Evaluación comparativa in vitro de biofilm con Staphylococcus aureus en superficies modificadas con ácido poliláctico impreso en 3D y polietileno tereftalato glicol

Resumen

Este estudio evalúa la formación de biofilm en ácido poliláctico (PLA) y polietileno tereftalato glicol (PETG) impresos en 3D, utilizando modelos in vitro estáticos, semiestáticos y dinámicos. La metodología apoya el desarrollo de dispositivos médicos más seguros y avanza en la investigación en biopelículas en biomateriales impresos en 3D.

Resumen

La impresión tridimensional (3D) ha acelerado el desarrollo de dispositivos médicos personalizados, pero la formación de biofilm en materiales impresos sigue siendo una amenaza importante para la seguridad y el rendimiento de los implantes. Debido a que la química de materiales y las características superficiales dependientes de la impresión pueden influir en la unión bacteriana y la tolerancia a los antibióticos, se necesitan enfoques in vitro estandarizados que permitan comparaciones significativas entre polímeros de impresión 3D comúnmente utilizados. Aquí comparamos el desarrollo de biopelículas en ácido poliláctico (PLA) y polietileno tereftalato glicol (PETG) utilizando un marco multimodelo de evaluación in vitro que captura aspectos complementarios de la biología del biofilm, incluyendo adhesión temprana, maduración y tolerancia antimicrobiana, tanto bajo condiciones estáticas como de flujo. Se establecieron y evaluaron biopelículas de S. aureus utilizando criterios cuantitativos (carga bacteriana viable y concentración mínima de erradicación de biopelículas [MBEC]) y cualitativos (microscopía electrónica de barrido). Tanto el PLA como el PETG apoyaron la formación de biopelículas entre modelos; sin embargo, el PLA tendía a mostrar una mayor adhesión temprana y una mayor densidad de biopelículas. En ensayos estáticos, el PLA demostró valores de CFU más altos que el PETG, mientras que los valores de MBEC de vancomicina fueron similares entre materiales. Se observaron diferencias dependientes del ensayo en el MBEC entre plataformas, lo que subraya cómo la estructura del modelo puede influir en la aparente susceptibilidad a los antimicrobianos. Bajo flujo dinámico, la carga de biofilm aumentó en relación con condiciones estáticas, con diferencias mínimas dependientes del material. En conjunto, estos resultados destacan la susceptibilidad de ambos polímeros a la formación de biopelículas y demuestran el valor de un marco multimodelo para evaluar el comportamiento de biofilm asociado al material y comparar el rendimiento antimicrobiano en sustratos relevantes para dispositivos impresos en 3D.

Introducción

Los avances recientes en la impresión 3D han llevado a la creciente adopción de dispositivos médicos impresos en 3D debido a su rentabilidad, alta precisión, diseño estructural complejo, utilización eficiente de materiales y diseño específico para cada^paciente. Estos avances están impulsando un avance clínico significativo en el desarrollo de implantes ortopédicos^{personalizados} 3,4,5,6, craneofacial ^7,8, dental ^1,9 y espinal ^10,11.

Numerosas técnicas y materiales permiten ahora un control preciso sobre los parámetros de diseño, lo que permite optimizar las características superficiales y mejorar la funcionalidad general del^{dispositivo 2,12,13}. La superficie del implante es de vital importancia, ya que actúa como la interfaz principal con el entorno del huésped e influye en las respuestas inmunitarias, la adhesión bacteriana y la integración tisular—factores esenciales para el rendimiento a largo plazo del^{dispositivo 14,15}. Sin embargo, esta misma interfaz también presenta un gran desafío, ya que las infecciones asociadas a dispositivos médicos implantables pueden provocar complicaciones graves y a menudo son difíciles de tratar debido a la capacidad de los patógenos para formar biopelículas adheridas a^{la superficie} 16,17,18,19.

En este contexto, las pruebas in vitro de modelos de biofilm en materiales destinados a la fabricación de dispositivos médicos implantables representan un paso fundamental en el proceso de evaluación de riesgos y desarrollo^{de productos 20}. Estos ensayos permiten investigar la susceptibilidad del material a la adhesión microbiana, la formación y maduración de biopelículas, así como la evaluación de la eficacia de estrategias antimicrobianas o modificaciones superficiales destinadas a prevenir el crecimiento microbiano.

Otra limitación de muchos ensayos in vitro de biofilm es que con frecuencia se realizan sobre un único sustrato estandarizado (a menudo un polímero o un material genérico de laboratorio), asumiendo implícitamente que los resultados son transferibles entre materiales de^{dispositivo 21}. Esto es problemático para dispositivos médicos impresos en 3D, donde la química de polímeros y las características superficiales dependientes de la fabricación pueden variar considerablemente y pueden influir directamente en la unión bacteriana, la maduración de biopelículas y la tolerancia^{antimicrobiana 22}. Por lo tanto, evaluar el comportamiento de la biopelícula en los polímeros reales utilizados en la fabricación, en lugar de extrapolar a partir de un único sustrato de referencia, aborda una importante laguna en la práctica actual de pruebas.

Debido a que la superficie del implante es la interfaz clave con el huésped, influye fuertemente en la adhesión bacteriana y la formación de biofilm, que son la base de muchas infecciones asociadas al dispositivo y fallos de tratamiento. Planteamos la hipótesis de que los polímeros impresos en 3D comúnmente usados difieren en su capacidad para apoyar el desarrollo de biopelículas de S. aureus y en su susceptibilidad a la erradicación de biofilm mediada por vancomicina. En consecuencia, realizamos una evaluación cualitativa y cuantitativa de la formación de biopelículas en modelos de materiales impresos en 3D. En el presente estudio, se realizó una evaluación cualitativa y cuantitativa de la formación de biopelículas en modelos de materiales impresos en 3D.

Protocolo

Todos los productos químicos peligrosos (por ejemplo, glutaraldehído, tampón de cacodilato de sodio, hexametildisilazano [HMDS] y etanol) se manejaron de acuerdo con las políticas institucionales de Salud y Seguridad Ambiental (EHS). La preparación y uso de reactivos volátiles/tóxicos se realizó en una campana extractora certificada con equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, protección ocular y guantes resistentes químicamente), y se mantuvieron los disolventes inflamables alejados de las fuentes de inflamación. Los residuos químicos se segregaron y recogieron en recipientes debidamente etiquetados (incluyendo residuos dedicados con arsénico para cacodilato y residuos disolventes para HMDS/etanol) para su eliminación a través del programa institucional de residuos peligrosos. Los materiales biopeligrosos (cultivos bacterianos, platos contaminados y desechables) se descontaminaron según los procedimientos de bioseguridad (por ejemplo, autoclave o desinfectantes aprobados) antes de su eliminación, y cualquier esterilización con óxido de etileno se realizó conforme a los protocolos certificados de la instalación y las prácticas de aireación requeridas.

Modelos impresos en 3D
Los modelos fueron diseñados utilizando software gratuito de diseño asistido por ordenador e impresos mediante una impresora 3D equipada con tecnología de modelado por deposición fusionada, con filamentos de ácido poliláctico (PLA) de 1,75 mm (diámetro) y polietileno tereftalato glicol (PETG) (Tabla de materiales). Los parámetros de impresión utilizados para fabricar las muestras fueron los siguientes: velocidad de movimiento de la tobera (0,4 mm) de 1800 mm/min; velocidad de la primera capa de 300 mm/min; temperatura de extrusión de la tobera de 220 °C (PLA) y 255 °C (PETG); temperatura de la cama de 60 °C; altura de capa de 0,08 mm; ancho de extrusión de 0,48 mm y; densidad de relleno del 100% para todas las muestras. Ninguna de las muestras requería el uso de estructuras de soporte. Los modelos 3D consistían en discos, placas de fondo plano, el dispositivo de biofilm Calgary (CBD) y el dispositivo Robbins modificado (MRD). Los discos estaban diseñados como un cilindro de 6 mm (diámetro) por 6 mm (alto).

Para el CBD, se creó un modelo (Tabla de materiales). El CBD constaba de dos partes: una placa base, una placa microtitulada estándar de 96 pozos (formato ANSI/SLAS) y una tapa (placa de pinzas): una tapa de polímero (PLA o PETG) con 96 clavijas cilíndricas de 2 mm de diámetro y 5 mm de altura. El MRD se desarrolló con pasadores de 4 mm (diámetro y altura) fijados en un modelo de rosca (Tabla de materiales). Tras completar el proceso de impresión, los modelos se retiraban cuidadosamente de la placa de impresión, se inspeccionaban visualmente en busca de deformaciones y posteriormente se esterilizaban con óxido de etileno.

Modelo de disco de biofilm estático
Este método se utilizó para inducir la formación de biofilm en PLA utilizando los discos cilíndricos²³ de 6 mm × 6 mm descritos anteriormente (Figura 1).

Figura 1: Discos de PLA y PETG y una placa de 24 pozos para la formación de biofilm en los modelos de estos discos. (A) Discos representativos impresos en 3D de PLA y PETG antes de la inoculación bacteriana y la formación de biofilm. (B) Discos de PLA y PETG posicionados en una placa de 24 pozos durante la inducción de biofilm bajo condiciones de cultivo in vitro . Abreviaturas; PLA = ácido poliláctico; PETG = polietileno tereftalato glicol modificado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

S. aureus se almacenó a −80 °C en caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con un 15% de glicerol y, antes de cada experimento, se cultivó en ágar sanguíneo e incubado durante 24 horas a 37 °C. Una colonia aislada fue resuspendida en 10 mL de TSB suplementada con 50 mM de glucosa, añadida a un tubo cónico de 50 mL e incubada durante 24 horas a 37 °C en un agitador orbital a 120 rpm. El cultivo resultante se centrifugó durante 5 minutos a 200 x g, y el sobrenadante fue descartado. El pellet se lavó tres veces con 10 mL de NaCl estéril al 0,9%. En el último paso de lavado, el pellet se resuspendió en 10 mL de TSB fresco para obtener una suspensión bacteriana con turbidez equivalente al estándar de McFarland de 0,5 (aproximadamente 1,5 × 10⁸ UFP/mL), según la nefelometría. La suspensión se diluyó luego 1:10 en 10 mL de TSB en un tubo cónico de 15 mL para lograr una concentración bacteriana final de 10,7 UFC/mL. Para experimentos con discos, se añadieron 2 mL de la suspensión bacteriana anterior a cada pozo de placas estériles de 24 pozos para cubrir cada grupo de discos (PLA y PETG) durante 2 horas para permitir la adhesión celular. Los discos se transfirieron asépticamente mediante pinzas estériles a una nueva placa estéril de 24 pozos que contenía 2 mL de NaCl al 0,9% para eliminar las células planctónicas. Se añadieron 10 mL frescos de TSB a los pozos, y las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Durante este paso, las células adheridas a las superficies del disco formaron un biofilm. Tras la incubación, se aspiró el medio de cultivo y los discos se lavaron con 2 mL de NaCl al 0,9% para eliminar el medio residual y las células no adherentes. Se preparó una placa de 24 pozos con 1 mL de solución de vancomicina en diluciones en serie (2–4.096 mg/L), y los discos se sumergieron durante 24 horas. Se incluyó un grupo control sin vancomicina (NaCl 0,9%). Tras 24 horas, los discos se lavaban con 2 mL de NaCl 0,9%.

Para cuantificar las bacterias adheridas en los discos, cada disco se transfirió mediante pinzas estériles a un microtubo que contenía 1 mL de NaCl estéril al 0,9% y se sonicó en un baño ultrasónico durante 15 minutos a 40 kHz y 37 °C para desprender las células adheridas. Los microtubos se vórtizaron durante 60 segundos para asegurar la completa desagregación de los grupos celulares. Se placaron en la TSA alicuotas de 100 μL de la muestra sin diluir (10°) y las diluciones 10⁻² y 10⁻⁴ en NaCl estéril al 0,9% y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. El crecimiento bacteriano se cuantificó contando la UFC en una placa y se expresó como UFC/mL.

Placas de fondo plano de 24 pozos para una concentración mínima de erradicación de biofilm
Para experimentos en placas de 24 pozos, se añadieron 3 mL de suspensión bacteriana (preparada como se describió anteriormente) a cada pozo durante 2 horas para permitir una adhesión celular adecuada. Después, se aspiró la suspensión bacteriana y se añadieron 3 mL de NaCl estéril al 0,9% para eliminar las células planctónicas. Luego se añadieron 3 mL frescos de TSB y las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Durante este paso, las células adheridas a las superficies del pozo formaron una biopelícula. Tras la incubación, se aspiró el TSB y los pozos se lavaron con 3 mL de NaCl al 0,9% para eliminar el medio residual y las células no adherentes. Se añadieron 3 mL de solución de vancomicina en diluciones seriadas (2–4.096 mg/L) a cada pozo. Se incluyó un grupo control sin vancomicina (NaCl 0,9%).

Tras 24 horas, se retiró la solución y cada pozo se lavó suavemente dos veces con 3 mL de NaCl al 0,9%. Se añadieron tres mililitros de NaCl al 0,9% a cada pozo, la placa se tapó y selló con parafilm, y luego se sonicó en un baño ultrasónico durante 15 minutos a 40 kHz y 37 °C para desprender el biofilm adherido. Se recogieron alicuotas de 100 μL de los pozos, y la muestra sin diluir (10°) y las diluciones 10⁻² y 10⁻⁴ preparadas en NaCl estéril al 0,9% se emplataron en TSA e incubaron durante 24 horas a 37 °C. El crecimiento bacteriano se cuantificó contando CFU/mL. Todos los experimentos se realizaron en triplicado. La concentración mínima de erradicación de biofilm (MBEC) se definió como una reducción de al menos 3 log₁₀ en comparación con el grupo control (Figura 2).

Figura 2: Placas impresas de 24 pozos. (A)Placas de 24 pozos impresas con PLA. (B)Placas de 24 pozos impresas con PETG. Abreviaturas; PLA = ácido poliláctico; PETG = Polietileno tereftalato glicol. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El dispositivo de biofilm de Calgary
El CBD consta de una placa microtitulada de 96 pozos y una tapa con 96 clavijas, cada una diseñada para encajar con precisión en un pozo cuando la tapa se coloca sobre la placa. Para inducir la formación de biofilm, cada pozo de una placa estéril de 96 pozos se llenaba con 200 μL de la suspensión bacteriana, y luego se colocaban tapas estériles de clavijas sobre la placa. Las placas ensambladas se incubaron a 37 °C durante 24 horas en condiciones estáticas para permitir el desarrollo de biofilm en las clavijas. Tras la incubación, las tapas de las clavijas se enjuagaron suavemente en una placa de 96 pozos que contenía 200 μL de NaCl al 0,9% para eliminar las células planctónicas. La placa con los pinchos fue sumergida en otra placa de 96 pozos que contenía vancomicina a concentraciones progresivas (2–4.096 mg/L) e incubada a 37 °C durante 24 horas en condiciones estáticas.

La placa con clavijas se enjuagó en una placa de 96 pozos que contenía 200 μL de NaCl al 0,9%, y las clavijas se estamparon cuidadosamente en una placa TSA de 15 cm y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Se observó crecimiento bacteriano y se definió MBEC como la concentración más baja en la que no hubo crecimiento. Todos los experimentos se realizaron en triplicado (Figura 3).

Figura 3: Dispositivo de Calgary y placas de fondo plano de 96 pozos impresos con PLA y PETG. (A) Dispositivo de Calgary impreso con PLA. (B)Placas de fondo plano de 96 pozos impresas con PLA. (C) Dispositivo Calgary impreso con PETG. (D) Placas de fondo plano de 96 pozos impresas con PETG. Abreviaturas; PLA = ácido poliláctico; PETG = glicol de polietileno tereftalato. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Un sistema dinámico bajo condiciones de flujo continuo
Cada MRD contiene cinco clavijas individuales fijadas en un modelo de rosca y dispuestas linealmente a lo largo de un canal con sección transversal rectangular. El sistema dinámico consistía en un matraz que contenía 1 L de solución con el antibiótico a probar, conectado a una bomba peristáltica mediante un tubo de silicona acoplado al MRD. El montaje se realizó en un armario laminar de flujo de aire para evitar la contaminación. El caudal medio se mantuvo en 1 mL/min y circuló por el sistema durante 24 horas. El fluido que pasa por el MRD se descarta en otro matraz de vidrio (sin recirculación).

Se indujeron biopelículas de S. aureus en los pins de un MRD, dejando caer los pegs en placas de 24 pozos con TSB de 3 mL a una concentración de 107 CFU/mL. Los clavos se enjuagaron suavemente por inmersión en una placa de 24 pozos llena con 3 mL de solución de NaCl al 0,9%. Las clavijas se atornillaban cuidadosamente en el MRD (n = 5). Se infundió solución de vancomicina (40 mg/L) diluida al 0,9% de NaCl a través del MDR usando la bomba como se describió anteriormente durante 24 horas. Se incluyó un grupo control sin antibióticos (0,9% de NaCl). Esta concentración se eligió en función de la concentración sérica obtenida durante dosis altas de vancomicina intravenosa, como se describió^{anteriormente 24}. Los pines se retiraron asépticamente del MRD usando pinzas estériles, se colocaron en microtubos que contenían 1 mL de NaCl estéril al 0,9% tras lavarlos con 0,9% de NaCl, y se sonicaron en un baño ultrasónico durante 15 minutos a 40 kHz y 37 °C para asegurar el desprendimiento completo del biofilm. Los microtubos se vórtizaron durante 60 segundos y el procedimiento se repitió tres veces para interrumpir los agregados residuales de biofilm. Se emplacaron alicuotas de 100 μL en la TSA y las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C. El crecimiento bacteriano se cuantificó y expresó como UFC/mL (Figura 4).

Figura 4: Dispositivo Robbins modificado con PETG y PLA y una foto del sistema dinámico. (A) dispositivo Robbins modificado impreso con PETG o PLA. (B) Foto del sistema dinámico. Abreviaturas; PLA = ácido poliláctico; PETG = glicol de polietileno tereftalato. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Microscopía electrónica de barrido
Para visualizar la morfología y estructura de las biopelículas, se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) sobre los discos. Se indujo biofilm en discos tal y como se describe en los protocolos. Los discos se retiraron cuidadosamente de la placa usando pinzas estériles y se fijaron con una solución (0,68 g de sacarosa, 0,42 g de cacodinato sódico, 0,6 mL de glutaraldehído al 30%), con 19,4 mL de agua desionizada, durante 45 minutos. Posteriormente, las muestras se transfirieron a una solución tampón (0,68 g de sacarosa y 0,42 g de cacodinato sódico) durante 10 minutos. Las muestras se deshidrataron en una serie de etanol graduado (35%, 50%, 70% y 100%) durante 10 minutos cada una. Después, los ejemplares se transfirieron a otra placa de Petri y se cubrieron con 100% hexametil disilazano durante 10 minutos. Finalmente, los discos se recubrieron con oro con sputter mediante una bomba rotativa y se montaron sobre un muñón metálico para su observación bajo diferentes aumentos en un microscopio electrónico de barrido (Figura 5).

Figura 5: Microscopía electrónica de barrido de modelos impresos en 3D con PLA y PETG con y sin inducción de biofilm. (A) Fotografía de microscopía electrónica de barrido de PLA sin biofilm. (B) Fotografía de microscopía electrónica de barrido de PETG sin biofilm. (C) Fotografía de microscopía electrónica de barrido de bacterias formadoras de biofilm en discos de PLA. (D) Fotografía de microscopía electrónica de barrido de bacterias formadoras de biofilm en discos de PETG. C y D muestran características típicas de las biopelículas: organización bacteriana en una estructura 3D, adherencia a superficies y presencia de una matriz extracelular. La barra blanca representa 10 μm. Abreviaturas; PLA = ácido poliláctico; PETG = Polietileno Tereftalato Glicol. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Análisis estadístico
Algunos análisis fueron descriptivos. Para los datos cuantitativos, el tamaño de la muestra justificó el uso de la mediana con el rango intercuartil, mediante la prueba de Mann-Whitney para la comparación estadística. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

Resultados

Modelo de disco de biofilm estático
Este ensayo se utiliza para determinar el MBEC en especímenes individuales. Las diluciones progresivas dobles de vancomicina demostraron una formación basal de biofilm de 7,48 × 10⁵ UFC/mL [IQR 6,34–8,72] para PLA y 3,60 × 10⁵ CFU/mL [IQR 3,08–5,52] para PETG. Aunque ambos materiales mostraron densidades de biofilm dentro del rango de 10^{a 5} , se observó una diferencia estadísticamente significativa e...

Discusión

Este estudio propone una evaluación integral invitro de la formación de biofilm en polímeros de grado médico impresos en 3D, específicamente PLA y PETG, utilizando cuatro plataformas experimentales complementarias: ensayos estáticos de disco, modelos de placas de 24 pozos, el CBD y un sistema de flujo dinámico basado en un MRD. Al integrar estos modelos, el estudio pretende caracterizar cómo se comportan los materiales de impresión distintos cuando se exponen a la inducción de b...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,9% NaCl	Fresenius Kabi Brasil, Ceara, Brasil	17811
Impresora 3D con tecnología de modelado por deposición fundida (Bambu X1-Carbon) y nbsp;	Laboratorio Bambu, Shenzhen, China	PF001-P
Agar de sangre	NewProv, Paraná, Brasil	PA31
Dispositivo de Calgary para biofilm descargable	Sin compañía	Ver enlace (sin números de catálogo)	https://www.printables.com/model/1464751-calgary-model-biofilm
Placa multipozo de cultivo celular, 24 pozos	Greiner Bio-One, Kremsmü nster & Ouml; Sterreich, Austria & nbsp;	662160
Centrífuga (5910 Ri)	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	5943000511
Tubo centrífugo estéril 15 mL	Corning, Misuri, EE. UU.	430790
Tubo centrífugo estéril 50 mL	Corning, Misuri, EE. UU.	430291
Controlador de pipeta electrónica (Easypet® 3)	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	4430000018
Etanol (≥ 99,5%, reactivo ACS)	Sigma-Aldrich, Misuri, EE. UU.	459844
Glutaraldehído	Merck, Darmstadt, Alemania	8143931000
Hexametildisilazano	Merck, Darmstadt, Alemania	440191
Incubadora (502/4-C)	Fanem, Sã o Paulo, Brasil	502007700
Armario de flujo de aire laminar (BioSEG 9)	Veco, Sã o Paulo, Brasil	1EAC3770
Pipeta mecánica (Referencia Eppendorf y registro 2)	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	4924000061
Dispositivo Robbins modificado descargable	Sin compañía	Ver enlace (sin números de catálogo)	https://www.printables.com/model/1481700-robbins-device-modified
Nefelómetro	Alfakit, Florian & oacute; Polis, Brasil	7718
Agitador orbital (INNOVA 44R)	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	M1282-0314
Parafilm M	Amcor, Illinois, EE. UU.	PM-996
Bomba peristáltica (Minipuls® 3)	Gilson, Villiers-le-Bel, Francia	F117604
Placa de Petri (90 x 15 mm)	Greiner Bio-One, Sã o Paulo, Brasil	630164
Punta de pipeta 1&n; 200μ L	Corning, Misuri, EE. UU.	CLS4142
Polietileno tereftalato glicol (PETG)	Creality, China	44759
Ácido poliláctico (PLA) Ultrafusión® PLA PRO1	BASF, Maarssen, Países Bajos	PR1-7501A075
Bomba rotativa (Q150R ES Plus)	Quantum Technologies, Lewes, Reino Unido	13034
Microscopio electrónico de barrido (Vega3 LMU)	Tescan, Brno, República Checa	Ver enlace (sin números de catálogo)	https://tescan.com/product-portfolio
Pipeta serológica 10 mL	Corning, Misuri, EE. UU.	CLS4488
Cacodiato sódico	Sigma-Aldrich, Misuri, EE. UU.	C0250
Staphylococcus aureus ATCC® Deformación 25923	Laborclin, Pinhais, Brasil	660674
Sacarosa	Sigma-Aldrich, Misuri, EE. UU.	59378
El descarable de fondo plano de 24 pozos	Sin compañía	Ver enlace (sin números de catálogo)	www.printables.com/model/104339-24-well-plates
Agar de soja tríptico	Kasvi, Madrid, España	K25-1068
Caldo de soja tríptico	Sigma-Aldrich, Misuri, EE. UU.	22092
Congelador ultra bajo (IULT 335 D)	Indrel, Paraná, Brasil	12038
Baño ultrasónico (Soniclean 15)	Sanders Medical, Minas Gerais, Brasil	Ver enlace (sin números de catálogo)	https://sandersdobrasil.com.br/produto/lavadora-ultrassonica-soniclean-15d/
Vancomicina	ABL, Sã o Paulo, Brasil	15,56,20,041
Vórtice (FLEXVÓRTEX)	Loccus, Sã o Paulo, Brasil	4500