Efecto regulatorio de la moxibustión en la polarización y migración de macrófagos en ratas modelo de AR y el papel de TIM-3

Resumen

Este estudio examina los efectos regulatorios de la moxibustión sobre la polarización y migración de macrófagos en modelos de ratas de artritis reumatoide, con especial atención al papel de la inmunoglobulina de células T y la proteína 3 que contiene el dominio mucino (TIM-3), para elucidar los mecanismos terapéuticos de la moxibustión en esta enfermedad.

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo examinar los efectos reguladores de la moxibustión en la polarización y migración de los macrófagos en un modelo de ratas de artritis reumatoide, así como el papel de la inmunoglobulina de células T y la proteína 3 que contiene el dominio mucina (TIM-3) en este proceso. El día 0 del experimento, las ratas Sprague–Dawley (SD) se dividieron en cinco grupos. Se inyectó el adyuvante de Freund completo (CFA) en las almohadillas traseras para establecer el modelo de artritis reumatoide. Además, se inyectó interferencia de ARN Havcr2 mediada por lentivirus (LV-Havcr2-ARNi) en las almohadillas traseras para inhibir la expresión de TIM-3. A partir del día 7, las ratas recibieron tratamiento de moxibustión en ciclos que comprendían seis días de tratamiento y un día de reposo, para un total de tres ciclos completos. Tras completar la terapia de moxibustión, se evaluó el estado inflamatorio mediante análisis histológico y medición del grosor de las patas. Los marcadores fenotípicos de los macrófagos M1 y M2 fueron evaluados mediante un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) e inmunofluorescencia. La expresión de TIM-3 se detectó mediante reacción en cadena cuantitativa en tiempo real de la polimerasa (qRT-PCR) y Western blot. Además, se aislaron macrófagos exudados peritoneales (PEMs) de ratas SD adicionales, y se examinó la migración de macrófagos mediante un ensayo de Transwell. El estudio encontró que, tras la inyección de CFA, las ratas mostraron un enrojecimiento e hinchazón significativos en las patas, junto con un desequilibrio en la expresión del fenotipo de los macrófagos. Además, los ensayos de migración de Transwell revelaron que las ratas modelo inducidas por CFA mostraron un aumento en la migración de macrófagos en relación con los ejemplares control. Sin embargo, el tratamiento por moxibustión atenuó estos cambios. Los resultados también demostraron que la moxibustión aumentó la expresión de TIM-3 y, tras la intervención lentiviral, los niveles de TIM-3 se redujeron notablemente, lo que llevó a la exacerbación de manifestaciones inflamatorias y a un desequilibrio de los macrófagos. Estos resultados indican que TIM-3 actúa como mediador clave en la regulación por moxibustión de la polarización y migración de los macrófagos.

Introducción

La artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmune sistémico prevalente que se presenta clínicamente con artritis inflamatoria simétrica. La inflamación se dirige principalmente a la membrana sinovial, el cartílago y el hueso, lo que provoca la destrucción tisular y culmina en una deformidad irreversible de las^{articulaciones 1}. El manejo farmacológico actual de la AR se basa principalmente en fármacos modificadores de la enfermedad (^DMARDs)2, que a menudo requieren administración de por vida. Sin embargo, estos agentes terapéuticos están asociados a diversos efectos adversos. En consecuencia, un número significativo de pacientes busca terapias complementarias seguras y eficaces para aliviar los síntomas clínicos y potencialmente reducir su dependencia de los regímenes farmacológicos convencionales. Como componente clave de la medicina tradicional china, la moxibustión puede servir como una terapia complementaria prometedora para la AR. Ejerce sus efectos terapéuticos a través de mecanismos sistémicos antiinflamatorios e^{inmunomoduladores 3}. La evidencia indica que la moxibustión puede aliviar los síntomas y proteger las estructuras^{articulares 4}. Además, en comparación con la posible toxicidad heparrenal, los riesgos de infección y los altos costes asociados a los DMARDs, la moxibustión ofrece una seguridad superior y un coste menor. Sin embargo, la moxibustión no es una panacea y no puede sustituir completamente a los DMARD para gestionar la AR. La moxibustión suele requerir sesiones repetidas y prolongadas de tratamiento para lograr sus efectos. Durante exacerbaciones agudas de la AR, puede no proporcionar un control rápido de los síntomas. Además, el resultado terapéutico de la moxibustión depende en gran medida de la habilidad y experiencia del profesional, lo que introduce variabilidad. En consecuencia, integrar la moxibustión con los DMARDs debe considerarse para lograr un efecto sinérgico de "eficacia aumentada con toxicidad reducida", lo que la convierte en una estrategia viable para el manejo a largo plazo de la^{AR 5}.

Aunque numerosos estudios han confirmado la eficacia terapéutica de la moxibustión en la^{AR 6,7,8}, sus mecanismos precisos de acción siguen sin estar claros. Este estudio investiga los efectos de la moxibustión en la polarización y migración de los macrófagos en la AR, utilizando inmunoglobulina de células T y la proteína 3 que contiene el dominio mucina (TIM-3) como punto de entrada mecanicista. Este enfoque está diseñado para dilucidar una posible vía inmunomoduladora a través de la cual la moxibustión ejerce sus efectos antiartríticos.

Como células inmunitarias clave, los macrófagos desempeñan un papel central en la patogénesis y progresión de la^{AR 9,10}. Al inicio de la inflamación, los macrófagos residentes en los tejidos liberan una variedad de citocinas y quimioquinas. Estas moléculas de señalización actúan sobre las células endoteliales vasculares, promoviendo la diferenciación de los monocitos circulantes en macrófagos y su posterior reclutamiento en tejido^{inflamado 11,12}. Estos macrófagos infiltrantes amplifican aún más la respuesta inflamatoria al producir mediadores adicionales, que a su vez reclutan más macrófagos y agravan la infiltración tisular, estableciendo así un círculo vicioso de inflamación e infiltración tisular.

Dependiendo de los estímulos ambientales, los macrófagos muestran una plasticidad significativa al polarizarse en fenotipos funcionales distintos, principalmente estados M1 (activado clásicamente) y M2 (activado alternativamente^{) 13}. En condiciones fisiológicas, la polarización de los macrófagos mantiene un equilibrio dinámico entre los fenotipos M1 y M2. Sin embargo, en la AR, este equilibrio se ve alterado, caracterizado por una mayor polarización M1 con una mayor liberación de mediadores proinflamatorios, incluyendo interferón (IFN)-γ y la síntasa inducible de óxido nítrico (iNOS), que agravan las respuestas inflamatorias. Simultáneamente, la polarización de M2 se debilita, acompañada de una reducción en la liberación de factores antiinflamatorios, incluyendo la interleucina (IL)-4 y CD206, lo que afecta su capacidad para inhibir la activación y proliferación de células T, agravando así la progresión de^{la enfermedad 14}. Varias investigaciones han revelado que modular el equilibrio de macrófagos M1/M2 puede mitigar la progresión de la^{AR 15,16}.

TIM-3, identificado como una glicoproteína de superficie de células T, se expresa ampliamente en un espectro de células inmutarias, incluyendo células T, macrófagos y células natural killer, donde se une a ligandos específicos para ejercer funciones^{inmunoreguladoras 17}. La señalización TIM-3 ejerce una influencia definitiva sobre la expresión y polarización de citoquinas inflamatorias de los macrófagos. Cabe destacar que TIM-3 se expresa fuertemente en macrófagos M2, donde promueve el fenotipo M2 mientras suprime el fenotipo M1. Por el contrario, la investigación indica que la inhibición de TIM-3 produce el efecto contrario, impulsando la polarización M1 y atenuando la polarización M2 18,19,20. Además, la evidencia destaca TIM-3 como un regulador clave del comportamiento migratorio de los^{macrófagos 21,22}. Por lo tanto, la intervención terapéutica dirigida a TIM-3 para controlar la polarización de los macrófagos y la dinámica migratoria muestra un potencial considerable como estrategia de tratamiento de la AR.

Basándose en la justificación mencionada, este estudio se llevó a cabo para contribuir al creciente cuerpo de conocimiento sobre los mecanismos por los cuales la moxibustión ejerce sus efectos terapéuticos en la AR.

Protocolo

Declaración ética y precauciones de seguridad
Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (2024029). Durante todos los procedimientos de inyección, incluida la administración de CFA y lentivirus, los operadores deben llevar equipo de protección individual (EPP) que consiste en guantes desechables, gafas y batas de laboratorio. Estos procedimientos deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad o en un entorno bien ventilado. Todos los objetos punzantes que hayan estado en contacto con reactivos deben ser inmediatamente descartados en recipientes designados para los punzantes. Durante todo el tratamiento de moxibustión, el operador vigiló de cerca la respuesta del animal. El cono de moxa fue reemplazado rápidamente para evitar daños térmicos en la piel. Además, los materiales inflamables deben mantenerse alejados de la moxa en llamas para eliminar los riesgos de incendio.

1. Establecimiento del modelo de AR

Treinta ratas SD machos (peso: 200 ± 20 g), de seis semanas (número de licencia: SCXK 2020-030), se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6): grupo control, grupo modelo AR (grupo AR), grupo de tratamiento RA + moxibustión (grupo Mox), grupo de interferencia lentivirus RA + TIM-3 (grupo RA + TIM-3) y grupo de tratamiento de interferencia lentiviral RA + TIM-3 (RA + TIM-3– grupo de tratamiento de interferencia lentiviral + moxibustión (AR + TIM-3– + grupo Mox). Antes del experimento, las ratas se aclimataron durante siete días en un entorno controlado con una temperatura de 22–24 °C, un 20% de humedad y un ciclo natural de luz/oscuridad, con acceso libre a comida y agua. En el día 23 del experimento, se compraron cinco ratas SD machos de tres semanas más de la misma empresa. Estas ratas fueron aclimatadas durante cinco días bajo condiciones idénticas de alojamiento antes de ser utilizadas para la extracción de PEM. Un diagrama esquemático que resume el procedimiento experimental y fotografías representativas procedurales se muestra en la Figura 1.

El día 0 del experimento, se inyectaron 0,5 mL/kg de CFA en las almohadillas de las patas traseras de todas las ratas excepto las del grupo de control para inducir AR. El mismo volumen de suero fisiológico se administró en la misma ubicación en ratas del grupo de control. Se utilizó el grosor de la pata como criterio para evaluar el establecimiento exitoso del modelo^{RA 23}.

2. Inyección de lentivirus

Las ratas de los grupos RA + TIM-3^- y RA + TIM-3^- + Mox recibieron la inyección de ARN-LV-Havcr2 (94435-1) en las almohadillas de las patas traseras (3,5 × 10⁷ TU/mL; 10 μL por almohadilla) el primer día del experimento. Todas las demás ratas recibieron inyecciones idénticas de solución salina normal en el mismo sitio anatómico²⁴.

3. Moxibustión

En el día 7 del experimento, las ratas de los grupos Mox y RA + TIM-3^- + Mox recibieron tratamiento de moxibustión. Para facilitar el procedimiento, se afeitó el pelo en un área de aproximadamente 1 × 1 cm alrededor de los puntos de acupuntura BL23 y ST36 (este procedimiento también se realizó en ratas de los grupos restantes). Durante la moxibustión, cada rata era suxemente sujeta a un bloque de madera ligeramente mayor que su tamaño corporal mediante dos bandas elásticas para exponer completamente las zonas de tratamiento (las ratas de otros grupos también eran sujetadas). Posteriormente, se aplicaron conos moxa en forma de grano en ambos puntos de acupuntura. Para asegurar la consistencia en la estimulación térmica entre individuos, se preparó cada cono de moxa (diámetro: 2 mm; altura: 5 mm; contenido de lana de moxa: 60%) a partir de una porción estandarizada de lana de moxa de 5 mg. Cada día, se aplicaban cinco conos a los dos puntos de acupuntura de un lado del cuerpo, alternando el tratamiento al lado contralateral al día siguiente. Este protocolo de tratamiento alterno se mantuvo durante tres semanas, con un periodo de descanso de un día cada siete días.

Tras tres ciclos de tratamiento con moxibustión, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano (inducción del 4%, 2% mantenimiento, inhalación), y se recogieron 5 mL de sangre arterial de la aorta abdominal. Tras la centrifugación (2.000 × g, 15 min, 4 °C), el suero sobrenadante se transfería a tubos de microcentrífuga y se almacenaba a −20 °C. Tras la toma de muestras de sangre, las ratas fueron eutanasiadas por luxación cervical. Las articulaciones del tobillo fueron cuidadosamente diseccionadas y fijadas con paraformaldehído al 4%. Los tejidos sinoviales y los bazos se congelaron rápidamente usando nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C.

4. Medición del grosor de las patas de rata

Los puntos medios de las patas traseras de las ratas estaban marcados con un marcador impermeable para asegurar una posición consistente en las medidas. El grosor de la pata se midió usando calibradores vernier antes de modelar, tras un modelado exitoso y entre cada ciclo de tratamiento (en los días 0, 7, 14, 21 y 28 del experimento).

5. Análisis histológico

Tras la fijación en paraformaldehído al 4%, las articulaciones del tobillo de rata se colocaron en tubos de centrífuga que contenían un volumen considerable de solución de descalcificación (10% de ácido fórmico). Los tubos se montaban sobre un agitador y se agitaban suavemente a temperatura ambiente durante 30 horas. Durante este periodo, la solución de descalcificación se reemplazó a intervalos regulares y se monitorizó el estado tisular para evitar la sobredescalcificación. Posteriormente, los tejidos se transfirieron a una solución de tiosulfato de sodio al 5% para neutralización durante 6 horas, seguida de un enjuague exhaustivo de 4 horas bajo agua del grifo^{corriente durante 25} horas. Los tejidos se deshidrataron e incrustaron en bloques de parafina. Las secciones se cortaron transversalmente con un grosor de 5 μm. Tras la deparafinización e hidratación, se teñían secciones con hematoxilina durante 3 minutos, se enjuagaban con agua, se diferenciaban brevemente (5 s), se enjuagaban de nuevo y se azulaban durante 5 s, seguido de un enjuague a fondo bajo agua del grifo corriente. Posteriormente, las secciones se deshidrataron con etanol al 95% durante 1 minuto y se contracoloraron con eosina durante 15 segundos. Finalmente, las secciones se deshidrataron, limpiaron y montaron una cubierta para observación bajo un microscopio óptico. Con esta tinción, los núcleos aparecían azules, mientras que el citoplasma, las fibras de colágeno y los glóbulos rojos se visualizaban en diferentes tonos de rosa; La capa queratinizada suele teñirse de rojo brillante.

6. ELISA

Siguiendo el protocolo del fabricante, se añadió una alicuota de 100 μL de cada muestra de suero (prediluida 1:2) a los pozos designados. Se incluyeron pozos en blanco y estándar en paralelo. Tras el sellado, la placa se incubó a 37 °C durante 90 minutos. Tras un paso de lavado, se añadió el anticuerpo de detección e incubó a 37 °C durante 60 minutos. Tras otro lavado, se añadió el conjugado estreptavidina–HRP. Tras un lavado exhaustivo, se añadió la solución de sustrato para el desarrollo del color, que se detuvo con la adición de solución de parada. La absorbancia se midió en 450 nm (OD₄₅₀). Las concentraciones muestrales de IL-4 e IFN-γ se determinaron mediante interpolación desde la curva estándar, y las concentraciones finales se calcularon multiplicando por el factor de dilución correspondiente.

7. qRT-PCR

El ARN total se extrajo de muestras de suero utilizando reactivo TRIzol según un protocolo modificado. En breve, se homogeneizaron 100 μL de suero con 1 mL de reactivo TRIzol mediante pipeteo vigoroso. Posteriormente, se añadieron 100 μL de cloroformo y la mezcla se agitó vigorosamente durante 15 segundos, seguida de incubación a temperatura ambiente durante 3 minutos. La muestra se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para lograr la separación de fases. La fase acuosa superior se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo, mezcló con 0,5 mL de isopropanol e incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, el ARN total se comprimió por centrifugación a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El pellet de ARN resultante se lavó una vez con 1 mL de etanol al 75% (centrifugación a 8.000 × g durante 5 minutos a 4 °C) y se secó al aire antes de la disolución final. El ARN obtenido fue sometido a transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de ADNc. El análisis de expresión génica se realizó mediante qRT-PCR utilizando software de sistema de PCR cuantitativa en tiempo real. β-actina se utilizó como gen de mantenimiento para la normalización. La expresión relativa del ARNm TIM-3 se calculó utilizando el método 2^−ΔΔCt . Los detalles de los cebadores se añaden en la Tabla 1.

8. Western blot

El bazo extraído se lavó tres veces con solución salina preenfriada con fosfato tamponado (PBS), cortó en pequeños trozos y se lisó añadiendo tampón de lisis a un volumen diez veces mayor que el del tejido. La homogeneización se realizó utilizando un tubo homogeneizador. El homogenado se colocó en hielo durante 30 minutos para la lisis, con cinco a seis rondas de vórtices para asegurar la completa alteración del tejido. Las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se recogió como extracto total de proteína. Las concentraciones de proteínas objetivo se midieron mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según el protocolo del kit.

Tras la separación mediante electroforesis en gel de dodecilo sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% (SDS–PAGE), las muestras de proteínas extraídas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó a temperatura ambiente durante 1 hora con suero fisiológico que contenía Tween 20 (TBST) con suero desnatado al 5%, seguido de una incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios. Tras un lavado exhaustivo, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a 37 °C durante 2 horas. Finalmente, las imágenes se capturaron utilizando un sistema de imagen quimioluminiscencia y se analizaron para la intensidad en escala de grises utilizando el software de análisis ChemiScope. Los detalles de los anticuerpos primarios y secundarios se enumeran en la Tabla 1.

9. Detección de inmunofluorescencia

El tejido sinovial extraído se sumergió en un 4% de paraformaldehído, se deshidrató e incrustó en parafina antes de ser seccionado en cortes de 5 μm de grosor. Las secciones se deceraron secuencialmente en xileno I, xileno II y xileno III (10 minutos cada una), seguidas de tres lavados en etanol absoluto (5 minutos cada uno) y un enjuague final con agua destilada.

Tras la extracción de antígenos en ácido etilendediaminetetraacético (EDTA), las láminas se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (5 minutos cada una) con una agitación suave. Las secciones se bloquearon después mediante incubación con albúmina sérica bovina al 3% (BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, se aplicaron anticuerpos primarios, incluyendo la antiinducible síntesa de óxido nítrico (iNOS) (1:500) y el anti-CD206 (1:400), que se incubaron a 4 °C durante 24 horas.

Tras tres lavados PBS de 5 minutos, las secciones se incubaron durante 50 minutos a 37 °C en la oscuridad con un anticuerpo secundario (IgG anticonejo conjugado con Cy3, 1:300). La tinción nuclear se realizó lavando las láminas tres veces con PBS (5 min por lavado), seguida de tratamiento con solución de tinción 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las imágenes fueron examinadas bajo un microscopio de fluorescencia.

10. Aislamiento de los PEM

Tras la eutanasia por luxación cervical, las ratas fueron desinfectadas con etanol al 75% durante 10 minutos y transferidas a un gabinete de bioseguridad estéril. La piel abdominal fue incisa con tijeras estériles, seguida de una inyección intraperitoneal de 15 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringuilla. El abdomen se masajeaba suavemente antes de que el líquido peritoneal fuera aspirado de nuevo a la jeringuilla y transferido a tubos centrífugas para obtener suspensiones de macrófagos.

La suspensión celular se lavó tres veces con PBS antes de ser sembrada en el medio modificado Eagle (DMEM) de Dulbecco, que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS). Las células se cultivaron durante 24 horas en una atmósfera humidificada con un 5% de CO₂ a 37 °C. Las células adherentes obtenidas tras este periodo de incubación fueron identificadas como macrófagos.

11. Transwell

El ensayo migratorio se realizó utilizando placas de 24 pozos. Tras 24 horas de inanición sérica, se añadieron 4 ×¹⁰ macrófagos en 300 μL de DMEM suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 1% y antibióticos al 1% (50 U/mL penicilina, 50 μg/mL estreptomicina) en la cámara superior, mientras que se introdujeron 700 μL de DMEM con 10% de FBS y 1% de antibióticos en la cámara inferior. Las células fueron pretratadas con suero de diferentes grupos de ratas durante 24 horas. Posteriormente, las placas se incubaron a 37 °C en un ambiente con 5% de CO₂ durante 24 horas. Tras la tinción de violeta cristalino, se fregó la cámara superior para eliminar las células no migradas. Las células migratorias se cuantificaron mediante conteo manual en cuatro campos de visión seleccionados al azar bajo un microscopio óptico.

12. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión 25.0 de SPSS. Los conjuntos de datos se probaron primero para verificar la normalidad y homogeneidad de las varianzas. Cuando se cumplieron estas suposiciones paramétricas, se realizaron comparaciones intergrupales utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguidos de análisis post hoc por diferencias mínimas significativas (LSD). Para los datos que violaban estas suposiciones, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal–Wallis, seguida de las pruebas Mann–Whitney U con corrección adecuada para comparaciones múltiples. Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar, y P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Disponibilidad de datos
Los datos en bruto generados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197)

Patología articular y grosor de las patas en ratas tras el tratamiento con moxibustión
Las ratas inyectadas con CFA desarrollaron hinchazón y enrojecimiento evidentes en las patas. La tinción de hematoxi...

Discusión

La gestión actual de la AR se basa principalmente en los DMARDs. Sin embargo, estos agentes farmacológicos suelen ser costosos y están asociados a efectos adversos no despreciables, incluyendo insuficiencia heparrenal e infecciones^graves, lo que supone una carga considerable para las personas y los sistemas sanitarios. En cambio, como tratamiento externo, la moxibustión presenta un perfil de seguridad favorable con un riesgo mínimo reportado de toxicidad sistémica...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Completo Freund s Adyuvante (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881	Utilizado para inducir el modelo de artritis reumatoide (AR) en ratas
Lentivirus (ARN TIM-3)	GenChem Biotechnology, Shanghái	3,5 y veces; 107 TU/mL	Se usa para silenciar la expresión del gen TIM-3
Moxa Cones (tamaño trigo)	Proveedor de Medicina Tradicional China	N/A	Usado para moxibustión en puntos de acupuntura BL23 y ST36