Cambios inducidos por electroacupuntura en las vías motoras de proteínas en la incontinencia urinaria de esfuerzo posparto

Resumen

La electroacupuntura mejoró los parámetros urodinámicos en un modelo de rata de incontinencia urinaria de esfuerzo posparto y se asoció con la modulación de vías motoras relacionadas con proteínas. Estos hallazgos sugieren posibles mecanismos moleculares subyacentes a sus efectos terapéuticos.

Resumen

La incontinencia urinaria de esfuerzo posparto (IUE) afecta significativamente a la calidad de vida de las mujeres, aunque los mecanismos moleculares subyacentes de los tratamientos efectivos siguen siendo esquivos. Este estudio tenía como objetivo investigar los efectos terapéuticos y las vías moleculares de la electroacupuntura (EA) en un modelo de rata de IUE. Establecimos el modelo IS utilizando dilatación vaginal con balón (EBV) y aleatorizamos a los sujetos en grupos modelo y tratados con EA. La recuperación funcional se evaluó mediante pruebas urodinámicas, que mostraron que la EA aumentó significativamente la presión en el punto de fuga (LPP) y la capacidad máxima de la vejiga (MBC). El análisis histopatológico utilizando hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson reveló una mejora en la arquitectura muscular y una reducción del 42,3% en la deposición de colágeno, junto con respuestas inflamatorias suprimidas. La proteómica cuantitativa identificó 2.907 proteínas expresadas diferencialmente (DEPs), destacando la base de datos STRING las vías motoras de proteínas como objetivos centrales. Específicamente, EA reguló selectivamente a la baja proteínas centrales, incluyendo MYL1, TNNI2, MYLPF, TNNT3 y TNNT1. Estos hallazgos, validados por western blot y qPCR, sugieren que EA alivia la EOS modulando la contractilidad muscular y remodelando el suelo pélvico, proporcionando información sobre los posibles mecanismos subyacentes a la terapia dirigida de la SU.

Introducción

La incontinencia urinaria de esfuerzo (IAC) es un trastorno común del suelo pélvico que afecta entre el 15 y el 35 % de las mujeres^{posparto 1,2}, afectando significativamente su calidad de vida y salud mental. Además de los síntomas físicos, la IUE posparto genera una carga psicosocial considerable; Muchas mujeres experimentan vergüenza, baja autoestima y aislamiento social. Esta condición puede disminuir los sentimientos de feminidad y llevar a la reticencia a participar en diversas actividades, lo que puede empeorar la sensación de aislamiento y contribuir a la depresión^{posparto 3}. La SUS también presenta desafíos económicos debido a los costes asociados a los productos de continencia y las visitas sanitarias. Aunque existen opciones de tratamiento como el entrenamiento del suelo pélvico e intervenciones quirúrgicas, sus limitaciones en eficacia y riesgo de recurrencia ponen de manifiesto la necesidad de terapias más eficaces y menos invasivas que aborden las causas subyacentes de la IUE^{posparto 4,5}. La patogénesis de la EOS es multifactorial, implicando disfunción muscular del suelo pélvico, degradación de los tejidos conectivos y lesiones neuromusculares. El trauma mecánico durante el parto vaginal es una de las principales causas que contribuyen a la IUE^{posparto 6,7}. Además, la desregulación de la remodelación de la matriz extracelular —caracterizada por la disminución de fibras de colágeno y un metabolismo anormal de la elastina— compromete las estructuras de soporte^{pélvico 8}. La evidencia emergente sugiere que la contractilidad deteriorada de los músculos esfínteres uretrales estriados es un factor crítico impulsado por la expresión aberrante de proteínas específicas del músculo, incluidas las proteínas motoras que regulan las interacciones^{actina-miosina.}

La electroacupuntura (EA), una adaptación moderna que integra la acupuntura tradicional con la estimulación eléctrica, mejora la eficacia terapéutica al modular los circuitos neuronales y promover los procesos de reparación^tisular 10,11,12,13. La EA ha demostrado éxito en el manejo del dolor, enfermedades neurodegenerativas y trastornos urológicos, incluyendo vejiga hiperactiva y prostatitis crónica. Sus efectos se median mediante mecanismos duales: (1) neuromodulación, que implica la activación de los nervios sensoriales somáticos y las vías centrales inhibidoras del^{dolor 14}, y (2) regulación a nivel tisular, promoviendo la angiogénesis, reduciendo la inflamación y restaurando la homeostasis de la matriz^{extracelular 15,16,17}. Cabe destacar que la EA ha mejorado la función muscular del suelo pélvico en pacientes con IUE, como lo demuestra el aumento de la presión de cierre uretral y el aumento de la actividad electromiográfica. Sin embargo, las vías moleculares que subyacen a los efectos terapéuticos de EA sobre la SUE —especialmente su papel en la regulación de proteínas asociadas a la contractilidad muscular— siguen siendo insuficientemente comprendidas.

Durante el almacenamiento de orina, la contracción sostenida del esfínter uretral se mantiene mediante la regulación precisa de las proteínas motoras y sus subunidades reguladoras, que orquestan las interacciones actina-miosina en el músculo^estriado 18,19,20. En estado de reposo, subunidades inhibitorias como la troponina I2 (TNNI2)—una isoforma esquelética específica del músculo de contracción rápida—se unen a los filamentos de actina, estabilizando el complejo troponina-tropomiosina para bloquear los sitios de unión a la miosina y forzar la relajación^{muscular 21,22}. Simultáneamente, la cadena ligera de miosina 1 (MYL1), una subunidad reguladora que modula la actividad de la ATPasa de miosina, permanece sin fosforilar bajo bajo contenido calcio, lo que limita la eficiencia del ciclo de puente^{cruzado 23}. Al activarse neuronalmente durante el estrés físico, la entrada de calcio desencadena cambios conformacionales en el complejo troponinérgico: el calcio se une a la troponina C (TNNC), desplazando a TNNI2 de la actina, retrayendo la tropomiosina y exponiendo los sitios de unión a miosina. Simultáneamente, la miosina quinasa de cadena ligera dependiente de calcio y calmodulina (mLCK) fosforila la MYL1, aumentando la actividad de la ATPasa de miosina y facilitando la formación de puentes cruzados actina-miosina con fuerza. Subunidades estructurales, como la troponina T1 (TNNT1), aseguran la correcta alineación del complejo troponino sobre la actina, permitiendo respuestas sincronizadas a señales de^{calcio 24,25}. En la incontinencia urinaria de esfuerzo (IUE), la sobreexpresión patológica de subunidades inhibitorias (por ejemplo, TNNI2) prolonga el bloqueo de actina-miosina, mientras que la desregulación de MYL1 y TNNT1 altera el ensamblaje de miosina y la sensibilidad al calcio, afectando colectivamente la contractilidad del^{esfínter 5,26}. Estas anomalías moleculares se correlacionan con características histológicas de la IE, incluyendo fibras musculares desorganizadas y una resistencia uretral reducida. Restaurar la expresión fisiológica de TNNI2, MYL1 y TNNT1 surge así como una prioridad terapéutica, ya que recalibra el equilibrio contracción-relajación, mejorando la capacidad adaptativa del esfínter para generar presión de cierre durante eventos de estrés.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., con el número de aprobación IACUC-MIS2023045.

Establecimiento del Modelo de Ratas SUI
Se utilizaron un total de 20 ratas Sprague-Dawley (SD), de entre 6 y 8 semanas, para crear un modelo de lesión del suelo pélvico, simulando el parto. Para inducir la dilatación vaginal con balón (DVV), las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Se introdujo cuidadosamente un catéter de 10 Fr Foley desinflado en el canal medio vaginal, y luego se infló el balón con 3 mL de solución salina estéril. El balón se mantuvo en su lugar durante 4 horas para replicar el prolongado estiramiento mecánico de los músculos del suelo pélvico y la compresión del nervio pudendo asociado al parto. El periodo de modelado fue de 7 días. En el octavo día, se seleccionaron aleatoriamente 6 animales para pruebas urodinámicas.

El establecimiento exitoso del modelo se verificó mediante pruebas urodinámicas y la medición de los niveles séricos de lactato deshidrogenasa (LDH), que sirven como indicadores de lesión muscular. Tras confirmar el éxito de la modelización, las ratas SUI se dividieron aleatoriamente en un grupo simulado y un grupo de tratamiento, con cinco ratas en cada grupo. Al mismo tiempo, se proporcionaron cinco ratas SD normales como grupo de control. En el grupo simulado, se insertaron agujas de acupuntura en los puntos de acupuntura BL23 (situados 6 mm laterales al proceso espinoso L2) y GB30 (situados detrás de la articulación de la cadera) sin ninguna estimulación eléctrica. En el grupo de electroacupuntura, los mismos puntos de acupuntura se estimularon utilizando un dispositivo de electroacupuntura, siguiendo el método estándar de tratamiento clínico. El dispositivo de electroacupuntura se ajustó a una forma de onda densa y dispersa de 1 Hz a 2 V. Cada intervención duraba 30 minutos al día durante 10 días consecutivos. Todos los animales eran monitorizados diariamente y alojados bajo condiciones estándar de laboratorio. Al final del experimento, se realizaron pruebas urodinámicas en los animales de cada grupo. Posteriormente, cada grupo de ratas fue anestesiado con una mezcla de isoflurano al 3% y 1,0 L/min de oxígeno. Después de que las ratas perdieron el conocimiento, la concentración de isoflurano se ajustó al 5%, y se recogieron muestras tras la muerte de las ratas por insuficiencia respiratoria.

Pruebas urodinámicas
Tras la anestesia inducida por isoflurano, los animales se colocaron en posición supina y se aseguraron. Una incisión en la línea media del abdomen inferior dejó la vejiga^{al descubierto 18}. Se implantó un catéter epidural a través de una fístula de 2 mm de diámetro en la cúpula de la vejiga, se avanzó 0,5–1,0 cm dentro del lumen y se aseguró con una sutura 11-0 mediante la técnica de cordón de bolso. El catéter se conectó a un sistema de monitorización de presión y se perfundió con solución fisiológica teñida de azul metileno a 37 °C a 10 mL/h mediante una bomba de microjeringa, con monitorización concurrente de presión intravesical. La capacidad máxima de la vejiga se calculó como el producto de la duración de la infusión (el intervalo entre la iniciación de la infusión y la primera gota de líquido uretral) y el caudal. La presión en el punto de fuga (LPP) se determinó registrando la presión intravesical máxima inmediatamente después de la liberación abrupta de la compresión abdominal aplicada manualmente. Todos los parámetros se adquirieron mediante un sistema de análisis urodinámico, con mediciones triplicadas por métrica. Todas las muestras fueron codificadas y analizadas aleatoriamente de forma ciega por tres operadores independientes, cada uno realizando una única medición. Los resultados de las tres mediciones independientes se utilizaron para el análisis estadístico.

Mide el nivel sérico de lactato deshidrogenasa (LDH)
En el día 7 postoperatorio, se obtuvo aproximadamente 1 mL de sangre total de la vena caudal de cada rata. Las muestras recogidas se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir la formación de coágulos, tras lo cual se centrifugaron a 2.000 × g durante 15 minutos. Se recogieron cuidadosamente aproximadamente 0,5 mL de sobrenadante como suero. Los niveles séricos de lactato deshidrogenasa (LDH) se determinaron cuantitativamente mediante un kit de ensayo de D-lactato deshidrogenasa según los protocolos del fabricante.

Perfilado proteómico y análisis bioinformático
Se realizó un análisis proteómico cuantitativo en tejidos musculares lisos uretrales aislados de grupos modelo y de tratamiento. Las proteínas se identificaron a partir de datos brutos de espectrometría de masas utilizando Proteome Discoverer 2.4 con un umbral de tasa de falsos descubrimientos del 1%. El análisis bioinformático de proteínas diferencialmente expresadas (DEPs) se realizó utilizando paquetes basados en R: el análisis de expresión diferencial se realizó usando el paquete limma (|log2FC| > 1, ajustado p < 0,05), el análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y el análisis de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) se realizaron utilizando el paquete clusterProferer, con términos/vías enriquecidos considerados significativos a p < ajustado 0,05 y valor q < 0,2; El agrupamiento jerárquico se visualizó usando el paquete pheatmap. Se construyó una red de interacción proteína-proteína (IBP) utilizando la base de datos STRING (v11.5, puntuación de confianza > 0.7).

Tinción por hematoxilina y eosina
Los tejidos musculares lisos de la rata estaban fijados con un 4% de paraformaldehído e incrustados en parafina. Las secciones en serie (5 μm de espesor) se preparaban usando un microtomo y se teñían con un kit estandarizado de tinción H&E. La evaluación morfológica se realizó mediante microscopía de campo claro con una magnificación de 40× a 400×, centrándose en la integridad estructural del tejido muscular, la infiltración de células inflamatorias y la remodelación de la matriz.

Tinción tricroma de Masson
Según el protocolo experimental aprobado por el comité de ética, recogimos muestras de los animales en el décimo día de tratamiento. Los tejidos musculares de la rata estaban fijados con un 4% de paraformaldehído y parafina incrustada. Las secciones en serie (5 μm de grosor) se cortaban usando un microtomo rotatorio. Las secciones desparafinizadas se teñieron con el tricromo de Masson. Las secciones teñidas se fotografiaban bajo un microscopio de campo claro a una magnificación del 100×.

Western blot
Las proteínas totales se extrajeron del tejido muscular liso de rata mediante una alteración mecánica en el tampón de lisis RIPA mantenido a baja temperatura y suplementado con inhibidores de proteasas. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 10.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante que contenía proteínas para su análisis. La concentración de proteínas se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) utilizando albúmina sérica bovina como estándar de calibración. Se cargaron cantidades iguales de proteína (30 μg) sobre geles SDS–poliacrilamida al 10% o 12% y se separaron bajo condiciones reductoras. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF con un tamaño de poro de 0,22 μm. Las membranas se incubaron en 3% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear los sitios de unión inespecíficos, seguidas de una incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios reconociendo GAPDH, MYL1, TNNI2, TNNT1, TNNT3 y MYLPF. Tras lavarse con TBST tres veces, se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con HRP durante 2 horas a temperatura ambiente. La detección de señales se realizó utilizando un sustrato quimioluminiscente y las imágenes se capturaron con un sistema de imagen por luminiscencia. La cuantificación de la expresión proteica se realizó mediante análisis densitométrico, con GAPDH como referencia interna.

PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Las muestras de tejido se lisaron utilizando un reactivo de extracción total de ARN y el ARN se aisló siguiendo las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit de extracción de ARN. Los cebadores específicos de genes se diseñaron utilizando software dedicado (Tabla 1) y su especificidad se verificó mediante análisis BLAST (homología ≥18 pb, Tm = 58–62 °C). El ARN se transcribía inversamente usando un kit de transcripción inversa, y la expresión del gen objetivo se detectaba mediante un kit de detección SYBR Green qPCR.

Análisis estadístico
Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se realizaron utilizando una prueba t de muestras independientes, mientras que las diferencias entre múltiples grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguida de análisis post hoc de Bonferroni. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE) o media ± error estándar de la media (SEM). Se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba la significancia estadística.

Resultados

Parámetros urodinámicos en ratas con lesión vaginal por dilatación con balón
La función de la vejiga, incluyendo la continencia urinaria y la capacidad máxima de la vejiga, se evaluó antes y después de la modelización. Los análisis urodinámicos revelaron deterioros estadísticamente significativos tanto en la capacidad máxima de la vejiga (MBC) como en la presión del punto de fuga (LPP) tras la dilatación vaginal con balón (VBD) en comparación con la línea inicial (P <...

Discusión

La IUE, un trastorno urológico común que afecta a mujeres en posparto, está patológicamente vinculado a daños en la estructura de soporte del suelo pélvico durante el embarazo y^{el parto 7,27,28}. Caracterizada por fugas involuntarias de orina durante actividades que aumentan la presión intraabdominal (por ejemplo, tos, estornudos o ejercicio), la EOS afecta significativamente el bienestar físico ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 & micro; Membranas m PVDF	Millipore	ISEQ00010
2 y veces; UniTaq SYBR qPCR Master Mix (ROX-)	TIANYAbiotech	P1504
4% de paraformaldehído	GSbioth	GS539A
Kit de ensayo BCA	Dingguo Biotech	BCA02
Microscopía de campo claro	MSHOT	ML31
Kit de ensayo de D-lactato deshidrogenasa	Beyotime	P0392S
Reactivo ECL Prime	Cytiva	RPN2232
Aparato de electroforesis	WIX	miniPro4
Sistema de Análisis de Imágenes Quimioluminiscencia Totalmente Automatizado	FUJIFILM	LAS-3000
Anticuerpo GAPDH	Biociencias de Afinidad	T0004
Anticuerpos secundarios conjugados con HRP	Biociencias de Afinidad	S0001, S0002
Software ImageJ 1.54	NIH
Kit de tinción tricroma de Masson	GSbioth	GS800A
Anticuerpo MYL1	Cloud-Clone	PAB105Ra01
Anticuerpo MYLPF	Biociencias de Afinidad	DF9048
Nombre	Compañía	Número de catálogo
PowerLab Chart v5.2.1	ADInstruments
Software Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft
Mezcla Master PrimeScript RT	TAKARA	RR036A
Software Proteome Discoverer 2.4	Thermo Fisher Scientific
Aparato de película rotatoria semi-seca rápida	Bio-Rad	788BR04132
Sistema cuantitativo qPCR de fluorescencia en tiempo real	TIANLONG	TL100
Búfer de lisis RIPA	Beyotime	P0013B
Kit de extracción de ARN	Aidlab	RN70
Microtomo rotatorio	Leica	RM2235
Geles SDS-PAGE	Beyotime	P0052A, P0053A
H& estandarizado Kit de tinción E	GSbioth	GS700A
Búfer TBST	Biosharp	BL346A
Anticuerpo TNNI2	Cloud-Clone	PAD230Ra01
Anticuerpo TNNT1	Cloud-Clone	PAD231Ra01
Anticuerpo TNNT3	Cloud-Clone	PAD233Hu01
reactivo de extracción total de ARN	Biosharp	BL258A
Sistema de pruebas urodinámicas	Techman	BL-420