Evaluación de los efectos del triptolido en la gefirina, colibistina y autofagia del hipocampo en un modelo murino Aβ1-42

Resumen

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón agregado para la enfermedad de Alzheimer inducida por Aβ1-42 y la evaluación de los efectos del triptolido en proteínas asociadas a sinapsis inhibidoras del hipocampo, señalización PI3K/Akt/GSK-3β y marcadores relacionados con la autofagia.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer está asociada con disfunción sináptica, pero los procedimientos estandarizados para evaluar cómo la patología inducida por Aβ afecta a las proteínas asociadas a la sinapsis inhibitoria y a la señalización relacionada con la autofagia tras la intervención candidata siguen siendo limitados. Este protocolo describe un flujo de trabajo para establecer un modelo murino similar a la enfermedad de Alzheimer inducida por Aβ1-42 y evaluar los efectos del triptolido sobre la gefirina hipocampal, la colibistina, la señalización PI3K/Akt/GSK-3β y marcadores relacionados con la autofagia. Los ratones adultos C57BL/6J reciben inyección intracerebroventricular bilateral de Aβ1-42 preparada bajo condiciones inductoras de agregación, seguida de la administración diaria intraperitoneal de triptolido con o sin el inhibidor de PI3K LY294002. El aprendizaje espacial y la memoria se evalúan mediante pruebas de laberinto acuático Morris. La lesión neuronal del hipocampo y la deposición de Aβ se evalúan mediante tinción de hematoxilina y eosina y inmunohistoquímica de Aβ, y los lisados hipocampales se analizan mediante Western blot para cuantificar Gefirina, Gefirina fosforilada, Colibistina, proteínas de señalización PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I y p62. Las consideraciones procedimentales clave incluyen la preparación estandarizada de Aβ1-42, la inyección estereotáxica precisa, condiciones consistentes de pruebas conductuales, selección cega de la región de interés y análisis estandarizado de imágenes y densitometría. Utilizando este flujo de trabajo, la administración de Aβ1-42 produjo déficits de aprendizaje espacial y memoria, lesiones neuronales del hipocampo, deposición de Aβ, reducción de la expresión de Gefirina y Colobistina, alteración de la señalización de PI3K/Akt/GSK-3β y aumento de la acumulación de LC3-II/I y p62. El triptolido revirtió parcialmente estos cambios conductuales, histológicos y moleculares, mientras que LY294002 atenuó sus efectos. Este protocolo puede utilizarse para evaluar alteraciones moleculares del hipocampo inducidas por Aβ e intervenciones candidatas, reconociendo al tiempo que este modelo no reproduce la progresión crónica y multifactorial de la enfermedad de Alzheimer humana.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado por deterioro cognitivo, deterioro de la memoria y trastornos conductuales, y representa una de las principales causas de demencia en adultos mayores. Aunque la deposición de β amiloide (Aβ), la patología de la tau, la disfunción sináptica, la neuroinflamación y la homeostasis alterada de proteínas han estado ampliamente implicadas en la patogénesis de la EA, los mecanismos moleculares que vinculan la toxicidad asociada a Aβ con la alteración de proteínas sinápticas inhibitorias siguen siendo incompletamente^comprendidos 1,2,3,4 . La disfunción sináptica inhibitoria puede alterar el equilibrio entre excitación e inhibición en los circuitos neuronales, contribuyendo así a la inestabilidad de la red y al deterioro cognitivo. Sin embargo, los eventos de señalización intracelular que regulan las proteínas de andamiaje asociadas a sinapsis inhibitorias bajo condiciones patológicas similares a la EA inducidas por Aβ requieren una mayor^{aclaración 5}.

La gefirina es una proteína principal de andamiaje postsináptico que ancla y estabiliza los receptores inhibidores de neurotransmisores, incluidos los receptores de glicina y los receptores de ácido γ-aminobutírico tipo A, en los sitios^{postsinápticos 6}. La colibistina, codificada por ARHGEF9, es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina que interactúa con la Gefirina y promueve el agrupamiento y la localización de membranas de componentes sinápticos^{inhibitorios.} Por tanto, la interacción funcional entre Gephyrina y Collybistina es esencial para la organización, el mantenimiento y la plasticidad de las sinapsis inhibitorias. La alteración de este complejo proteico puede afectar la neurotransmisión inhibitoria y contribuir a déficits cognitivos. Cabe destacar que la estabilidad de la gefirina y el agrupamiento sináptico pueden estar regulados por mecanismos dependientes de la fosforilación. Se ha reportado que la señalización asociada a oligómeros Aβ influye en quinasas como la glicógeno sintasa quinasa-3β (GSK-3β), que pueden promover la fosforilación de la Gefirina en la serina 270 y, por tanto, afectar al agrupamiento y degradación de la Gefirina. Estos hallazgos sugieren que la regulación mediada por quinasas de la Gephyrina puede representar un vínculo molecular importante entre la patología asociada a Aβ y la disfunción sináptica^{inhibitoria 8,9}.

La vía PI3K/Akt es una vía clave de señalización intracelular implicada en la supervivencia neuronal, la plasticidad sináptica, la homeostasis de proteínas y la regulación de la autofagia. La actividad de Akt puede suprimir GSK-3β mediante fosforilación inhibitoria, modulando así los sustratos posteriores implicados en la función neuronal y la estabilidad sináptica. La desregulación de la señalización PI3K/Akt/GSK-3β ha estado implicada en la lesión neuronal relacionada con la EA y puede contribuir tanto a un deterioro sináptico como a una degradación anormal de proteínas^10,11. Paralelamente, la autofagia es una vía esencial de degradación intracelular que elimina orgánulos dañados y proteínas mal plegadas. La disfunción autofagia-lisosomal se ha asociado estrechamente con la acumulación de Aβ, patología de la tau y daño neuronal en la^{AD 12}. Sin embargo, los cambios en LC3-II/I por sí solos no pueden distinguir el aumento de la formación de autofagosomas de una degradación autofágica deteriorada; Por lo tanto, se necesitan marcadores adicionales como P62 para evaluar mejor los cambios de flujo relacionados con la autofagia. En conjunto, estas observaciones apoyan la necesidad de examinar la actividad PI3K/Akt, la regulación mediada por GSK-3β de la gefirina y los marcadores relacionados con la autofagia dentro del mismo marco experimental.

Se ha reportado que el triptolido, un triepóxido diterpeno bioactivo aislado de Tripterygium wilfordii, ejerce efectos antiinflamatorios, inmunomoduladores y^{neuroprotectores 13}. Estudios previos han sugerido que el triptolido puede mejorar el rendimiento cognitivo y preservar proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias en modelos similares a la EA. No obstante, la relación mecanicista entre el tratamiento con triptolido, la activación de la vía PI3K/Akt, la fosforilación de Gefirina mediada por GSK-3β, la expresión de colibistina y los cambios en proteínas relacionadas con la autofagia no ha sido completamente definida. No está claro si el triptolido regula la expresión de Gefirina y Colibistina en el hipocampo mediante un mecanismo asociado a PI3K/Akt/GSK-3β en un modelo murino similar a la EA inducido por Aβ1-42^14,15.

En comparación con modelos transgénicos crónicos de EA, como ratones APP/PS1 o 5xFAD, y modelos basados en tauopatía, la inyección intracerebroventricular de Aβ1-42 agregado proporciona un enfoque relativamente rápido y técnicamente accesible para inducir lesiones hipocampales asociadas a Aβ y deterioro cognitivo. Este protocolo es adecuado cuando el objetivo experimental es evaluar la neurotoxicidad inducida por Aβ a corto plazo, los cambios moleculares del hipocampo y los efectos relacionados con la intervención en vías de señalización definidas. Sin embargo, este modelo no reproduce la producción crónica de amiloides, la patología tau, las alteraciones vasculares, la complejidad neuroinmune ni la progresión dependiente de la edad del EA humano. Por lo tanto, los hallazgos obtenidos mediante este protocolo deben interpretarse como patologías similares al EA inducidas por Aβ y, idealmente, validarse en modelos transgénicos crónicos, modelos relacionados con la tau o sistemas neuronales de origen humano. A pesar de la evidencia previa que vinculaba la patología de Aβ, la señalización PI3K/Akt/GSK-3β, proteínas asociadas a la sinapsis inhibitoria y anomalías relacionadas con la autofagia con patologías similares al EA, pocos protocolos integran pruebas conductuales, evaluación histológica hipocampal, inmunohistoquímica de Aβ, análisis de proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias, evaluación de la señalización quinasa y detección de marcadores relacionados con la autofagia dentro de un único modelo de intervención inducido por Aβ1-42. Esta brecha metodológica limita la evaluación reproducible de si los compuestos candidatos modulan los cambios en proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias mediante vías de señalización intracelulares definidas.

El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo reproducible para evaluar la expresión hipocampal de Gefirina y Colibistina y sus mecanismos regulatorios asociados en un modelo murino similar al EA inducido por Aβ1-42 tratado con triptolido, con o sin el inhibidor de PI3K LY294002. La contribución original de este trabajo es la integración de la administración estereotáxica de Aβ1-42, la modulación farmacológica de las vías de señalización, las pruebas de laberinto de agua Morris, la evaluación histológica e inmunohistoquímica, y el análisis de Western blot de proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias, señalización PI3K/Akt/GSK-3β y marcadores relacionados con la autofagia. La hipótesis de trabajo era que una patología similar a la EA inducida por Aβ1-42 estaría asociada con una señalización deteriorada de PI3K/Akt, fosforilación alterada de la Gefirina asociada a GSK-3β, reducción de la expresión hipocampal de Gefirina y Colibistina, y acumulación anormal de proteínas relacionadas con la autofagia, mientras que el tratamiento con triptolido revertiría parcialmente estas anomalías conductuales y moleculares.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Médica de la Universidad de Medicina de Hubei y se realizaron conforme a las directrices institucionales para el cuidado y uso animal (Nº SYXK2019-0031.). Todos los procedimientos que involucren animales Aβ1-42, triptoluro, LY294002, paraformaldehído, xileno, etanol y reactivos quimioluminiscentes deben realizarse con el equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras. Los cadáveres animales, tejidos cerebrales, consumibles contaminados con Aβ, residuos de paraformaldehído, residuos de xileno y materiales contaminados con ECL deben recogerse por separado y eliminarse conforme a las normativas institucionales de bioseguridad y eliminación de residuos químicos. El análisis de imágenes se realizó usando ImageJ. Para el análisis inmunohistoquímico, las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8 bits o se sometieron a deconvolución de color para aislar la tinción DAB-positiva. El mismo umbral se aplicó a todas las imágenes dentro del mismo experimento. Se midieron el área de tinción positiva, el área total de la región de interés y la densidad integrada. Para Western bloting, las intensidades de las bandas se midieron utilizando la herramienta de análisis en gel tras la resta de fondo. Los niveles de proteínas objetivo se normalizaron a β-actina, mientras que las proteínas fosforiladas se normalizaron a sus niveles totales correspondientes.

Los reactivos y equipos utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales, incluyendo nombres de productos, fabricantes, números de catálogo o modelo, y descripciones genéricas.

Animales y agrupación experimental
Se adquirieron cuarenta y ocho ratones adultos C57BL/6J, incluidos 24 machos y 24 hembras, de entre 10 y 12 semanas y con un peso de 22 a 28 g, al Centro Experimental Animal de la Universidad de Medicina de Hubei. Los ratones fueron alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos a 22 ± 2 °C, con acceso libre a agua autoclavada y comida estándar para roedores. Tras una semana de aclimatación, los ratones fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos: el grupo control, el grupo modelo tipo EA inducido por Aβ1-42, el grupo tratado con triptolido y el grupo con cotratamiento LY294002 más triptolido, con 12 ratones por grupo. Ratones machos y hembras se equilibraron entre los grupos de la forma más equilibrada posible.

El péptido Aβ1-42 se disolvió en solución fisiológica normal estéril hasta una concentración final de 10 μg/μL. Para preparar Aβ1-42 en condiciones que inducen la agregación, la solución se incubó a 37 °C durante 7 días en un baño maria circulante, se mezcló suavemente antes de usarla y se mantuvo en hielo durante la inyección. Esta condición de preparación fue adaptada de procedimientos de agregación Aβ42 publicados anteriormente. En el presente estudio, el estado de agregación del lote exacto inyectado Aβ1-42 no fue caracterizado de forma independiente por fluorescencia de tioflavina T, SDS-PAGE/Western blot o microscopía electrónica de transmisión. Por lo tanto, el término "Aβ1-42 agregado" en este protocolo se refiere a Aβ1-42 preparado bajo condiciones de incubación que inducen la agregación.

Para el establecimiento del modelo, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de 10% pentobarbital sódico a una dosis de 0,04 mL/10 g de peso corporal. Se confirmó una anestesia adecuada por la ausencia de retirada del pedal y reflejos corneales. A continuación, se fijó a cada ratón un aparato estereotáxico, y se rapó y desinfectó el cuero cabelludo con iodóforo o etanol al 75%. Se realizó una incisión en la línea media para exponer el cráneo y se identificó el bregma bajo un estereomicroscopio. El cráneo se ajustó para que el bregma y el lambda estuvieran posicionados en el mismo plano horizontal.

Las inyecciones bilaterales en ventrículos laterales se realizaron utilizando las siguientes coordenadas relativas al bregma: anteroposterior, −0,50 mm; mediolateral, ±1,00 mm; y dorsoventral, a −3,00 mm de la superficie del cráneo. Se inyectó lentamente (2 μL/min) un volumen total de 2 μL de solución agregada de Aβ1-42 en cada ventrículo lateral mediante una microjeringa. La inyección se realizó a baja velocidad constante para reducir el daño tisular y el reflujo. Después de la inyección, la aguja se dejaba en su sitio aproximadamente 5 minutos y luego se retiraba lentamente. Los ratones control recibieron un volumen igual de solución salina normal estéril en las mismas coordenadas y utilizando el mismo procedimiento quirúrgico. Tras la inyección, la incisión en el cuero cabelludo se cerraba con suturas o clips para heridas, y los ratones se colocaban en una jaula de recuperación calentada hasta que recuperaban la conciencia. La recuperación postoperatoria, el peso corporal, la cicatrización de heridas, el comportamiento de aseo, la actividad locomotora y los signos de dolor o malestar se monitorizaban diariamente.

La intervención con medicamentos se inició 2 semanas después de la inyección estereotáxica, después de que el modelo se considerara estable. El triptolido se disolvió en suero fisiológico normal que contenía un 4% de propilenglicol y se administró intraperitonealmente una vez al día durante 30 días consecutivos. El grupo tratado con triptolido recibió triptolido a 0,2 mg/kg diario, mientras que el grupo de cotratamiento LY294002 más triptolido recibió triptolido junto con el inhibidor de PI3K LY294002 a 0,3 mg/kg una vez al día durante 30 días consecutivos. El grupo de control y el grupo de modelos tipo AD inducido por Aβ1-42 recibieron volúmenes iguales de solución vehicular usando el mismo esquema^{de inyección 16}.

Prueba del laberinto acuático Morris
El aprendizaje espacial y la memoria se evaluaron utilizando el laberinto de agua de Morris 24 horas después de la administración final de medicamentos. El laberinto de agua consistía en una piscina circular llena de agua mantenida a 22 °C ± 1 °C. Se colocaron señales visuales alrededor de la piscina y se mantuvieron sin cambios durante todo el experimento. Durante la fase de navegación por el lugar, la plataforma oculta quedó fija en el cuadrante objetivo. Antes de las pruebas cada día, se permitió que los ratones se aclimataran a la sala de pruebas durante aproximadamente 30 minutos.

La prueba de navegación por lugares se realizó durante 6 días consecutivos. En cada prueba, el ratón se colocaba suavemente en el agua, mirando hacia la pared de la piscina desde uno de los cuadrantes iniciales, y se permitía buscar la plataforma oculta durante hasta 60 segundos. Si el ratón encontraba la plataforma en un plazo de 60 s, se le permitía permanecer en la plataforma durante 15 s. Si el ratón no localizaba la plataforma en un plazo de 60 s, se guiaba hasta la plataforma y se le permitía permanecer allí durante 20 s para facilitar la consolidación de la memoria espacial. Cada ratón se sometía a 4 pruebas al día, y la latencia de escape, la distancia de natación y la velocidad de nado se registraban mediante un sistema automatizado de seguimiento por vídeo.

Al día 7, la plataforma fue retirada para el juicio de la sonda. El ratón se colocaba en el agua desde el cuadrante opuesto a la ubicación original de la plataforma y se le permitía nadar libremente durante 60 segundos. Se registraron el número de cruces de andenes y el porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante objetivo. Tras cada prueba, el ratón se secaba y se devolvía a una jaula calentada para evitar la^{hipotermia 17,18}.

Recogida de tejidos
Tras pruebas de comportamiento, los ratones fueron profundamente anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de 10% de pentobarbital sódico a una dosis de 0,04 mL/10 g de peso corporal. Ocho ratones de cada grupo fueron seleccionados aleatoriamente para la extracción proteica del hipocampo. Sus cerebros fueron rápidamente extraídos sobre hielo y los tejidos bilaterales del hipocampo fueron diseccionados sobre una superficie helada. Las muestras del hipocampo se colocaban en crioviales premarcados, se congelaban rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaban a −80 °C hasta la extracción de proteínas.

Los cuatro ratones restantes de cada grupo se utilizaron para análisis histológicos e inmunohistoquímicos. Bajo anestesia profunda, los ratones fueron perfundidos transcárdicamente con solución salina amortiguada con fosfato hasta que el hígado palideció, seguido de un 4% de paraformaldehído. Los cerebros fueron cuidadosamente extraídos y post-fijados en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 horas. Tras la fijación, los tejidos cerebrales se sometieron a la plataforma experimental de patología, donde se realizó la incrustación de parafina y la posterior sección. El paraformaldehído se manipulaba en una campana extractora química, y los residuos que contenían paraformaldehído se recogían por separado conforme a los requisitos institucionales de eliminación de residuos químicos.

Tinción de hematoxilina y eosina
Los tejidos cerebrales incrustados en parafina se cortaron en secciones coronales de 4 μm que contenían el hipocampo. Las secciones se hornearon a 60 °C durante 1 hora, se desparafinizaron dos veces en xileno durante 10 minutos cada una, y se rehidrataron mediante soluciones de etanol graduadas (100%, 95%, 85% y 75%) seguidas de agua destilada (5 min por cada paso). Tras la rehidratación, las secciones se teñían con hematoxilina durante 10 minutos, se enjuagaban con agua del grifo corriente, se diferenciaban brevemente en alcohol ácido (2 s) cuando era necesario, y se azulaban con agua del grifo corriente. Las secciones se contrateñieron con eosina durante 5 minutos, se deshidrataron mediante etanol graduado, se limpiaron con xileno dos veces durante 5 minutos cada una y se montaron con resina neutra.

Se observó la morfología del hipocampo bajo un microscopio óptico. Se obtuvieron imágenes de la misma subregión hipocampal en todos los grupos, utilizando los parámetros de aumento e imagen del 20×. El daño neuronal fue evaluado en función de la densidad neuronal, la picnosis nuclear y la disposición desordenada mediante software de análisis de imágenes por un investigador cegado a la asignación de^{grupos 19}.

Inmunohistoquímica Aβ
Para la inmunohistoquímica Aβ, las secciones de parafina se desparafinizaron y rehidrataron según lo descrito para la tinción de hematoxilina y eosina. La obtención de antígenos se realizó en el tampón de recuperación de antígenos EDTA a pH 8,0 calentando las secciones en un microondas a alta potencia durante 3 minutos en dos ocasiones. Las secciones se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos cada una. La actividad endógena de la peroxidasa se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de un lavado de PBS tres veces durante 5 minutos cada uno. La unión inespecífica se bloqueó con suero normal de cabra al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario contra Aβ diluido a 1:200 en PBS. Tras la incubación, se lavaron las secciones tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, y luego se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBS, se aplicó el sustrato DAB y se monitorizó el desarrollo del color bajo el microscopio. La reacción se detuvo con agua destilada una vez que se vio la tinción marrón-positiva. Las secciones se contrateñieron con hematoxilina, se deshidrataron mediante etanol graduado, se limpiaron con xileno y se montaron con resina neutra. Se capturaron imágenes desde la misma subregión hipocampal en todos los grupos utilizando ajustes idénticos de microscopio a un aumento del 20×. La inmunotinción Aβ se cuantificó mediante software de análisis de imágenes. El umbral de tinción positiva se mantuvo consistente en todas las imágenes, y la deposición de Aβ se calculó como el área de tinción positiva dividida por el número total de células en cada campo microscópico.

Extracción de proteínas del hipocampo y análisis de western blot
Los tejidos hipocampales congelados se mantuvieron sobre hielo y se homogeneizaron en un tampón de lisis RIPA helado que contenía proteasas e inhibidores de fosfatasa. Los homogeneados se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y se vórtizaron de forma intermitente para asegurar una lisis suficiente. Los lisados se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, y se recogieron los sobrenacionantes para análisis de proteínas. Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando un kit de análisis de proteínas BCA según las instrucciones del fabricante. En resumen, se prepararon los estándares de BSA y las muestras de proteínas en duplicado, mezclados con reactivo de trabajo BCA, incubados a 37 °C durante 30 minutos y medidos a 562 nm usando un lector de microplacas. Las concentraciones de proteínas se calcularon según la curva estándar y todas las muestras se ajustaron a la misma concentración final antes de la^{electroforesis 20}.

20 μg de proteína total de cada muestra hipocampal se separaron con un 12% de SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de PVDF. La electroforesis se realizaba a 80 V para apilamiento y 120 V para separación. Las proteínas se transfirieron a membranas PVDF activadas en metanol mediante transferencia húmeda a 100 V durante 90 minutos a 4 °C. Tras la transferencia, las membranas se bloquearon con un 5% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra la Gefirina (dilución 1:1000), Gefirina fosforilada (dilución 1:500), Colibitina (dilución 1:1000), PI3K (dilución 1:1000), Akt (dilución 1:1000), Akt fosforilado (dilución 1:1000), GSK-3β (dilución 1:1000), GSK-3β fosforilado (dilución 1:1000), LC3 (dilución 1:1000), p62 (dilución 1:1000) y β-actina (dilución 1:5000). Tras el lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente (dilución 1:5000). Las bandas proteicas se visualizaron utilizando sustrato quimioluminiscente ECL y capturadas con un sistema de imagen quimioluminiscencia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software de análisis de imágenes. Los niveles totales de expresión proteica se normalizaron a β-actina. Imágenes Western blot de alta resolución sin recortar se incluyeron en los materiales complementarios.

Datos estadísticos
El análisis estadístico se realizó utilizando software de análisis estadístico y generación de grafos. Los datos se expresaban como media ± SD, como se indica en las leyendas de las figuras. Las pruebas de comportamiento y la cuantificación de imágenes fueron realizadas por investigadores que no se identificaban ante la asignación de grupos. La latencia de escape durante la fase de entrenamiento del laberinto acuático Morris se analizó utilizando ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, con el grupo y el día de entrenamiento como factores. Se analizaron los datos de los ensayos de sonda, cuantificación histológica, cuantificación inmunohistoquímica y densitometría de Western blot utilizando una prueba ANOVA unidireccional. La significación estadística se definió como p < 0,05. Se utilizó la notación estándar de significación de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Los tamaños exactos de muestra se indicaban en las leyendas correspondientes de las figuras. Ratones machos y hembras estaban distribuidos de manera uniforme entre los grupos experimentales. Sin embargo, no se realizó un análisis estadístico estratificado por sexo porque el estudio no fue diseñado ni potenciado para detectar efectos específicos por sexo. Esta limitación se reconoce en la sección de Discusión.

Resultados

Deterioro del aprendizaje y la memoria en ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42 y mejoría parcial tras el tratamiento con triptolido

Para establecer un modelo murino similar al AD inducido por Aβ1-42, se inyectó estereotácticamente Aβ1-42 agregado en los ventrículos laterales bilaterales de ratones C57BL/6J. Tras la creación del modelo, los ratones fueron tratados con vehículos, triptolido o triptolido combinados con el inhibidor PI3K LY294002. El aprendizaje espacial y la memoria se evaluaron después utilizando el laberinto acuático Morris.

Durante la fase de navegación de lugares de 6 días, la latencia de escape disminuyó gradualmente en todos los grupos, lo que indica que los ratones adquirieron la tarea de aprendizaje espacial con entrenamiento repetido (Figura 1A). Sin embargo, los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron latencias de escape consistentemente mayores que los ratones control, especialmente en días de entrenamiento posteriores, lo que sugiere un aprendizaje espacial deteriorado. El tratamiento con triptolido acortó la latencia de escape en comparación con el grupo modelo tipo AD inducido por Aβ1-42, mientras que el cotratamiento con LY294002 debilitó esta mejora. Estos hallazgos indican que el triptolido mejoró parcialmente el deterioro del aprendizaje espacial inducido por Aβ1-42, y este efecto se atenuó por la inhibición de PI3K.

Las pistas representativas de natación apoyaron aún más estos cambios de comportamiento (Figura 1B). Los ratones control mostraron un patrón de búsqueda más directo y orientado al objetivo alrededor de la ubicación de la plataforma, mientras que los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron una trayectoria de natación dispersa e ineficiente. Los ratones tratados con triptolido mostraron un mejor comportamiento de búsqueda, con trayectorias más concentradas alrededor del área objetivo. En contraste, los ratones tratados con LY294002 y triptolide mostraron una búsqueda menos eficiente que aquellos tratados solo con triptolida. En el ensayo con sonda realizado tras la retirada de la plataforma, ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 cruzaron la ubicación original de la plataforma menos veces que los ratones control, lo que indica una retención espacial deteriorada (Figura 1C). El tratamiento con triptolido aumentó el número de pasos a nivel de andenes, mientras que LY294002 cotratamiento redujo este efecto. De manera similar, el porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante objetivo se redujo en ratones tipo EA inducidos por Aβ1-42 en comparación con los ratones control, aumentó tras el tratamiento con triptolido y volvió a disminuir tras LY294002 cotratamiento (Figura 1D).

En conjunto, estos resultados conductuales demuestran que la inyección intracerebroventricular bilateral de Aβ1-42 agregado indujo déficits de aprendizaje espacial y memoria en ratones. El triptolido revirtió parcialmente estos deterioros conductuales, mientras que LY294002 atenuó el efecto protector del triptolido, lo que sugiere que la señalización PI3K/Akt podría contribuir a los efectos conductuales observados en este modelo.

La inyección de Aβ1-42 indujo lesión neuronal del hipocampo y deposición de Aβ, que fueron atenuadas por triptolido

Para verificar aún más el establecimiento de cambios patológicos similares a la EA inducidos por Aβ1-42 y evaluar el efecto del triptolido sobre la lesión hipocampal, se realizaron tinciones de hematoxilina y eosina y la inmunohistoquímica de Aβ en secciones cerebrales de cada grupo.

La tinción con HE mostró que las neuronas del grupo control estaban dispuestas de forma densa y regular, con morfología celular y estructura nuclear relativamente claras (Figura 2A). En contraste, los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron daños neuronales hipocampales evidentes, caracterizados por una disposición celular desordenada, reducción de la densidad neuronal y aumento de la condensación nuclear. El tratamiento con triptolido mejoró parcialmente la morfología neuronal del hipocampo, con una disposición celular más preservada y menos picnosis nuclear aparente en comparación con el grupo modelo inducido por Aβ1-42. Sin embargo, el cotratamiento con LY294002 atenuó el efecto protector del triptolido, reflejado en una desorganización y lesión neuronal más pronunciadas en comparación con el grupo tratado con triptolido.

Posteriormente se realizó inmunohistoquímica Aβ para evaluar la deposición de Aβ en el hipocampo (Figura 2B). Se observó una tinción mínima de Aβ-positiva en el grupo de control, mientras que el grupo modelo tipo AD inducido por Aβ1-42 mostró señales marrones de Aβ positivas notablemente aumentadas. El tratamiento con triptolido redujo la tinción de Aβ positiva en comparación con el grupo modelo, lo que indica que el triptolido atenuó la deposición de Aβ en este modelo. En cambio, los ratones tratados con LY294002 más triptolido mostraron un aumento en la tinción Aβ-positiva en comparación con los ratones tratados solo con triptolida. El análisis cuantitativo confirmó además estas observaciones histológicas. El área de señal Aβ-positiva normalizada al número total de células en cada campo microscópico aumentó en el grupo modelo tipo EA inducido por Aβ1-42 en comparación con el grupo control, se redujo tras el tratamiento con triptolido y aumentó parcialmente tras LY294002 cotratamiento (Figura 2B).

Estos resultados indican que la inyección de Aβ1-42 indujo daño neuronal hipocampal y acumulación de Aβ, mientras que el triptolido alivió parcialmente estos cambios patológicos. La reversión observada tras LY294002 cotratamiento sugiere que la señalización PI3K/Akt puede contribuir al efecto protector del triptolido.

El triptolido restauró la expresión de la Gefirina y la Colibitina en hipocampo y moduló la señalización PI3K/Akt/GSK-3β

Para determinar si los cambios conductuales e histológicos iban acompañados de alteraciones en proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias y su señalización reguladora aguas arriba, se analizaron lisados hipocampales de cada grupo mediante Western bloting. En comparación con el grupo control, los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron una reducción notable en la expresión de Gefirina hipocampal, mientras que los niveles de Gefirina fosforilada aumentaron (Figura 3A). El tratamiento con triptolido restauró parcialmente la expresión total de Gefirina y redujo los niveles fosforilados de Gefirina. En cambio, LY294002 cotratamiento debilitó el efecto del triptolido, como se demostró en la reducción de la expresión de Gefirina y el aumento de Gefirina fosforilada en comparación con el grupo tratado con triptoluro. Estos resultados sugieren que la patología inducida por Aβ1-42 se asoció no solo con una disminución de la abundancia de Gefirina en el hipocampo, sino también con una fosforilación aumentada de Gefirina, mientras que el triptolido revirtió parcialmente estas alteraciones.

La colibistina mostró un patrón de expresión similar al de la Gefirina total. Los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron una disminución en la expresión de collibistina hipocampal en comparación con los ratones control, mientras que el tratamiento con triptolido restauró la expresión de collibistina. LY294002 cotratamiento revirtió parcialmente este efecto (Figura 3B). Estos hallazgos indican que el triptolido preservó la expresión de proteínas de andamiaje asociadas a la sinapsis inhibitorias en el hipocampo, y este efecto fue atenuado por la inhibición de PI3K. Posteriormente se examinó la vía de señalización PI3K/Akt/GSK-3β para dilucidar aún más los cambios moleculares subyacentes a la fosforilación de la Gefirina. En el grupo modelo tipo AD inducido por Aβ1-42, la expresión de PI3K y la relación p-Akt/Akt se redujeron en comparación con el grupo de control, lo que indica una actividad de señalización PI3K/Akt deteriorada (Figura 3B). La relación p-GSK-3β/GSK-3β también se redujo en el grupo de modelos. Dado que la fosforilación de GSK-3β en el sitio inhibitorio refleja la supresión de la actividad de GSK-3β, esta reducción sugiere un aumento relativamente mayor de la actividad de GSK-3β en el hipocampo similar a la EA inducido por Aβ1-42. El tratamiento con triptolido aumentó la expresión de PI3K, restauró la relación p-Akt/Akt y elevó la relación p-GSK-3β/GSK-3β. Estos efectos se debilitaron con LY294002 co-tratamiento.

En conjunto, estos resultados sugieren que la patología similar al EA inducida por Aβ1-42 se asoció con una reducción de la expresión hipocampal de Gephyrina y Collybistina, un aumento de la fosforilación de Gephyrina y una fosforilación inhibitoria deficiente de GSK-3β mediada por PI3K/Akt. El triptolido revirtió parcialmente estos cambios moleculares, mientras que LY294002 atenuó los efectos del triptolido, apoyando la implicación de la señalización PI3K/Akt/GSK-3β en la regulación de la Gefirina y la Colibitina hipocampales en este modelo.

El triptolido atenuó anormalidades proteicas relacionadas con la autofagia en el hipocampo de ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42

Para determinar si la patología tipo AD inducida por Aβ1-42 y el tratamiento con triptolido estaban asociados con cambios en proteínas relacionadas con la autofagia, se examinaron la expresión de LC3 y p62 en lisados hipocampales mediante Western bloting. En comparación con el grupo de control, los ratones tipo AD inducidos por Aβ1-42 mostraron una mayor proporción LC3-II/I, lo que indica una mayor acumulación de LC3-II asociada a los autofagosomas. Paralelamente, la expresión de p62 también se elevó en el grupo modelo, lo que sugiere acumulación de sustratos relacionados con la autofagia en el hipocampo. El tratamiento con triptolido redujo tanto la relación LC3-II/I como la expresión de p62 en comparación con el grupo modelo tipo EA inducido por Aβ1-42. Estos resultados indican que el triptolido atenuó la acumulación anormal de proteínas relacionadas con la autofagia inducidas por Aβ1-42. En contraste, LY294002 cotratamiento aumentó la relación LC3-II/I y la expresión de p62 en comparación con el tratamiento solo con triptolido, lo que sugiere que la inhibición de PI3K atenuó el efecto del triptolido sobre los cambios proteicos relacionados con la autofagia (Figura 4).

En general, el grupo control proporcionó el perfil conductual, histológico y molecular de base, mientras que el grupo modelo tipo EA inducido por Aβ1-42 confirmó que la administración intracerebroventricular de Aβ1-42 produjo deterioro cognitivo, lesión neuronal hipocampal, deposición de Aβ, reducción de proteínas asociadas a sinapsis inhibitorias, cambios en la señalización PI3K/Akt/GSK-3β y acumulación de proteínas relacionadas con la autofagia. La comparación entre el grupo modelo inducido por Aβ1-42 y el grupo tratado con triptolido mostró que el triptolido revirtió parcialmente estas anomalías. La comparación entre el grupo tratado con triptolido y el grupo de cotratamiento LY294002 más triptolido mostró además que la inhibición de PI3K atenuaba los efectos del triptolido. Estos resultados apoyan la hipótesis de trabajo de que el triptolido modula los cambios en la Gefirina, la colibistina y proteínas relacionadas con la autofagia del hipocampo en un modelo similar al AD inducido por Aβ1-42 mediante un mecanismo asociado a PI3K/Akt/GSK-3β.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Todos los datos en bruto necesarios para reproducir los hallazgos de este estudio se proporcionan como Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2. Estos incluyen las imágenes originales de western blot y gel, datos de blot sin recortar, valores numéricos en bruto utilizados para análisis estadísticos y los gráficos generados. (Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2) Estos archivos proporcionan los datos en bruto que respaldan los resultados cuantitativos reportados en las Figuras 1–4.

Figura 1: El triptolido mejoró parcialmente el aprendizaje espacial y los déficits de memoria en ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42. (A) Latencia de escape durante la fase de navegación por lugares de 6 días del laberinto acuático Morris. (B) Trayectorias representativas de nado durante la prueba de sonda. (C) Número de cruces sobre la ubicación original del andén tras la retirada del andén. (D) Porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante objetivo durante la prueba de sonda. Los datos se presentan como media ± SD. La latencia de escape se analizó mediante medidas repetidas bidireccionales ANOVA, y los datos de los ensayos de sonda se analizaron mediante una prueba ANOVA unidireccional. Ctr, grupo de control; AD, grupo de modelos tipo AD inducido por Aβ1-42; TP, grupo tratado con triptolido; Grupo de cotratamiento LY, LY294002 más triptolida. n = 6 por grupo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Lesión neuronal del hipocampo atenuada por triptolido y deposición de Aβ en ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42. (A) Imágenes representativas de coloración de hematoxilina y eosina de secciones del hipocampo de cada grupo. Barra de escala = 50μm. (B) Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica Aβ y análisis cuantitativo de la deposición Aβ-positiva en el hipocampo. Barra de escala = 50μm. Los datos se presentan como media ± SD. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA unidireccional. Ctr, grupo de control; AD, grupo de modelos tipo AD inducido por Aβ1-42; TP, grupo tratado con triptolido; Grupo de cotratamiento LY, LY294002 más triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: El triptolido restauró la expresión hipocampal de Gephyrina y Collybistina y moduló la señalización asociada a PI3K/Akt/GSK-3β en ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42. (A) Imágenes representativas de Western blot y análisis cuantitativo de la expresión total de Gefirina y Gefirina fosforilada en lisados hipocampales de cada grupo. (B) Imágenes representativas de Western blot y análisis cuantitativo de colibistina, PI3K, Akt, Akt fosforilado, GSK-3β y GSK-3β fosforilado en lisados hipocampales. La colibistina y la PI3K se normalizaron a β-actina. Los Akt fosforilados y GSK-3β fosforilados se cuantificaron en proporciones p-Akt/Akt y p-GSK-3β/GSK-3β, respectivamente. Los datos se presentan como media ± SD. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA unidireccional. Ctr, grupo de control; AD, grupo de modelos tipo AD inducido por Aβ1-42; TP, grupo tratado con triptolido; Grupo de cotratamiento LY, LY294002 más triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: El triptolido atenuó las anomalías proteicas relacionadas con la autofagia en el hipocampo de ratones similares a la EA inducidos por Aβ1-42. Imágenes representativas de Western blot y análisis cuantitativo de la expresión de LC3-I/II y p62 en lisados del hipocampo de cada grupo. La relación LC3-II/I se calculó dividiendo la intensidad de la banda LC3-II por la intensidad de la banda LC3-I, y la expresión de p62 se normalizó a β-actina. Los datos se presentan como media ± SD. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA unidireccional. Ctr, grupo de control; AD, grupo de modelos tipo AD inducido por Aβ1-42; TP, grupo tratado con triptolido; Grupo de cotratamiento LY, LY294002 más triptolida. n = 3 por grupo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Imágenes de manchas occidentales sin recortar. Se indican las bandas utilizadas para la cuantificación y se muestran marcadores de peso molecular cuando están disponibles. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Valores numéricos en bruto utilizados para análisis estadísticos en este artículo. Este archivo contiene los conjuntos de datos numéricos en bruto utilizados para generar los gráficos cuantitativos de las Figuras 1–4, incluyendo mediciones de comportamiento del laberinto de agua Morris, cuantificación inmunohistoquímica Aβ y valores de densitometría de Western blot. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La propuesta mecanicista central de este estudio es que la patología inducida por Aβ1-42 suprime la señalización PI3K/Akt, reduce la fosforilación inhibitoria de GSK-3β, promueve la fosforilación de la Gefirina, disminuye la expresión de Gefirina y Colibistina en el hipocampo y contribuye a la acumulación de proteínas relacionadas con la autofagia, mientras que el triptolido contrarresta parcialmente estos cambios mediante una vía asociada a PI3K/Akt/GSK-3β. Este estudio muestra que la patología similar a la EA inducida por Aβ1-42 va acompañada de deterioro del aprendizaje espacial y la memoria, lesión neuronal hipocampal, aumento de la deposición de Aβ, reducción de la expresión de Gefirina y Colibistina, aumento de la fosforilación de Gefirina, alteración de la señalización PI3K/Akt/GSK-3β y acumulación de proteínas relacionadas con la autofagia. El triptolido revirtió parcialmente estas anomalías conductuales, histológicas y moleculares, mientras que LY294002 atenuó sus efectos. Estos hallazgos apoyan un modelo en el que el triptolido protege las proteínas asociadas a la sinapsi inhibitoria del hipocampo, al menos en parte, mediante la regulación mediada por PI3K/Akt/GSK-3β de la fosforilación de la Gefirina y los cambios en proteínas relacionadas con la autofagia. Cabe señalar que el modelo de inyección intracerebroventricular Aβ1-42 refleja principalmente neurotoxicidad inducida por Aβ y patologías similares a la EA, más que la progresión crónica y multifactorial completa de la AD^{humana 21}.

La gefirina y la colibistina son componentes centrales de la organización sináptica inhibitoria. La Gefirina ancla los receptores inhibidores de neurotransmisores en los sitios postsinápticos, mientras que la colibistina favorece el agrupamiento y la localización de membrana. Por tanto, la reducción de la expresión de estas proteínas puede alterar la estabilidad sináptica inhibitoria y contribuir a una función de la red hipocampal^{deteriorada 8}. En este estudio, Aβ1-42 redujo la expresión de Gefirina y Collybistina en hipocampo, mientras que el triptolido restauró ambas proteínas. El aumento de la Gefirina fosforilada proporciona un mecanismo plausible para la pérdida de Gefirina, ya que la fosforilación en Ser270 se ha relacionado con la dispersión de Gefirina, la reducción del agrupamiento y la desestabilización de proteínas. La reducción paralela en la expresión de PI3K, la fosforilación de Akt y la fosforilación inhibitoria de GSK-3β sugiere que Aβ1-42 debilita la señalización de PI3K/Akt y puede aumentar la actividad de GSK-3β, lo cual es consistente con una mayor fosforilación de Gephyrin. Por el contrario, el triptolido restauró la fosforilación de Akt, aumentó la fosforilación inhibitoria de GSK-3β y redujo la fosforilación de la Gefirina, mientras que LY294002 debilitó estos efectos. Estos resultados sugieren que el triptolido puede preservar la expresión de Gefirina y Collybistina mediante la regulación asociada a PI3K/Akt/GSK-3β de la fosforilación de Gefirina. Sin embargo, dado que se utilizaron lisados completos del hipocampo, estos hallazgos reflejan cambios en la abundancia y fosforilación de proteínas del hipocampo en lugar de evidencia directa de localización^{sináptica 22,23}.

Las anomalías relacionadas con la autofagia también pueden contribuir a los cambios moleculares observados en este modelo. La autofagia es importante para la proteostasis neuronal, pero una degradación autofágica deteriorada en la EA puede conducir a la acumulación de autofagosomas y sustratos proteicos^{patológicos 24,25}. En el presente estudio, Aβ1-42 aumentó tanto la relación LC3-II/I como la expresión de p62, lo que sugiere acumulación de LC3-II asociada a autofagosomas y sustratos relacionados con la autofagia. El triptolido redujo ambos marcadores, mientras que LY294002 revirtió parcialmente este efecto, lo que sugiere que el triptolido puede aliviar la acumulación de proteínas relacionadas con la autofagia mediante un mecanismo dependiente de PI3K/Akt. Junto con los cambios en la señalización de Gefirina, Colibistina y PI3K/Akt/GSK-3β, estos hallazgos amplían la comprensión de los efectos neuroprotectores del triptoluro más allá de las acciones antiinflamatorias o neuroprotectoras generales, sugiriendo que el triptolido también puede influir en proteínas de andamiaje asociadas a sinapsis inhibitorias, señalización quinasa y vías relacionadas con la proteostasis en patologías similares a la EA^{asociadas a Aβ 26}.

Varios pasos críticos determinan el éxito y la reproducibilidad de este protocolo. En primer lugar, el estado de agregación de Aβ1-42 debe controlarse y verificarse cuidadosamente antes de la inyección, ya que la preparación de péptidos puede influir fuertemente en los resultados patológicos. En segundo lugar, es esencial una inyección estereotáxica precisa en los ventrículos laterales; el reflujo, la colocación incorrecta de la aguja o la velocidad excesiva de inyección pueden resultar en una exposición variable a Aβ y resultados conductuales o histológicos inconsistentes. En tercer lugar, las pruebas en laberinto acuático Morris requieren señales visuales estables, temperatura del agua constante y monitorización de la velocidad de nado para descartar la discapacidad motora como factor de confusión. En cuarto lugar, la cuantificación histológica e inmunohistoquímica debe realizarse utilizando regiones de interés hipocampales predefinidas y análisis ciegos. Finalmente, los resultados del Western blot dependen de una carga proteica igual, concentración adecuada en gel, transferencia eficiente y el uso de imágenes de blot sin recortar para confirmar la especificidad de la banda.

Deben considerarse varias limitaciones. En primer lugar, el modelo de inyección Aβ1-42 no reproduce la progresión crónica, la patología tau, los cambios vasculares ni la complejidad neuroinmune de la EA humana. En segundo lugar, aunque ratones machos y hembras estaban distribuidos de manera uniforme entre grupos, el estudio no fue potenciado para un análisis estratificado^{por sexo 27}. En tercer lugar, los lisados completos del hipocampo no pueden determinar si los cambios en la Gephyrina y la Colibitina ocurren específicamente en las sinapsis inhibitorias. Cuarto, el mecanismo propuesto PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrina sigue siendo asociativo, porque la actividad de GSK-3β y la fosforilación de Gephyrin Ser270 no fueron manipuladas directamente. Finalmente, LC3-II/I y p62 son lecturas estáticas de Western blot y no pueden definir completamente el flujo autofágico dinámico. Los estudios futuros deberían utilizar fraccionamiento sinaptósomico, colocalización inmunofluorescente con marcadores postsinápticos inhibitorios, enfoques de ganancia o pérdida de función con GSK-3β, constructos mutantes Gephyrin Ser270 y ensayos de flujo basados en inhibidores lisosomales. También será necesaria validación en modelos transgénicos crónicos de EA, modelos relacionados con tau y sistemas neuronales derivados de humanos para determinar si esta vía es ampliamente relevante para la patología del^{EA 14}. Otra limitación es que el estado de agregación de la preparación exacta de Aβ1-42 utilizada para la inyección estereotáxica no fue validado de forma independiente por fluorescencia de tioflavina T, SDS-PAGE/Western blot o microscopía electrónica de transmisión. Aunque el péptido fue preparado mediante un procedimiento prolongado de incubación a 37 °C, comúnmente utilizado para promover la agregación de Aβ1-42, la variación de lote a lote en el estado de agregación puede afectar a los resultados patológicos. Futuros estudios deberían validar este flujo de trabajo en modelos transgénicos crónicos de EA, modelos relacionados con tau y sistemas neuronales de origen humano. Experimentos adicionales deben incluir la validación directa del estado de agregación de Aβ1-42, evaluación de la precisión de la inyección estereotáxica mediante verificación anatómica o con colorantes, fraccionamiento sinaptosomal, colocalización inmunofluorescente con marcadores postsinápticos inhibidores, enfoques de ganancia o pérdida de función de GSK-3β, experimentos con mutantes Gephyrin Ser270 y ensayos de flujo autofágico basados en inhibidores lisosomales. También se necesitan estudios de dosis-respuesta y seguridad del triptolido antes de considerar aplicaciones traslacionales

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de Gephyrin total.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de Gephyrin fosforilada.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de Akt total.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de Akt fosforilado.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de GSK-3β total.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de GSK-3β fosforilada.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Anticuerpo de control de carga para la normalización por Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de LC3-I y LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Anticuerpo primario para la detección por Western blot de p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Anticuerpo primario para detectar Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Anticuerpo secundario para anticuerpos primarios de ratón en Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Anticuerpo secundario para anticuerpos primarios de conejo en Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Anticuerpo primario para la inmunohistoquímica de Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Péptido amiloid-β utilizado para preparar la solución de inyección inductora de agregación.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Compuesto de prueba administrado intraperitonealmente.
LY294002	ab120243	abcam	Inhibidor de PI3K utilizado para el grupo de co-tratamiento.
paraformaldehído	P0099	Beyotime	Fijador para perfusión transcardial y post-fijación de tejido.
xileno	108298	Merck	Reactivo de desparafinización y aclarado de tejido.
etanol	100983	Merck	Reactivo de rehidratación y deshidratación para secciones de parafina.
propilenglicol	294004	Merck	Componente del vehículo para la preparación de la solución del fármaco.
inhibidores de proteasa y fosfatasa	P1045	Beyotime	Aditivo del tampón de lisis utilizado para preservar proteínas y estados de fosforilación.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Tampon de lisis para la extracción de proteína total del tejido hipocampal.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Tampon de recuperación de antígeno por calor para inmunohistoquímica.
pentobarbital sódico	P3761	Sigma	Anestésico utilizado para cirugía y recolección de tejido.
suero de cabra	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Reactivo de bloqueo para inmunohistoquímica.
membranas PVDF	ISEQ00010	Merck Millipore	Membrana utilizada para la transferencia Western blot.
laberinto acuático de Morris	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Aparato conductual y sistema de seguimiento por video para la evaluación del aprendizaje espacial y la memoria.
sistema de imagen por quimioluminiscencia	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Sistema de imagen para la adquisición de señales Western blot quimioluminiscentes.
aparato estereotáxico	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Aparato utilizado para inyección intraventricular estereotáxica.
kit de ensayo de proteína BCA	P0006	Beyotime	Kit de ensayo colorimétrico para la medición de la concentración de proteína total.
lector de microplacas	Synergy2	Biotek	Lector de absorbancia utilizado para la medición del ensayo BCA.
ImageJ	versión 9.0.1	National Institutes of Health	Software de análisis de imágenes para histología, inmunohistoquímica y densitometría Western blot.
GraphPad Prism	versión 8.5	GraphPad Software	Software de análisis estadístico y generación de gráficos.