 5% (1 mL/100 g). Se recogía sangre de la vena porta, se dejaba reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugaba a 13.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se almacenaba a -80 °C. Los tejidos pulmonares se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. El BALF se recogió mediante tres lavados consecutivos con PBS en frío.

Análisis transcriptómico

El ARN total se extrajo del tejido pulmonar y se controló de calidad usando (A₂₆₀/_{A 280} > 1,8) (RIN ≥ 7,0). Se construyeron bibliotecas de secuenciación de ARN: el ARNm se enriquecía con oligo(dT), se fragmentaba y se utilizaba para sintetizar ADNc de doble cadena, que luego se ligaba a oligonucleótidos adaptadores y se amplificaba mediante PCR. Las bibliotecas se cuantificaban y comprobaban la calidad antes de la secuenciación. Incluyendo la inspección de distribución de contenido, el análisis de distribución de densidad FPKM de cada muestra y el análisis de evaluación general de la calidad de^{ARN-seq 20}.

Los datos de transcriptómica en bruto generados por la plataforma de secuenciación se procesaron usando scripts Perl para eliminar secuencias adaptadoras y lecturas de baja calidad (lecturas con Q ≤ 25 bases que representan > tasa de 60% o N > 5%). Se obtuvieron lecturas limpias tras este proceso de filtrado. Las lecturas limpias se alinearon con el genoma de referencia usando HISAT2, y se cuantificaron los niveles de expresión génica para calcular los valores FPKM. Se realizó un análisis diferencial de expresión (con criterios de cribado de |log2FC| > 1 y p-adj < 0,05). La anotación de factores de transcripción se basó en bases de datos Animal TFDB o Pfam/DBD, coincidiendo con identificadores génicos e información de dominios^{proteicos 21}.

Se empleó una estrategia de mapeo génico ortológico para garantizar el rigor metodológico de la validación entre especies. Esta estrategia consistía en obtener ortólogos en ratas para obtener genes humanos centrales (por ejemplo, SRPX2, IL-1R2, TFF3) utilizando las bases de datos NCBI HomoloGene y Ensembl BioMart. La selección se restringió a pares de genes que mostraran una clara relación de mapeo "uno a uno" y una alta identidad de secuencias proteicas. En los casos en que había varios candidatos presentes, se preferenciaba pares ortologos certificados por el HGNC. Para garantizar una alta precisión en la detección, se diseñaron cebadores RT-qPCR específicos basados en las secuencias de ARNm de los ortólogos de rata identificados. Los criterios de validación se definieron por la consistencia en la dirección de la expresión y la verificación funcional. Consistencia en la dirección de expresión: En un modelo de EPOC en ratas inducido por humo, la RT-qPCR mostró que las tendencias de expresión de genes objetivo en el tejido pulmonar de rata eran totalmente consistentes con las observadas en conjuntos de datos clínicos de GEO en humanos. Se consideraba que los genes que mostraban la misma polaridad de cambio entre especies poseían conservación que los biomarcadores de enfermedades. Verificación patológica: Tras la consistencia de la expresión, se realizó un análisis de correlación para verificar la implicación de estos genes en la evolución patológica de la EPOC.

Flujo de trabajo de metabolómica

El tejido pulmonar (20–50 mg) se homogeneizó en metanol-acetonitrilo-agua preenfriada (2:2:1, v/v) y se sonicó en un baño de hielo. El homogenado fue centrifugado 13.000 × g durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante se concentró en vacío, se volvió a disolver en acetonitrilo-agua (1:1, v/v) y se filtró a través de una membrana de 0,22 μm para el análisis^{LC-MS 22}.

La separación cromatográfica se logró mediante una columna UPLC basada en amida (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). La temperatura de la columna se mantuvo en 25 °C. La fase móvil consistía en (A) agua que contenía 25 mM de acetato de amonio y 25 mM de amoníaco, y (B) acetonitrilo. El caudal se estableció en 0,5 mL/min y el volumen de inyección fue de 2 μL. El programa de elución del gradiente fue el siguiente: 0–0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, disminución lineal de B del 95% al 65%; 7–8 minutos, disminución lineal de B del 65% al 40%; 8–9 min, B se mantuvo en el 40%; 9–9,1 min, aumento lineal de B del 40% al 95%; 9,1–12 min, B se mantuvo en un 95%. Durante todo el análisis, las muestras se mantuvieron a 4 °C en el automuestreador. Para garantizar la estabilidad del sistema y la fiabilidad de los datos experimentales, las muestras se analizaron en una secuencia aleatoria, con muestras de control de calidad (QC) intercaladas en la cola. El análisis por espectrometría de masas se realizó utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) acoplado a un espectrómetro de masas. Las muestras se ionizaron mediante ionización por electrospray (ESI) tanto en modos de iones positivos como negativos. Los ajustes de fuente ESI y MS eran los siguientes: gas nebulizador (Gas 1) a 50, gas auxiliar (Gas 2) a 2, temperatura de fuente iónica a 350 °C y voltaje de pulverización (ISVF) a 3.500 V en modo iónico positivo y 2.800 V en modo iónico negativo. El rango de masa para MS1 se estableció de 70 a 1.200 Da, con una resolución de 60.000 y un tiempo de acumulación de escaneo de 100 ms. Para MS2, se utilizó adquisición dependiente de datos (DDA) con energía de colisión escalonada. El rango de masa para MS2 también se estableció de 70 a 1.200 Da, con una resolución de 60.000 y un tiempo de acumulación de barrido de 100 ms. El tiempo de exclusión dinámica se estableció en 4 s.

Los datos brutos de metabolómica se convertían al formato mzXML y luego se procesaban para la alineación de picos, corrección del tiempo de retención y extracción del área de pico. El flujo de preprocesamiento de datos incluía los siguientes pasos: Primero, se eliminaron los picos iónicos con una tasa faltante > el 50%. En segundo lugar, los valores restantes que faltaban se imputaban usando el algoritmo KNN. En tercer lugar, se descartaron características metabólicas con desviación estándar relativa (RSD) >50%. La calidad de los datos experimentales se evaluó mediante análisis de componentes principales (PCA) y agrupamiento de muestras de control de calidad. Los análisis posteriores incluyeron estadísticas univariantes (por ejemplo, pruebas t), estadísticas multivariantes (PLS-DA), cribado diferencial de metabolitos (VIP > 1 y p < 0,05) y análisis de enriquecimiento de vías KEGG (prueba hipergeométrica)^23,24.

Establecimiento de métodos analíticos para componentes in vivo e in vitro

Preparación de muestras de BTHTT para pruebas in vitro : BTHTT se extrajo por decocción en agua (2 x 30 min), se concentró a 1,1–1,2 g/mL y luego se liofilizó. Antes del análisis, se mezclaron 600 μL de la solución en polvo liofilizada con 400 μL de metanol, se volvieron a disolver en un 40% de metanol y se centrifugaron para recoger el sobrenadante.

Preparación de muestras de BTHTT para pruebas in vivo : El suero se desproteinizó mezclando con metanol (1:1) y precipitando a −20 °C durante 30 minutos, seguido de centrifugación en 20 minutos. El sobrenadante se secó al vacío y se volvió a disolver en metanol al 40% para obtener la muestra final. Para la preparación de suero en blanco + muestras de BTHTT, se añadió una cantidad adecuada de suero en blanco con el sobrenadante in vitro BTHTT, y los pasos restantes se realizaron según lo descrito.

Las muestras se separaban mediante un sistema UHPLC equipado con una columna UPLC de fase inversa (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). La temperatura de la columna se mantuvo en 35 °C y el caudal se fijó en 0,3 mL/min. La fase móvil consistía en (A) 0,1% de ácido fórmico en agua y (B) 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo. La elución por gradiente se realizó como se muestra en la Tabla 1.

Se utilizó un espectrómetro de masas para la adquisición tanto de los espectros MS1 como MS2. El espectrómetro de masas estaba acoplado al sistema UHPLC y funcionaba en modos ESI positivo y negativo. Los parámetros ESI eran los siguientes: voltaje de pulverización 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), presión de gas en la vaina 45 arb, presión de gas auxiliar 20 arb, temperatura del tubo de transferencia iónica 320 °C y temperatura del vaporizador 350 °C. El modo de detección estaba configurado en MS2 de escaneo completo/dependiente de datos (Full-MS/dd-MS2) con resoluciones de 60.000 para MS1 y 15.000 para MS2. Los 10 iones MS1 principales fueron seleccionados para la fragmentación MS/MS con energías de colisión normalizadas escalonadas de 20, 40 y 60. El rango de masa para MS1 se estableció de 90 a 1.300 Da.

Para el análisis in vivo , incluyendo muestras en blanco, muestras en grupo dosificado y muestras en blanco + BTHTT, se inyectaron con precisión 6 μL de cada muestra. Para el análisis in vitro de BTHTT, se inyectaron 2 μL de la muestra. Cada lote de muestras en blanco y en grupo dosificado se inyectó una vez, mientras que las muestras en blanco + BTHTT se inyectaron en triplicado y las muestras de BTHTT en quintuplicado.

Los datos en formato mzXML se procesaron e identificaron compuestos basándose en una base de datos local de espectrometría de masas TCM comercial de alta resolución. Los criterios de identificación se establecieron de la siguiente manera: un error masivo de <25 ppm para MS1 y una puntuación de coincidencia > 0,7 para MS2 (donde la puntuación reflejaba la similitud de iones fragmentos, siendo ≥0,7 un umbral fiable)^25,26. El análisis estadístico incluyó el recuento y clasificación de compuestos (por ejemplo, flavonoides, alcaloides), que se realizó junto con anotaciones de la base de datos de espectrometría^{de masas 27}.

Acoplamiento molecular y simulación MD

Para investigar los modos potenciales de unión entre las proteínas características identificadas y sus ligandos correspondientes, se realizó acoplamiento molecular in silico . Las estructuras tridimensionales de las pequeñas moléculas se recuperaron de la base de datos PubChem y optimizaron sus configuraciones geométricas. Las estructuras cristalinas de las proteínas objetivo se obtuvieron del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del RCSB. Utilizando PyMOL, se eliminaron moléculas de agua y heteroátomos, y se extrajeron ligandos cocristalizados para definir las coordenadas del sitio activo. Se añadieron átomos de hidrógeno y se asignaron cargas de Gasteiger mediante software. Se ejecutaron simulaciones de acoplamiento, generando 15 conformaciones independientes por ejecución. Se seleccionó la conformación con la energía de enlace más baja para un análisis posterior. Para caracterizar rigurosamente las interacciones no covalentes, se analizaron los complejos receptor-ligando utilizando el Profiler de Interacciones Proteína-Ligando (PLIP). NOTA: Es importante enfatizar que estos resultados de acoplamiento proporcionan soporte estructural para posibles interacciones moleculares y sirven como base para un refinamiento dinámico adicional; sin embargo, no constituyen evidencia independiente de eficacia biológica.

Para evaluar la estabilidad y evolución conformacional de los complejos proteína-ligando previstos bajo condiciones fisiológicamente relevantes, se realizaron simulaciones de dinámica molecular utilizando el paquete de software GROMACS. Se generaron archivos topológicos tanto para las proteínas como para los ligandos basándose en el campo de fuerzas GROMOS96 43a1. Cada complejo se posicionó en el centro de una caja dodecaédrica, manteniendo una distancia mínima de 1,0 nm de los bordes de la caja, y se solvió usando el modelo de agua SPC. Para garantizar la neutralidad eléctrica, se añadieron iones de sodio o cloruro al sistema según fuera necesario. La minimización de energía se realizó utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado hasta que la fuerza máxima fue inferior a 1.000,0 kJ^∙mol-1∙^nm-1. El sistema se equilibró entonces en dos etapas: primero, se empleó un conjunto NVT para calentar el sistema a 300 K sobre 100 ps usando un termostato de reescala en V; en segundo lugar, se utilizó un conjunto NPT para estabilizar la presión a 1 bar sobre 100 ps mediante un barostato de Parrinello-Rahman. Las simulaciones de producción se realizaron con una duración total de 10 ns con un intervalo de tiempo de 2 fs. Las interacciones electrostáticas a largo alcance se calcularon usando el método de Ewald de Malla de Partículas (PME), mientras que las interacciones de van der Waals a corto alcance y electrostáticas se gestionaron con un radio de corte de 1,2 nm. Para garantizar la fiabilidad de las simulaciones, se realizaron tres ejecuciones independientes cuando fue posible. La estabilidad de los complejos se evaluó cuantitativamente calculando la desviación cuadrática media (RMSD) y la fluctuación cuadrática media (RMSF) de los átomos de la columna vertebral proteica en relación con la estructura inicial. La obtención de una meseta en el perfil RMSD se utilizó como criterio principal para el equilibrio del sistema y la estabilidad estructural.

Análisis estadístico general

En este experimento, los cálculos en grupo se realizaron utilizando pruebas t o análisis unidireccional de la varianza (ANOVA).

Resultados

Predicción de genes característicos clave en la EPOC

Tras la corrección por efecto lote de datos clínicos de múltiples plataformas de microarray (Archivo Suplementario 1–Figura Suplementaria S1), se realizó un análisis de expresión diferencial. Se identificaron 34 genes candidatos (32 con regulación al alza y 2 con regulación a la baja), incluyendo SRPX2, CLDN10 y TFF3 (F...

Discusión

La síntesis y el mantenimiento de los niveles de hormona tiroidea son significativos para los pacientes con EPOC y van mucho más allá de la mera función endocrina, influyendo profundamente en la progresión de la enfermedad, el estado nutricional, la función pulmonar y el pronóstico^general 31,32,33. Especialmente durante exacerbaciones agudas, los pacientes con EPOC a menudo presentaban un estado...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetonitrilo (grado cromatográfico)	Merck, Alemania	1499230-935
Bioanalizador Agilent 4150	Agilent Technologies, EE. UU.
Acetato de amonio	SIGMA, Alemania	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix Astragali),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240601
ChemOffice		Software de dibujo de estructuras químicas y modelado molecular
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240901
Centrífuga Eppendorf 5430 R	Eppendorf, Alemania
Cigarrillos experimentales	Harbin Taihua, China	20230208
GraphPad Prism 8		Software de análisis estadístico y gráficos
Cigarrillos Huangshan		Experimentos de cigarrillos de grado de investigación para exposición al humo
IL-1 y beta; Kit ELISA	Biotecnología Ligada a Enzimas de Shanghái, China	E-EL-R0012c-20230522
Plataforma de secuenciación Illumina Novaseq 6000	Illumina, EE. UU.
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240201
Lepidium sativum L. (Semen Raphani)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Lipopolisacáridos (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, China	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Metanol (grado cromatográfico)	Fisher, EE. UU.	DK745764
Espectrofotómetro Nanodrop ND-2000	Thermo Scientific, EE. UU.
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20250201
Fluorómetro Qubit 4.0	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.
Kit de construcción de biblioteca de ARN	ABclonal, EE. UU.	RK20301-20230415
SMINA		Software de acoplamiento molecular
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae miltiorrhizae radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240902
Registrador de actividad espontánea de animales pequeños (KW-ZF)	Biotecnología Karlvin de Nankín, China
Pentobarbital sódico	Compañía de Adquisición de Reactivos Experimentales de Shanghái, China	20230412
TNF-& alfa; Kit ELISA	Biotecnología Ligada a Enzimas de Shanghái, China	E-EL-R2856c-20230522
Base de datos de EM de Medicina Tradicional China (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		Base de datos espectral de espectrometría de masas de medicina tradicional china comercial
Reactivo de Trizol	Magen, China	20230508
Columna de amida BEH de UPLC		columna analítica UHPLC basada en amidas
Columna UPLC HSS T3		columna analítica UHPLC de fase inversa (tipo T3)
Sistema Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	Thermo Scientific, EE. UU.
Vanquish sistema MS UHPLC-Q-Exactive HF-X	Thermo Scientific, EE. UU.