Comparación de los resultados del análisis del ADN del esperma utilizando diferentes estrategias de selección en la citometrìa de flujo

Summary

Las compuertas poligonales (PGG) y las compuertas en forma de cruz (CFG) son métodos de citome­tría de flujo para detectar la integridad del ADN espermático. PGG mide el índice de fragmentación del ADN (DFI) y el índice de tinción de ADN de alta (HDS). CFG informa DFI grave, DFI leve y DFI general. Este estudio tiene como objetivo comparar los resultados y las correlaciones entre ellos.

Abstract

La integridad del ADN del esperma es un factor clave para asegurar una fertilización exitosa, el desarrollo del embrión y el progreso del embarazo. La evaluación de la estructura del cromatina espermática (SCSA) mediante citometría de flujo después de la desnaturalización del ADN y la tinción con naranja acridina se considera el método estándar para evaluar el ADN del esperma. Se han informado dos estrategias de selección para la evaluación del índice de fragmentación del ADN espermático (DFI) basada en citometría de flujo: selección poligonal (PGG) y selección en forma de cruz (CFG). El objetivo del presente estudio fue comparar las relaciones de los resultados del ensayo entre PGG y CFG, y analizar sus correlaciones con los parámetros del análisis básico del semen. Los datos obtenidos independientemente por los dos métodos se compararon mediante análisis estadístico, incluyendo gráficos Bland-Altman y análisis de regresión. Se seleccionaron un total de 121 pacientes masculinos sometidos a evaluación de fertilidad en el centro reproductivo de nuestro hospital mediante un método de muestreo completamente aleatorio. El DFI del esperma y los indicadores relacionados se detectaron mediante citometría de flujo utilizando PGG y CFG, respectivamente. Los resultados demostraron que los valores de DFI obtenidos de los dos métodos mostraron buena concordancia. Los coeficientes de correlación entre DFIp del método PGG y DFIm, DFIs y DFIc del método CFG fueron 0,6497, 0,9404 y 0,9667, respectivamente (todos p < 0,01). El índice de tinción de ADN alto (HDS) mostró una ligera correlación negativa con DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). El porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva estuvo negativamente correlacionado con DFIp, DFIs y DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivamente, todos p < 0,05). No se observó una correlación significativa entre HDS y el volumen seminal, la concentración de espermatozoides, el recuento total de espermatozoides o PR (%). Estos hallazgos indican que DFIs están más estrechamente asociados con la fertilidad masculina, lo que sugiere que el método CFG, que proporciona este parámetro, puede ser más adecuado para la evaluación clínica del daño del ADN del esperma.

Introduction

La integridad del ADN espermático se refiere a la integridad y estabilidad funcional de la estructura molecular del ADN en el núcleo del espermatozoide. Específicamente, se caracteriza por una conformación normal de la cromatina, secuencias de bases intactas sin roturas o daños oxidativos, y la capacidad de transmitir con precisión la información genética a la descendencia. Durante la espermatogénesis, cuando el estrés oxidativo aumenta¹, el remodelado de la cromatina es anormal², o el espermatozoide se ve afectado por toxinas ambientales³, la integridad del ADN espermático se dañará, resultando en emparejamiento de bases, pérdida, modificación, adición de ADN y reticulación, roturas de cadena simple y doble, etc. Además, el ADN espermático dañado puede perjudicar la fertilidad masculina y afectar adversamente los resultados del embarazo en la tecnología de reproducción asistida (ART)⁴, al tiempo que aumenta el riesgo de pérdida recurrente del embarazo⁵. En 2021, la Asociación Europea de Urología (EAU) recomendó la inclusión de la prueba de DFI en el sistema de evaluación de fertilidad masculina⁶.

Actualmente, la integridad del ADN espermático se evalúa principalmente mediante la detección del índice de fragmentación del ADN espermático (DFI). El ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA) mediante citometría de flujo es el método principal para evaluar el DFI⁷. En la literatura se han reportado dos métodos de gateo de citometría de flujo para la detección del DFI en espermatozoides. Uno es el método de gateo poligonal (PGG), que puede reportar simultáneamente dos indicadores clave, como el DFI y HDS del esperma⁸. PGG es un enfoque clásico de SCSA caracterizado por un coeficiente de variación de detección más pequeño y una repetibilidad superior⁹. Sin embargo, no puede distinguir la gravedad del daño del ADN. Otro tipo es el método de gateo cruciforme (CFG), que puede reportar el marcador de daño severo del ADN espermático (DFIs), el marcador de daño leve del ADN espermático (DFIm) y el DFI total del método de gateo cruciforme (DFIc). DFIc es igual a la suma de DFIs y DFIm. En comparación con las tecnologías actuales para evaluar la integridad del ADN espermático, el método CFG puede reflejar la gravedad del daño del ADN espermático¹⁰.

Para determinar qué método es más adecuado para evaluar la calidad del esperma, este estudio empleó tanto el método PGG como el método CFG para medir el DFI y los parámetros relacionados en los espermatozoides. Se comparó la correlación entre los resultados de estos dos métodos y los parámetros de análisis seminal convencionales. Según nuestro mejor conocimiento, este es el primer estudio en analizar la correlación de los resultados de detección entre las dos metodologías, PGG y CFG.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital de Personas Primeras Afiliado a Huai'an de la Universidad Médica de Nanjing (Número de aprobación: KY-2024-181-01). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras se utilizaron en este estudio. Diagrama esquemático general del flujo de trabajo presentado en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se describen en la Tabla de Materiales.

Configuración de CFG para el citómetro de flujo
Después del tratamiento con ácido, la cromatina nuclear de los espermatozoides con ADN dañado muestra ADN de cadena sencilla, mientras que la cromatina nuclear de los espermatozoides con ADN intacto mantiene su estructura intacta de doble cadena. El tinte fluorescente acridina naranja (AO) se une al ADN de cadena sencilla y emite fluorescencia roja cuando se excita con un láser de 488 nm. Cuando se une al ADN de doble cadena, emite fluorescencia verde cuando se excita con un láser de 488 nm. Basándose en el número de señales fluorescentes rojas y verdes capturadas por el citómetro de flujo, se calcula la proporción de fluorescencia roja sobre el total de fluorescencia roja y verde, lo que representa el DFI de los espermatozoides.

La configuración de CFG se implementó de acuerdo con la visión general proporcionada por Yang et al.¹⁰. El citómetro de flujo debe configurarse utilizando la fluorescencia verde más baja y la fluorescencia roja más alta medidas en espermatozoides normales teñidos con AO como referencias de límite (Figura 2). A continuación se presenta una lista de las características celulares de cada cuadrante en el CFG:
El cuadrante Q1 es indicativo de espermatozoides normales. Se observó que el ADN de los espermatozoides estaba intacto y la cantidad de unión de AO era mínima, lo que resultaba en fluorescencia verde.
Los espermatozoides en el cuadrante Q2 tienen ADN parcialmente fragmentado y aparecen naranjas bajo microscopía de fluorescencia. Este ADN puede ser reparable, estos espermatozoides se clasifican como tener fragmentación de ADN leve (DFIm)¹⁰.
El cuadrante Q3 se define como la fluorescencia no específica que ha sido sometida a resta.
Los espermatozoides en el cuadrante Q4 tienen ADN fragmentado y aparecen rojos bajo microscopía de fluorescencia, lo que indica una fragmentación de ADN severa (DFIs).

Se propone que los espermatozoides en los cuadrantes Q2 y Q4 contienen ADN fragmentado, y su suma se define como DFIc.

Configuración del PGG para el citómetro de flujo
La puerta poligonal para el análisis citometrio de flujo se estableció siguiendo el método descrito por Evenson et al.⁸. Como se muestra en la Figura 3, las características celulares asociadas con cada puerta son las siguientes:
P3 es indicativo del porcentaje de células con ADN desnaturalizado.
P4 representa espermatozoides con alta capacidad de tinción de ADN (HDS). Este grupo de espermatozoides carece del intercambio normal de histonas a protaminas.
Las poblaciones celulares predominantes ubicadas fuera de las puertas P3 y P4 consisten en espermatozoides normales, que exhiben fluorescencia roja reducida y emiten predominantemente fluorescencia verde.

Recolección y análisis de muestras de semen
Todas las 121 muestras de semen procedían de los hombres que visitaron el Centro de Reproducción del Hospital de Personas Primeras de Huai'an Afiliado a la Universidad Médica de Nanjing. Las muestras de semen se recolectaron mediante masturbación después de un período de abstinencia de 2-7 días. El análisis de semen de rutina se realizó estrictamente de acuerdo con los requisitos del Manual de Laboratorio de la OMS para el Examen y Procesamiento del Semen Humano^11,12. Los análisis de concentración y motilidad de los espermatozoides se realizaron utilizando un sistema de análisis de espermatozoides asistido por computadora (CASA). Cada muestra se analizó dos veces. Los resultados se informaron como media solo cuando la diferencia entre los dos resultados estaba dentro del intervalo de confianza del 95%; de lo contrario, se realizaron nueva muestra y análisis.

Análisis de DFI
Calcule el volumen de muestra requerido para la muestra de semen para que la concentración final de espermatozoides en el reactivo A del kit de citometría de flujo sea de 2–3 x 10⁶/mL. Método de cálculo: Suponiendo que la concentración de espermatozoides en la muestra original de semen es M x 10⁶/mL, entonces el volumen de semen requerido (µL) = 150/M. Agregue el volumen de semen calculado a un tubo de citómetro de flujo, luego agregue 50 µL de reactivo A y mezcle suavemente. Agregue 100 µL de reactivo B, mezcle suavemente e incube por 30 s a temperatura ambiente. Agregue inmediatamente 300 µL de reactivo C y mezcle suavemente. Detecte la muestra usando CFG y PGG en el citómetro de flujo, y analice al menos 5000 espermatozoides.

Análisis estadístico
Los datos se sometieron a análisis estadístico utilizando GraphPad Prism 6.0. Se construyeron gráficos de Bland-Altman para evaluar el nivel de acuerdo entre PGG y CFG calculando la media y las diferencias. Las diferencias entre los dos métodos se trazaron contra sus valores promedio. Además, se utilizó el método de Pearson para analizar la correlación entre PGG y CFG. Se determinó que un valor p menor que 0.05 era estadísticamente significativo.

Results

Entre los 121 participantes del estudio (edad media: 32,5 ± 4,9 años; rango: 26–44 años), 28 fueron diagnosticados con asthenozoospermia y 4 con oligozoospermia. Las características demográficas de base y los parámetros del análisis de semen se resumen en la Tabla 1.

Como se demuestra en la Figura 4, la gráfica de Bland-Altman reveló que los resultados del DFI de esperma obtenidos por los métodos PGG y CFG exhibieron una excelente consistencia (r = 0,9667, p = 0,0000). Solo dos muestras mostraron discrepancias mayores a +10%, y tres muestras mostraron discrepancias menores a -10%, con proporciones de 1,7% y 2,5%, respectivamente.

La Tabla 2 muestra una fuerte correlación positiva entre el DFIp de PGG y cada uno de los tres parámetros derivados de CFG: DFIm, DFIs y DFIc. Los coeficientes de correlación fueron 0,6497, 0,9404 y 0,9667, respectivamente, y los valores de p fueron todos menores a 0,05. Los resultados de HDS detectados por el método PGG exhibieron una correlación negativa significativa con los DFIs y DFIc detectados por el método CFG. Los coeficientes de correlación fueron -0,3042 y -0,2120, respectivamente, y los valores de p fueron todos menores a 0,05. La investigación no reveló correlación entre HDS y DFIm (el valor de p fue mayor a 0,05).

Como se muestra en la Tabla 3, el porcentaje de esperma progresivamente móvil estuvo significativamente correlacionado negativamente con DFIp, DFIm, DFIs y DFIc (todos los valores de p fueron menores a 0,05), pero no correlacionado con HDS (el valor de p fue mayor a 0,05). El volumen de semen exhibió una correlación positiva significativa con DFIp, DFIs y DFIc (todos los valores de p fueron menores a 0,05), pero no con HDS (el valor de p fue mayor a 0,05). La concentración de esperma y el recuento total de esperma no se encontraron correlacionados con los resultados del análisis de PGG y CFG (el valor de p fue mayor a 0,05).

El método CFG demuestra una excelente consistencia con PGG para la evaluación del DFI. CFG permite la discriminación del grado de daño del ADN, y sus parámetros de DFI están significativamente correlacionados con la motilidad del esperma. Los indicadores de daño severo del ADN del esperma, conocidos como DFIs, son más adecuados para su uso generalizado en la práctica clínica de rutina.

Disponibilidad de datos:
Los conjuntos de datos producidos y/o analizados a lo largo del curso de esta investigación incorporan datos clínicos a nivel del paciente y no se divulgan al público debido a consideraciones institucionales de privacidad y ética. Al enviar una solicitud razonable y obtener la aprobación del Comité de Ética del Hospital Popular Afiliado N.º 1 de Huai'an de la Universidad Médica de Nanjing, el autor correspondiente está autorizado para proporcionar datos desidentificados y hallazgos analíticos. Este estudio no implicó el desarrollo de ningún código personalizado.

Figura 1: Diagrama esquemático general del flujo de trabajo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Gating cruciformes (CFG) de la citome&tacute;tría de flujo para la detección de DFI. Q1 – Esperma normal. Q2 – Fragmentación leve del ADN (DFIm). Q3 – Fluorescencia no específica que ha sido restada. Q4 – Fragmentación severa del ADN (DFIs). El esperma con daño en el ADN cae en Q2 y Q4. Su suma representa la población total de esperma con ADN fragmentado (DFIc). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Gating poligonal (PGG) de la citome&tacute;tría de flujo para la detección de DFI. P3: espermas con ADN desnaturalizado. P4: alta tinción de ADN (HDS) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Gráficas de Bland-Altman de los resultados de los ensayos PGG y CFG para DFI. Eje X: Media de los resultados de medición obtenidos por el método PGG y el método CFG. Eje Y: Diferencia en los resultados de medición entre el método PGG y el método CFG Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ítem	Media±DE	Rango
Edad(años)	32,5±4,9	26-44
Días de abstinencia(Día)	4,1±1,3	3-7
Volumen de semen(mL)	3,8±1,6	0,5-6,8
Concentración de esperma(×106/mL)	52,0±35,5	10,3-185,1
Motilidad progresiva(%)	42,8

Discussion

La sexta edición del Manual de Laboratorio de la OMS para el Examen y Procesamiento del Semen Humano¹² recomienda cuatro métodos para evaluar la integridad del ADN de los espermatozoides: terminal deoxynucleotidyl transferase (dUTP) nick end labelling (TUNEL), ensayos de electroforesis en gel monocelular (Comet), SCSA y prueba de dispersión de cromatina espermática (SCD). Entre estos, el SCSA ha sido ampliamente adoptado en laboratorios de andrología debido a su uso de citometrìa de flujo para el análisis, que ofrece alto rendimiento, eficiencia y objetividad, así como la capacidad de informar simultáneamente parámetros como DFI y HDS⁷. Según una encuesta global⁷, casi una cuarta parte (24,1%) de los clínicos reproductivos de todo el mundo seleccionaron el SCSA como el método para evaluar la integridad del ADN espermático.

El paso más crítico en el procedimiento SCSA es establecer la activación de citometrìa de flujo adecuada. El método PGG tradicional puede detectar tanto fragmentos rotos (DFI) de hebras de ADN como espermatozoides con tinción de ADN anormalmente alta (HDS) caracterizados por la falta de intercambio normal de histonas y protaminas¹³. Sin embargo, no puede distinguir entre roturas de cadena simple y doble en el ADN espermático. En los últimos años, Yang et al.¹⁰ establecieron un método CFG para analizar el DFI de los espermatozoides usando citometrìa de flujo, que puede distinguir la gravedad del daño del ADN espermático. El paso clave de este método es establecer una puerta cruciforme para el citómetro de flujo. El método CFG exhibe una excelente repetibilidad (el coeficiente de variación fue menor al 5%) y un rango lineal para la detección de DFI del 8,93% al 53,90%. Este método informa tres indicadores—DFIm, DFIs y DFIc—pero no proporciona resultados HDS¹⁰.

Este estudio encontró que el DFI total del método CFG (DFIc) estaba en buen acuerdo con el del método PGG (DFIp). El análisis de correlación reveló que los coeficientes de correlación de DFIs y DFIp fueron significativamente más altos que los de DFIm. Ni la concentración de espermatozoides ni el recuento total de espermatozoides se correlacionaron con los resultados del método CFG o PGG. PR (%) y los cuatro tipos de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) se correlacionaron negativamente de manera significativa. PR (%) se correlacionó negativamente de manera significativa con los cuatro tipos de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp). La correlación con DFIm (r = -0,1975) fue significativamente más débil que la de DFIs, DFIc y DFIp (r = -0,3794, -0,3574, -0,3824, respectivamente). Estos hallazgos son consistentes con los reportados por Yang et al.¹⁰. Además, DFIs y DFIc mostraron buenas correlaciones con el volumen seminal, mientras que DFIm no lo hizo. Aunque la utilidad clínica de un indicador que se alinea de cerca con los parámetros seminales básicos puede ser limitada, este hallazgo sugiere que el índice de daño severo del ADN espermático (DFIs) puede reflejar aspectos patológicos distintos de la espermatogénesis. Más importante aún, como se muestra en nuestro análisis de correlación, DFIs demostró una asociación significativamente más fuerte con el porcentaje de espermatozoides progresivamente móviles en comparación con DFIm, apoyando aún más su potencial como indicador complementario en las evaluaciones de fertilidad masculina más allá del análisis seminal convencional.

HDS representa la proporción de espermatozoides inmaduros que carecen de intercambio normal de histonas y protaminas. El precursor de protamina 1 en los espermatozoides HDS retiene aminoácidos terminales que típicamente se escinden⁸, potencialmente previniendo la condensación adecuada de la cromatina y resultando en un aumento de la tinción de naranja acrídica de dsDNA. Estudios previos han enfatizado la importancia de HDS para describir defectos de cromatina en espermatozoides. Investigaciones de Lin et al.¹⁴ y Virro et al.¹⁵ indican que la tasa de aborto es significativamente mayor en hombres con HDS > 15% en la fertilización in vitro (IVF). Sin embargo, hallazgos recientes sugieren que HDS puede no indicar de manera confiable la inmadurez nuclear debido a su débil correlación con los resultados de tinción CMA3, AB y TB¹⁶. Por lo tanto, HDS podría no ser adecuado como un indicador de fertilidad masculina¹⁷. Este estudio también muestra ninguna correlación significativa entre HDS y los parámetros seminales básicos, incluyendo el volumen seminal, la concentración de espermatozoides y la motilidad. Por lo tanto, HDS no se recomienda como un marcador para la integridad del ADN espermático¹⁸.

Durante el proceso de detección de DFI, pueden surgir inconsistencias en los límites de fluorescencia. Este fenómeno se atribuye principalmente a variaciones significativas en la concentración y motilidad de los espermatozoides entre diferentes especímenes. Para abordar este problema, se recomienda usar activación adecuada para excluir espermatozoides muertos, residuos y otras señales no específicas. Este enfoque mejora la precisión de los datos y mitiga el problema de los límites de fluorescencia inconsistentes.

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio en comparar los resultados de análisis de los métodos PGG y CFG. Una limitación de este estudio es su diseño de un solo centro y muestra pequeña, y sus conclusiones requieren más validación a través de estudios multicéntricos y de gran muestra. Las direcciones de investigación futuras incluyen asegurar la consistencia en los resultados de las pruebas de DFI de espermatozoides a través de diferentes citómetros de flujo y determinar si DFIs de espermatozoides pueden predecir resultados de tecnología de reproducción asistida.

En conclusión, el método CFG proporciona más parámetros para la integridad del ADN espermático. Específicamente, DFIm y DFIs reflejan las proporciones de espermatozoides con daño de ADN leve y severo, respectivamente. Los resultados DFIc y DFIp muestran buena consistencia. El método CFG es adecuado para aplicación clínica y promoción.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de análisis de esperma asistido por computadora	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Citómetro de flujo	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Kit de citometría de flujo	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Cámara de conteo Makler	Sefi Medical Instruments
Kit de integridad del ADN del núcleo espermático	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-