Artículo de investigación

Establecimiento de cultivos primarios enriquecidos en zonas a partir de la corteza suprarrenal del ratón

DOI:

10.3791/70403

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8 de mayo de 2026

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

En este artículo

Resumen

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Se desarrolló un enfoque robusto y reproducible para establecer cultivos primarios 2D de células enriquecidas en zona glomerulosa y zona fasciculata para la corteza suprarrenal del ratón. Este sistema preserva características moleculares y funcionales clave de cada zona, permitiendo una investigación enfocada de las vías de señalización, la producción hormonal y el comportamiento de las células corticales suprarrenales ex vivo.

Resumen

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La glándula suprarrenal del ratón está encapsulada por una capa celular mesenquimata (cápsula) y contiene una corteza subyacente organizada en zonas concéntricas distintas con funciones endocrinas especializadas: la zona glomerulosa (zG), que produce aldosterona, y la zona fasciculada (zF), que produce corticosterona. La médula suprarrenal, situada en el centro de la glándula, produce catecolaminas. Los estudios mecanicistas de células de cada zona adrenocortical han estado limitados por la ausencia de modelos in vitro que preserven sus características moleculares, celulares y funcionales específicas de zona. Para superar esta limitación, se desarrolló un enfoque de fraccionamiento utilizando microdisección de glándulas suprarrenales de ratón adulto. Este método separa las células suprarrenales de ratones machos en una fracción externa enriquecida con zG (OF), que contiene células cápsula y zG, y una fracción interna enriquecida con zF (FI), que contiene células zF y medulares. Estas fracciones se utilizaron para generar cultivos primarios bidimensionales (2D) enriquecidos para células zG o zF. El análisis de expresión génica confirmó que los cultivos enriquecidos con zG expresan altos niveles de marcadores zG (Cyp11b2, Dab2 y Shh), junto con un aumento de marcadores de vía Wnt/β-catenina (Wnt4, Lef1). En cambio, los cultivos enriquecidos con zF mostraron una mayor expresión de marcadores zF (Cyp11b1 y Akr1b7) y niveles más bajos de marcadores de vía Wnt/β-catenina, consistentes con una firma transcripcional zF. La expresión de marcadores esteroidogénicos (Nr5a1, Star) validó el origen adrenocortical de ambas fracciones celulares. La tirosina hidroxilasa indica la presencia de células medulares suprarrenales en cultivos enriquecidos con zF. Funcionalmente, los cultivos enriquecidos con zG produjeron aldosterona bajo condiciones basales y mostraron un aumento en la producción en respuesta a la angiotensina II, potasio y hormona adrenocorticotrópica (ACTH). Por el contrario, los cultivos enriquecidos con zF produjeron corticosterona al inicio y mostraron un aumento en la producción en respuesta a la estimulación de ACTH. En conjunto, este protocolo representa un modelo in vitro robusto, reproducible y biológicamente relevante para estudiar la biología de la corteza suprarrenal. Este sistema permite la investigación específica de zonas de vías de señalización, mecanismos moleculares y respuestas fisiológicas.

Introducción

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Una cápsula mesenquimatosa delgada encapsula la glándula suprarrenal del ratón, que consta de dos compartimentos principales: la corteza externa y la médula interna. La corteza suprarrenal del ratón macho adulto se divide además en zonas distintas, la zona glomerulosa (zG) y la zona fasciculada (zF), cada una con características morfológicas y funcionalesúnicas 1,2,3,4. La función principal de la corteza suprarrenal es la producción de hormonas esteroides, incluyendo mineralocorticoides (aldosterona) y glucocorticoides (corticosterona en ratones)5. El zG es la región más externa y compacta y está formado por células ovoides organizadas en estructuras de rosetas que expresan la aldosterona sintasa (CYP11B2), permitiendo la producción de aldosterona 2,3,5,6,7. La secreción de aldosterona está regulada principalmente por el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), el potasio y, en menor medida, ACTH 5,8. El zF está compuesto por células más grandes dispuestas en cordones radiales/fascículos, constituye la mayor parte (~85%) de la corteza y está regulado principalmente por ACTH 2,3,5,9. Múltiples vías de señalización orquestan el desarrollo, mantenimiento y función de las glándulas suprarrenales regulando la dinámica de las células progenitoras, la zonación y la actividad esteroidogénica. Entre ellas, SF-1 (Factor Esteroidogénico-1, Nr5a1) es un regulador maestro esencial para la especificación adrenocortical, la proliferación y la producción dehormonas 10. La señalización sonic hedgehog (Shh), activa en el zG, promueve la expansión de las células progenitoras y favorece la renovación cortical en elzG 11,12,13.

La señalización Wnt, especialmente a través de la vía canónica β-catenina, es crucial para la zonación suprarrenal y la integridad cortical. En el ratón, el tamaño adrenocortical normal y la zonación están regulados por un gradiente de actividad de señalización WNT que se extiende desde la cápsula hasta la zF. Este gradiente está respaldado por la expresión localizada de ligandos y potenciadores WNT, principalmente WNT4 en el zG, y WNT2B y R-espondinas (RSPO1 y/o RSPO3) en la cápsula 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . La corteza suprarrenal se mantiene mediante el flujo centrípeto de células progenitoras proliferativas situadas en la región subcapsular/externa de zG, que dan lugar a células zG diferenciadas que migran hacia el interior hacia el zF. A medida que las células pasan del zG al zF, experimentan cambios en la expresión y función génica conocidos como transdiferenciación. Este modelo ha sido fuertemente respaldado por estudios de rastreo de linaje utilizando la línea transgénica de ratonesAS Cre/+, que se dirige específicamente a las células productoras de aldosterona en el zG 23,24,25.

Se han utilizado varios enfoques in vitro para estudiar la biología suprarrenal basándose en la disociación de toda la glándula suprarrenal 26,27,28. Por ejemplo, un estudio describió la disociación de la corteza suprarrenal para análisis electrofisiológicos ypatch-clamp 27, y otro estudio empleó células corticales suprarrenales disociadas para investigar mecanismos de señalización relacionados con la fisiología suprarrenal y la regulación de la presiónarterial 26. Aunque estas metodologías han proporcionado importantes conocimientos funcionales, se basan en células de preparaciones suprarrenales completas en lugar de en la separación de zonas corticales antes del cultivo celular.

Dada la complejidad y diversidad histológica de la glándula suprarrenal, comprender los roles distintos de sus compartimentos celulares es esencial para esclarecer los mecanismos subyacentes a la función suprarrenal. En este estudio se establecieron cultivos celulares adrenocorticales primarios de ratón enriquecidos para células zG o zF. Una gran ventaja de este método es la generación de cultivos celulares enriquecidos con zG, lo que permite la modulación experimental de vías de señalización y factores ambientales para investigar mejor su papel específico en la biología de la corteza suprarrenal. Esto incluye el estudio del mantenimiento de las células progenitoras, los mecanismos subyacentes a la plasticidad zonal y la transdiferenciación hacia el zF, y la modelización de la composición de la matriz extracelular. Paralelamente, este método genera cultivos de células zF altamente enriquecidas, proporcionando una plataforma complementaria para estudios funcionales y de señalización específicos de zonas. En conjunto, estas características proporcionan un sistema robusto y controlado experimentalmente para avanzar en la comprensión de la biología suprarrenal.

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Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo conforme a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales del Hospital Infantil de Boston (IACUC) bajo el número de aprobación 00002611. Una lista completa de todos los materiales utilizados en este protocolo, incluyendo reactivos, consumibles y equipos, se proporciona en la Tabla de Materiales, junto con los fabricantes correspondientes y números de catálogo para garantizar la reproducibilidad.

Cultivos primarios de células de zona glárrejola suprarrenal de ratón y de zona fasciculada
Los métodos utilizados para establecer cultivos primarios de ratones machos adultos de células adrenocorticales tipo salvaje (Mus musculus, C57BL/6) en este estudio se adaptaron de un procedimiento desarrollado originalmente para ratasSprague-Dawley 28. Para confirmar la segregación e identidad de las poblaciones celulares de zona glomerulosa y zona fasciculata, se empleó un modelo de trazo de linaje utilizando ratones Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (también conocidos como Cre) 1,2,3,4 y ratones Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (también conocidos como ROSAmT/mG)29.

Preparación antes del procedimiento
Materiales
Dos juegos de pinzas y tijeras para incisiones superficiales y otro juego para la incisión de la cavidad abdominal (Figura suplementaria 1A). Calentó el medio de cultivo y el PBS (37 °C). Preparé 2 platos (P60) con DMEM/F-12. Se preparaban 3 platos (P60) con PBS calentado para lavar las glándulas en secuencia (baños 1, 2 y 3) (Figuras suplementarias 1B, 1–3), y 1 plato para mantener la suprarrenal en solución (Figuras suplementarias 1B, 4). Se prepararon 2 platos (P60) con papel filtro estéril en la superficie (Figuras suplementarias 1C, 1–2). Se prepararon 2 platos de P60 con 500 μL de solución digestiva y los etiquetamos para la glomerulosa (zG) o la fasciculada (zF) (Figuras suplementarias 1D, zG, zF). Preparé 2 tubos, etiquetados zG y zF, y añadió 4,5 mL de solución digestiva.

Soluciones
Para preparar la solución digestiva, se disolvieron colagnasas tipo I (concentración final 4 mg/mL) y DNasa I (concentración final 0,04 mg/mL) en 5 mL de medio puro DMEM/F-12. Filtré la solución en un tubo de 50 mL usando una jeringuilla y un filtro de 0,22 μM. La solución digestiva debe prepararse fresca cada vez.

Animales
Para obtener cultivos primarios enriquecidos para células de zona suprarrenal glomerulosa y zona fasciculada de ratón, se utilizan entre 10 y 15 ratones machos adultos jóvenes, de aproximadamente 6 a 7 semanas de edad. Las hembras tienen glándulas suprarrenales ligeramente más grandes que los hombres, y cualquiera de los dos sexos puede usarse con este protocolo. Sin embargo, en este estudio solo se utilizaron machos para evitar posibles interferencias de la zona X presente en las hembras jóvenes, asegurando una separación zonal precisa. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO₂ conforme a las directrices institucionales de cuidado animal. La muerte se confirmó por la ausencia de respiración y la falta de respuesta refleja. Las glándulas suprarrenales se diseccionaron inmediatamente, entre 3 y 5 minutos tras la confirmación de la muerte, para preservar la viabilidad del tejido.

Posición y exposición del abdomen
El ratón fue colocado en una posición de decúbito dorsal sobre una superficie plana y estéril (Figura 1A). El pelaje del animal fue desinfectado con un 70% de alcohol. Se usaron pinzas y tijeras para las incisiones cutáneas, y el segundo juego para la incisión de la cavidad abdominal. Se realizó una incisión inicial en la región inguinal del abdomen, que se extendía lateralmente hacia el tórax a ambos lados para exponer el peritoneo (Figura 1B). La piel se retraía cuidadosamente, seguida por la musculatura abdominal, para exponer la cavidad abdominal (Figura 1C). La incisión inicial debe ser superficial para evitar daños en los órganos internos. Avanza hacia la capa muscular con una incisión cautelosa y luego expone la cavidad abdominal. Evita la rotura de los vasos sanguíneos, ya que el sangrado puede dificultar la localización de las glándulas suprarrenales y retrasar la recogida. Cambia los instrumentos quirúrgicos para minimizar la contaminación microbiana.

Identificación y recogida de la glándula suprarrenal izquierda
La glándula suprarrenal izquierda se encuentra medialmente y por encima del riñón izquierdo en el retroperitoneo, con forma ovalada y coloración rosa, rodeada de tejido adiposo blanco (Figuras 1D–G). Mientras desplazas cuidadosamente los órganos adyacentes con pinzas romas para mejorar la visualización, utiliza tijeras para extraer la mayor parte del tejido adiposo mediante cortes cortos y controlados, aislando la glándula suprarrenal. Evita agarrar directamente la glándula suprarrenal para evitar daños en su cápsula. La glándula se colocó inmediatamente después del aislamiento en una placa de cultivo P60 con 10 mL de DMEM/F-12 precalentado a 37 °C (Figura 1F).

Identificación y recogida de la glándula suprarrenal derecha
La glándula suprarrenal derecha se encuentra lateralmente y por encima del riñón derecho en el retroperitoneo, con forma ovalada y coloración rosada (Figuras 1E–H). Identificar esta glándula suprarrenal puede ser más complicado debido a su proximidad a otros órganos, como el hígado y el colon ascendente, así como a los vasos sanguíneos cercanos. Mientras desplazas cuidadosamente los órganos adyacentes con pinzas romas para mejorar la visualización, utiliza tijeras para eliminar la mayor parte del tejido adiposo mediante cortes cortos y controlados, aislando la glándula suprarrenal y teniendo cuidado de no dañar la cápsula. La glándula se colocó inmediatamente después del aislamiento en una placa de cultivo P60 con 10 mL de DMEM/F-12 precalentado a 37 °C. Las glándulas suprarrenales se combinan en el mismo recipiente (Figura 1F). Durante el procedimiento, es fundamental manipular con cuidado los principales vasos sanguíneos de la zona para evitar cortes accidentales, que pueden causar sangrado y complicar el proceso de recogida. Los principales vasos de los que hay que tener cuidado incluyen las venas renales y las arterias renales. Recogieron la glándula suprarrenal junto con algo de tejido adiposo adherente. Esto facilita el manejo de la glándula y protege contra daños y contaminación de la cápsula (Figura 1I).

Trabajo en una campana de flujo laminar estéril
Antes de transferir las glándulas a la campana laminar, el plato se limpiaba con alcohol al 70%. Las glándulas suprarrenales se lavaron con PBS tres veces a temperatura ambiente (25 °C) (en los platos 1, 2 y 3 y se recogieron en el plato 4) (Figura suplementaria 1B). El papel filtro ayuda a adherir la grasa y garantiza mejores resultados. Durante la preparación de múltiples glándulas, los tejidos separados deben mantenerse en DMEM precalentado para preservar la viabilidad. La glándula suprarrenal fue agarrada por el tejido adiposo adherente (Figuras 1I–J), y la grasa se disecó cuidadosamente sobre el papel filtro (Figura suplementaria 1C, plato 1), utilizando pinzas finas y movimientos controlados para evitar dañar la cápsula. El resultado esperado es una glándula lisa e intacta, libre de exceso de tejido adiposo y conectivo, como se muestra en la Figura 1K. Las glándulas suprarrenales se transfirieron cuidadosamente a papel de filtro nuevo (Figura suplementaria 1C, plato 2) para facilitar una microdisección precisa. La cápsula se pellizcó suavemente con pinzas finas y, usando la hoja del bisturí, se realizó una incisión radial en la glándula sin cortar completamente el tejido.

El contenido interno de la corteza quedó suavemente expuesto al expulsarlo hacia fuera a través de la incisión mediante la aplicación de una ligera presión mecánica con las pinzas. La cápsula y el zG permanecieron conectados a la punta de las pinzas, mientras que el material glandular expulsado internamente correspondía al zF y la médula. La digestión enzimática debe iniciarse solo después de que todas las glándulas hayan sido procesadas (Figura 1L), debido a la separación mecánica de las zonas externa e interna.

Digestión
Dos tubos se etiquetaron como OF (Fracción Externa: cápsula y zG) o IF (Fracción interna: zF y médula) (Figura 1M). Se añadieron un total de 4,5 mL de solución digertiva precalentada (37 °C), y el OF y el IF se transfirieron a los tubos correspondientes. Las muestras se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂ durante 30 minutos, y los tubos se giraron suavemente cada 10 minutos, invirtiéndolos manualmente 2–3 veces para asegurar una exposición uniforme a la solución enzimática. El tiempo necesario para la digestión puede variar en función de la calidad, actividad y condiciones de almacenamiento de la colagenasa. Tras 30 minutos, el tejido se disociaba pipeteando arriba y abajo 40 veces con movimientos lentos y controlados, utilizando una pipeta sorológica de 5 mL para generar una suspensión unicelular. Tras la disociación del tejido, idealmente, no deberían quedar fragmentos visibles y el medio debería parecer turbio. Si aún hay fragmentos, se puede considerar una digestión adicional de 15 minutos.

Lavado y chapado
Tras la digestión, las células se lavaron añadiendo 45 mL de DMEM/F-12 para eliminar la enzima residual (Figura 1 M). Las muestras se centrifugaron a 150 × g durante 12 minutos a temperatura ambiente (25 °C). Tras la centrifugación, se espera un perdigón pequeño y compacto con un aspecto ligeramente rosado a amarillo pálido, mientras que el sobrenadante debe permanecer claro y libre de partículas visibles. El sobrenadante fue retirado y descartado con cuidado, cuidando de no alterar la bola. El pellet se resuspendió en un medio de cultivo precalentado (37 °C) según el volumen final requerido para el chapado (véase más abajo). Se mantuvo una densidad óptima de armadura de aproximadamente el 70% para garantizar la viabilidad y vigor del cultivo. El número de células se estimó utilizando una cámara de conteo de Neubauer antes del placado, y el número de células sembradas se ajustó según el área del plato de cultivo para lograr la confluencia deseada. Placar las células de fracción externa enriquecida con zG (OF) a una densidad de aproximadamente un animal por pozo (típicamente produciendo ~1,5–2,5 × 104 celdas) y las celdas de fracción interna enriquecida con zF a ~0,63 animales por pozo (típicamente produciendo ~2,5–4,0 × 104 células) en una placa de 48 pozos.

Mantenimiento de cultivos celulares
Las células se cultivaron en el Medio de Cultivo descrito anteriormente y se mantuvieron bajo condiciones estándar en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂. Tras 24 horas de cultivo, se reemplazó el medio para eliminar los restos y cualquier célula sanguínea residual. Este paso promueve un crecimiento óptimo. La placa se aspiraba cuidadosamente y se añadía medio fresco precalentado (37 °C). Espera al menos 48 horas antes de evaluar las células en experimentos funcionales. Se recomienda esperar tres días antes de realizar experimentos funcionales para asegurarse de que los cultivos están bien establecidos. Un cultivo prolongado más allá de este periodo puede requerir tripsinización y paso, lo que puede conducir a la selección celular y la pérdida de características primarias del cultivo.

Análisis de datos y procedimientos de apoyo
Preparación de cultivos primarios de células suprarrenales
Se establecieron cultivos primarios de glándulas suprarrenales completas siguiendo los mismos procedimientos para la recogida de tejidos, digestión, lavado y placado, y se utilizaron como controles estándar para ensayos moleculares y funcionales.

Análisis de expresión génica
Para purificar el ARN total de las células OF e FI, las células cultivadas se homogeneizaron en TRIReagent utilizando el kit de ARN, según el protocolo del fabricante. La integridad y concentración de ARN se evaluaron mediante espectrometría. El procesamiento posterior del ARN total implicó la transcripción inversa en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad. El análisis de expresión génica se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando el termociclador. Se usaban duplicados técnicos para controlar la variabilidad. Se utilizaron la mezcla TaqMan Universal PCR Master y los cebadores TaqMan para ratón (Tabla 1). Se seleccionó un valor de umbral de ciclo (CT) dentro del rango de amplificación lineal para cada muestra que se ejecua en duplicado. Fue normalizado por genes de control endógenos β-actina y la proteína ribosómica 18S (Rps18). Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2–ΔΔCt 30. Los datos de tres experimentos diferentes se presentan como media ± desviación estándar (DS). Realizamos tres experimentos independientes.

Estimulación de la secreción de aldosterona y corticosterona en cultivos primarios de ZG y ZF
Se establecieron y mantuvieron cultivos primarios de células de zona glomerulosa (ZG) y zona fasciculada (ZF) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO₂. Aproximadamente 5 × 104 células se colocaron por pozo en una placa de 48 pozos utilizando medio de crecimiento completo. Tras cuatro días de cultivo continuo, las mediciones de secreción basal reflejaron la producción acumulada de hormonas durante este periodo. Para los ensayos de estimulación, se aspiró el medio y las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los factores residuales. Posteriormente, se añadieron 200 μL de medio fresco a cada pozo, y los siguientes ensayos representan secreción aguda estimulada dentro de una ventana de tiempo definida. Para los ensayos de estimulación con aldosterona, el medio de cultivo se suplementó con angiotensina II (Ang II, 10 nM), potasio (K+), como cloruro de potasio (KCl, 10 mM) y ACTH (10 nM). Se utilizó cloruro de sodio (NaCl, 10 mM) como control del vehículo. Para los ensayos de estimulación con corticosterona se siguieron los mismos procedimientos, pero el medio se suplementó con ACTH (10 nM), forskolina (10 μM) o NaCl (10 mM) como control del vehículo. Tras 6 horas de incubación a 37 °C y 5% de CO₂, los supernadantes del cultivo se recogieron y almacenaron a −80 °C para la posterior cuantificación hormonal, como se describióanteriormente, 31. Las células adherentes restantes fueron lisadas para la extracción de proteínas, y los niveles hormonales se normalizaron al contenido total de proteínas del lisato correspondiente.

Extracción de proteínas y normalización de mediciones de aldosterona y corticosterona
La extracción de proteínas se realizó utilizando lisis y tampón de extracción RIPA, suplementados con un cóctel inhibidor de proteasa de 1x stop. Las células se resuspendían pipeteando arriba y abajo 15 veces usando una punta de pipeta P200 y posteriormente se sonicaban con un sonda sonicadora. La concentración de proteínas se determinó con el kit de análisis de proteínas BCA según las instrucciones del fabricante.

Medición de aldosterona mediante radioinmunoensayo (RIA)
La concentración de aldosterona en los supernadores de cultivos celulares se determinó siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se añadieron 50 μL de sobrenadante y 150 μL de 1% de BSA en PBS, junto con 500 μL del trazador radiactivo de aldosterona, a los tubos recubiertos de anticuerpos de aldosterona. Tras la mezcla, los tubos se incubaban a temperatura ambiente (25 °C) durante 18 horas. Luego, se decantó la mezcla de incubación y se contó la radiactividad en los tubos usando un contador auto-gammaCobra II 31. Los niveles de aldosterona se normalizaron a proteína total, como se describió anteriormente.

Medición de corticosterona
Las concentraciones de corticosterona en los supernadadores de cultivos celulares se midieron utilizando un kit competitivo de ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) específico para corticosterona de ratón y ratón, siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de corticosterona se normalizaron a proteína total, como se describió anteriormente, 32.

Inmunotinción
Se realizó inmunofluorescencia tanto en secciones suprarrenales embebidas en parafina como en células cultivadas en cubiertas de vidrio pretratadas recubiertas con poli-L-lisina. Para todas las muestras, se realizó un bloqueo con suero de cabra (NGS) normal al 5% en PBS, y los núcleos se contra-tintorcieron con DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol, 1:1000). Las láminas y las fundas se lavaron tres veces durante 5 minutos cada una, con un 0,1% Tween-20 en PBS entre pasos de incubación. Tras la tinción, las muestras se montaban con Antifade Mountant y se almacenaban en la oscuridad hasta la obtención de imágenes. Secciones de tejido: Las secciones de parafina suprarrenal se desparafinizaron en xileno, luego se enjuagaron a través de una serie graduada de etanol (100%, 95%, 70%) y finalmente se enjuagaron en PBS. La recuperación de antígenos se realizó en el tampón Tris-EDTA (10 mM de base Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9,0) calentando a 95 °C durante 20 minutos. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, las secciones se lavaron en PBS y se bloquearon con un 5% de NGS en PBS durante 1 hora. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos 1:100 en 5% NGS en PBS: anti-Dab2 para ratones, anti-GFP para pollos y anti-RFP para conejos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios (1:300): Alexa Fluor 594 anti-ratón IgG, Alexa Fluor 594 anti-pollo IgY y Alexa Fluor 647 anti-conejo de conejo.

Células cultivadas: Se realizó inmunofluorescencia en las cubiertas cuatro días después del placaje. Las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) precalentado al 4% a 37 °C durante 15 minutos y se lavaron tres veces en PBS. El bloqueo se realizó utilizando un 5% de NGS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los coverslips se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-Dab2 para ratón (1:100 en 5% NGS/PBS), seguidos por Alexa Fluor 488 anti-ratón para cabras (1:500).

Adquisición de imágenes: Se obtuvieron imágenes de campo claro y fluorescencia (mGFP y mTomato) de células cultivadas mediante un sistema de microscopio. La fluorescencia mGFP se capturó usando un conjunto de filtros para fluorescencia verde (excitación: 470 nM, emisión: 525 nM), y la fluorescencia de mTomato se capturó usando un conjunto de filtros para fluorescencia roja (excitación: 585 nM, emisión: 624 nM).

Software y análisis estadístico
Se crearon resúmenes visuales, diagramas esquemáticos y figuras usando Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) y BioRender (https://www.biorender.com), consultados en mayo de 2025. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism versión 10.0. Disponible en: https://www.graphpad.com. Todos los experimentos se realizaron al menos en triplicado y se repitieron de forma independiente para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Para comparar entre dos grupos, se utilizó la prueba t de Student (emparejada o sin pareja, según corresponda). Para comparaciones entre tres o más grupos, se realizó el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc adecuada para identificar diferencias significativas entre grupos. Los resultados se presentan como media ± DS. Se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05.

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Resultados

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Establecimiento y caracterización de cultivos celulares suprarrenales primarios enriquecidos en zonas
Se establecieron con éxito cultivos primarios de células suprarrenales a partir de la OF, enriquecida para células zG, y de la FI, enriquecida para células zF. Imágenes representativas de las células cultivadas se muestran en la Figura 2A (OF–zG) y la Figura 2B (IF–zF). Para evaluar el enriquecimiento de célu...

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Discusión

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En este estudio se presentó un protocolo refinado que genera cultivos primarios de células suprarrenales de ratón enriquecidos para células zG (OF) y zF (IF), que recapitulan fielmente la identidad zonal y la función esteroidogénica de cada zona. Este protocolo debería permitir una investigación detallada de la biología celular y molecular de la corteza suprarrenal en un contexto específico de zona, apoyando el estudio de proteínas, vías de señalización y mecanismos implicados en el desa...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia relacionados con este estudio.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de FAPESP (Fundación de Investigación de São Paulo, Brasil), proyecto número 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), y con el apoyo de 2R01DK123694 (a DTB) y fondos de la División de Endocrinología del Hospital Infantil de Boston (DTB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo cónico (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Estéril
Filtro de jeringa de 0,22 µmMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSFiltración de solución de digestión
Jeringa desechable de 10 mLBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Estéril
Pipeta serológica de 5 mLCorning (Corning, NY, USA)4487Estéril
Pipeta serológica de 10 mLCorning (Corning, NY, USA)4488Estéril
Puntas de pipeta filtradas (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SEstéril
Puntas de pipeta filtradas (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SEstéril
Placa de cultivo P60Corning (Corning, NY, USA)430166Tratamiento para cultivo de tejidos
Placa de 48 pocillosCorning (Corning, NY, USA)3527Tratamiento para cultivo de tejidos
Papel filtro estérilN/AN/ARemoción de grasa y soporte de disección
Medio DMEM/F-12Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)11320033Formulación 1:1
Suero bovino fetal (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Inactivado por calor
Suplemento ITSGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
Suplemento GlutaMAXGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicilina-Estreptomicina (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiótico
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7.4
Colagenasa Tipo IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Digestión de tejido
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Digestión de tejido
Angiotensina II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Estimulación hormonal
Hormona adrenocorticotrópica (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Estimulación hormonal
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886Estimulación de cAMP
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Estimulación de aldosterona
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Control de vehículo
Tijeras quirúrgicas pequeñasFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Disección
Bisturí con hoja desechableFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Microdisección
Pinzas finasFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Disección
Pinzas curvasFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Disección
Capucha de flujo laminarThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AProcesamiento estéril de tejido
IncubadoraThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ACultivo celular
CentrífugaEppendorf (Hamburg, Germany)N/APelletización celular
Cámara de conteo NeubauerHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Conteo celular
Tampon de lisis y extracción RIPAThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Extracción de proteínas
Cocktail de inhibidores de proteasa HaltThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Extracción de proteínas
Sonic Dismembrator Fisherbrand Modelo 120Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonicación
Sistema RIATecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Cuantificación de hormonas
Contador automático de gamma Cobra IIBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/AMedición de radiactividad
Kit ELISA de corticosterona (96 pocillos)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Medición de hormonas
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Medio de montaje
Anticuerpo primario anti-Dab2 de ratónBD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Anticuerpo primario
Anticuerpo primario anti-GFP de polloAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Anticuerpo primario
Anticuerpo primario anti-RFP de conejoRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Anticuerpo primario
Alexa Fluor 594 Anti-ratón de cabraInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 594 Anti-pollo de cabraInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 647 Anti-conejo de cabraInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 488 Anti-ratón de cabraThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Anticuerpo secundario
Sistema de microscopio EVOSThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AImágenes
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424Extracción de ARN
Kit de purificación de ARN Direct-zolZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050Purificación de ARN
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)ND-1000

Referencias

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