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Artículo de método

Un novedoso sistema de cultivo 2D y 3D libre de suero que comprende dos pequeñas moléculas para el cultivo de células epiteliales de la glándula lagrimal de ratón

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DOI:

10.3791/70438

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10 de febrero de 2026

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1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

En este artículo

Resumen

Se introduce un novedoso sistema de cultivo sin suero utilizando la combinación de pequeñas moléculas 2C (Y27632 y SB431542) para expandir eficientemente las células epiteliales de las glándulas lacrimales (LGECs) tanto en cultivos 2D como 3D, permitiendo un control preciso de su proliferación y diferenciación.

Resumen

La disfunción de las glándulas lacrimales (LG) es una causa principal de la enfermedad ocular seca con deficiencia acuosa, y las terapias celulares e ingeniería tisular muestran un potencial significativo para esta condición. Sin embargo, la limitada disponibilidad de suficientes células semilla cultivadas en condiciones libres de suero ha dificultado su aplicación generalizada. En este estudio, desarrollamos un novedoso sistema de cultivo sin suero utilizando dos moléculas pequeñas, Y27632 y SB431542 (2C), para expandir eficientemente las células epiteliales LG (LGECs). Para el cultivo primario 2D de LGECs, se aislaron LG de ratones de 6-8 semanas y se digirieron enzimáticamente usando Dispase II y Colagenasa A. La suspensión celular resultante se sembró en recipientes de cultivo a una densidad de 7.500 células/cm2 y se cultivó con 2C durante 12-14 días. Cuando la confluencia celular alcanzó el 80-90%, el subcultivo se inició en una proporción 1:2. Para el cultivo 3D, se resuspendieron 10.000 LGECs P1 en 10 μL de 2C y 10 μL de gel matricial, y luego se sembraron en el centro de una placa de 24 pozos. Tras un periodo de solidificación de 30 minutos a 37 °C, se añadieron 600 μL de 2C para continuar el cultivo. Para diferenciar, los esferoides 3D se cultivaron con 2C durante 7 días, seguido de la retirada del 2C y el cultivo continuado durante 7 días adicionales. Los LGECs cultivados con 2C mostraron alta proliferación, con una expresión elevada de tallo y marcadores de proliferación (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014, respectivamente]), y mantuvieron la morfología y la capacidad proliferativa incluso tras diez pasajes. Además, bajo condiciones 3D, los LGEC formaron esferoides con características tallo/progenitores, que se diferenciaron aún más en estructuras microglandulares que contenían múltiples tipos celulares LG (AQP5, K19, α-SMA-positivas) y funciones secretorias maduras tras la eliminación de 2C. Se espera que este enfoque proporcione una fuente estable de células semilla para la ingeniería tisular y ofrece un nuevo modelo in vitro para estudiar la fisiología LG.

Introducción

La glándula lagrimal (LG) es esencial para producir la capa acuosa de la película lagrimal, que es crucial para mantener la homeostasis de la superficieocular 1. La disfunción del LG, causada por lesión o inflamación, provoca la enfermedad ocular seca con deficiencia acuosa (ADDE). Esta condición puede provocar inflamación severa de la superficie ocular, enfermedad crónica de la córnea y, en casos graves, pérdida permanentede visión 2. Los tratamientos actuales para la ADDE gestionan principalmente los síntomas, sin abordar la disfunción glandular subyacente, que limita su eficaciaa largo plazo 1. El desarrollo de terapias dirigidas para la disfunción LG presenta varios desafíos, incluyendo la falta de modelos in vitro simples y a largo plazo, que limitan la comprensión de la fisiopatología LG y dificultan el desarrollo de terapias eficaces. Aunque el trasplante celular ha demostrado potencial para promover la regeneración LG, la limitada capacidad de expansión de las células in vitro y la complejidad de los sistemas de cultivo existentes presentan obstáculos significativos para la aplicaciónclínica 1,3. Por ello, establecer un sistema de cultivo sencillo y a largo plazo para LGs adultos de ratones es esencial para avanzar en la comprensión de la fisiología y patología LG, así como para proporcionar una fuente fiable de células madre/progenitoras LG para la reparación y regeneración de lesiones LG.

Los sistemas existentes de cultivo in vitro para LG han avanzado significativamente, pero aún enfrentan limitaciones notables. Muchos de estos métodos se basan en medios suplementados con suero, lo que introduce varios problemas como la variabilidad de lote a lote, componentes indefinidos y el riesgo de contaminación por fibroblastos o célulasmesenquimales 4,5,6,7,8. Además, los sistemas basados en suero no son adecuados para estudiar los mecanismos patógenos de las enfermedades LG y plantean desafíos para las terapias de trasplante celular debido a los posibles riesgos de rechazoinmunitario. En respuesta a estas limitaciones, se han desarrollado varios métodos sin suero para cultivar células epiteliales LG (LGECs) tanto de ratones como de humanos. Por ejemplo, Ueda et al. emplearon con éxito un método sin suero para cultivar LGECs de ratones reciénnacidos 10. Sin embargo, este método estaba limitado por la imposibilidad de pasar las células por subcultivos y la necesidad de un gran número de glándulas neonatales para obtener suficientes LGECs. De manera similar, Kobayashi et al. desarrollaron un sistema de cultivo libre de suero con toxina del cólera, pero enfrentaron dificultades para mantener la morfología celular durante el paso11. Entre los avances recientes se encuentran el desarrollo por parte de Zhang et al. de un sistema de cultivo 3D para células madre LG de ratón y el sistema de cultivo de organoides LG de Bannier-Hélaouët et al. para ratones y humanos 12,13,14,15. Sin embargo, estos sistemas dependen de formulaciones complejas de medios con múltiples moléculas pequeñas, factores de crecimiento y aditivos, lo que complica el proceso de cultivo y limita la escalabilidad. Estos desafíos ponen de manifiesto la necesidad de un sistema de cultivo sin suero simplificado y eficaz que pueda facilitar la expansión eficiente de las LGEC, manteniendo al mismo tiempo sus características proliferativas y de tallo/progenitor para futuras aplicaciones terapéuticas e investigaciones.

En los últimos años, el rápido desarrollo de la reprogramación química mediada por pequeñas moléculas ha introducido nuevas estrategias para mantener y expandir las células adultas primarias invitro 16. Al regular las vías de señalización intracelular, las interacciones célula-matriz y la adhesión celular, las moléculas pequeñas aumentan significativamente la proliferación y plasticidad celular, mejorando la eficiencia de expansión celular y el control deldestino 17. Debido a su producción controlable, baja inmunogenicidad e integración no genómica, las moléculas pequeñas son ideales para construir sistemas in vitro para células epiteliales adultas enexpansión 16. Se ha demostrado que las combinaciones de diferentes moléculas pequeñas mantienen eficazmente la expansión in vitro de varios tipos celulares primarios, incluyendo células madre epiteliales de la piel, córneas yconjuntivales 18,19,20. Por lo tanto, desarrollar una estrategia basada en pequeñas moléculas para expandir las LGEC muestra potencial para futuras aplicaciones tanto en entornos de investigación como terapéuticos.

En este protocolo se desarrolló un sistema de cultivo sin suero sencillo y eficiente utilizando dos moléculas pequeñas, Y27632 y SB431542 (2C), para apoyar la expansión de LGECs. Combinando las ventajas de estas dos moléculas, se estableció un sistema sin suero tanto para cultivos 2D como 3D. Los LGEC cultivados con 2C mostraron alta capacidad proliferativa y características de células tallo/progenitoras, manteniendo la morfología epitelial típica tras al menos 10 pasajes in vitro. En el cultivo 3D, los LGEC no solo conservaron características de células tallo/progenitoras, sino que también mostraron la capacidad de diferenciarse aún más en estructuras secretoras tras la eliminación de 2C, formando estructuras microglandulares con función secretora. Este sistema sin suero es adecuado para modelos in vitro de fisiología y patología LG, además de proporcionar una fuente sustancial de células para la ingeniería de tejidos LG y aplicaciones regenerativas. Sin embargo, el protocolo actual solo ofrece una exploración preliminar de la cultura 3D. La cultura 3D a largo plazo está fuera del alcance de esta investigación en esta etapa. Es importante señalar que este método está diseñado específicamente para LGECs de ratones adultos y puede no ser aplicable a otras especies sin una optimización adicional.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento con las normativas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) y el Comité de Ética Experimental de Animales de la Universidad de Jilin y la Universidad de Xiamen.

NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular se realizaron en un armario de bioseguridad esterilizado con rayos UV en la sala de operaciones celulares.

1. Cultura primaria de LGECs

  1. Aislamiento del tejido LG
    1. Eutanasiar ratones anestesiados C57BL/6J (6-8 semanas) mediante luxación cervical y desinfectar la zona del oído (alrededor del LG) con etanol al 75% para evitar la contaminación.
    2. Haz una incisión desde el canto externo hasta la piel bajo la oreja para exponer el LG. Utilizando pinzas y tijeras lisas y estériles, separa cuidadosamente el LG del tejido circundante (glándulas parótidas y tejido conectivo) bajo un microscopio de disección para obtener el LG.
    3. Colocar el LG en un medio de recogida de tejido preenfriado (DMEM con 10% de penicilina-estreptomicina-anfotericina) en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL, manteniendo el tejido sobre hielo para minimizar la degradación.
  2. Preparación de tejidos
    1. Transfiere los LG a un nuevo medio de recogida de tejido frío en un plato de 3,5 cm.
    2. Elimina cualquier pelo residual del ratón y luego despega la cápsula de tejido conectivo que rodea los LGs. Aísla el tejido glandular usando pinzas lisas para eliminar el tejido conectivo entre los lóbulos.
      NOTA: Asegúrese de que la cápsula en la superficie del LG y el tejido conectivo entre los lóbulos estén completamente eliminados para exponer los conductos entre los lóbulos, lo que facilitará la penetración de la solución digestiva durante el proceso digestivo posterior.
    3. Transfiere el tejido a un nuevo medio de recogida y lávalo durante 5-10 minutos para evitar contaminaciones.
  3. Digestión enzimática
    1. Coloque los LG en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contiene solución digestiva (medio sin suero suplementado con 2 mg/mL de Dispasa II y 2 mg/mL de Colagenasa A). (Tabla suplementaria 1).
      NOTA: Se requiere 1 mL de solución digestiva para 4 LG.
    2. Disecciona finamente el tejido LG usando microtijeras en pequeños trozos (aproximadamente 0,5-1 mm³) dentro del tubo.
    3. Incubar el tubo de la microcentrífuga a 37 °C con 5% deCO2 durante 2,5-3 horas. Cada 30-60 minutos, mezcla suavemente el tejido en la solución digestiva para asegurar una digestión enzimática completa.
  4. Aislamiento y explotación de LGECs
    1. Sacude el tubo de la microcentrífuga varias veces al completar el tiempo de digestión. Pipetear la solución digestiva varias veces para descomponer el tejido en células individuales o pequeños grupos celulares. Observa bajo un microscopio para confirmar el progreso de la digestión.
      NOTA: Cuando no quedan partículas visibles en la solución digestiva y se observan grandes cantidades de células individuales, así como agregados celulares en forma de conducto, bajo el microscopio, el proceso digestivo se detiene.
    2. Centrifuga el tubo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego descarta el medio digestivo.
    3. Resuspende el pellet celular en 1 mL de DPBS estéril y centrifuga de nuevo a 1000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier enzima digestiva restante.
    4. Repite el paso 1.4.3, retira el sobrenadante y vuelve a suspender la pelota celular en 500 μL de medio sin suero.
  5. Siembra y cultivo primario de LGECs
    1. Prepara el medio de cultivo LGECs suplementando con un medio sin suero con penicilina-estreptomicina al 1% y 2C (10 μM Y27632 y 10 μM SB431542). (Tabla Suplementaria 1)
    2. Siembra las células en placas de cultivo estándar sin tratar de 24 pozos a una densidad de 7,5 x 10³ células/cm² utilizando un medio 2C libre de suero.
    3. Después de la siembra, golpea suavemente los bordes de la placa de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células. Coloca la placa en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
    4. Cambia el medio de cultivo por primera vez 72 horas después de la siembra. Después, cambia el medio cada 2-3 días.
      NOTA: Evita perturbar la cultura durante las primeras 72 horas. Para el primer cambio de medio, no laves las células con DPBS. Simplemente quita el medio viejo y añade medium fresco.

2. Subcultura de LGECs

NOTA: Subcultivo cuando la confluencia celular alcanza el 80-90%, lo que normalmente ocurre aproximadamente 14 días después del cultivo primario.

  1. Retira el medio de cultivo y lava suavemente las células dos veces con DPBS estéril.
  2. Añade 250 μL de tripsina-EDTA al 0,25% e incuba a 37 °C con 5% deCO2 durante 10-15 minutos. Una vez que las uniones tensas se disocian y las células se redondean, añade un volumen igual de solución inhibidora de tripsina definida para terminar la digestión.
    NOTA: Si durante el cultivo primario se observan células adherentes planas y grandes, trate el cultivo con 0,25% de Tripsina-EDTA durante 5 minutos para eliminar estas células heterogéneas. Luego, tratar el cultivo de nuevo con 0,25% de Tripsina-EDTA durante 5 minutos adicionales para digerir más y obtener una población más pura de LGECs para su posterior paso.
  3. Mezcla la suspensión de celda pipeteando con una pipeta de 1 mL, luego transfiere a un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifuga a 1000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante.
  4. Lava las células con DPBS estéril y vuelve a centrífuga para recoger los LGECs.
  5. Resuspende los LGEC en medio de cultivo 2C y semilla en una proporción 1:2 para subcultivo. Mezcla suavemente las células agitando la plancha de cultivo e incuba a 37 °C con un 5% de CO2.
    NOTA: Subcultivar en una proporción 1:2 significa que, una vez que la confluencia celular alcanza el 80-90%, los LGECs se digieren de una placa de pozo y se distribuyen uniformemente en dos nuevas placas de pozo.
  6. Cambia el medio el tercer día después de la siembra, y luego cambia el medio cada 2-3 días, dependiendo del estado de la célula.
  7. Observa la morfología celular diariamente bajo un microscopio de contraste de fase invertido y documenta con fotografías.

3. Cultura tridimensional (3D) de LGECs

NOTA: El experimento de cultivo 3D utiliza LGECs P1. Cuando los LGEC P1 alcanzan una confluencia del 80-90% tras 7 días de cultivo con 2C, se utilizan para cultivo 3D.

  1. Pasos de preparación
    1. Transfiere el gel matriz (Tabla Suplementaria 1) del congelador a -20 °C a un frigorífico de 4 °C para descongelarlo durante la noche.
    2. Coloca las puntas de la pipeta necesarias en el congelador a -20 °C para asegurar un enfriamiento previo adecuado.
    3. Precalienta la placa de cultivo de 24 pozos colocándola enuna incubadora de 37 °C y 5% de CO 2 horas antes de comenzar el cultivo 3D.
    4. Prepara una nevera y coloca varios tubos microcentrífugas de 1,5 mL para preenfriarla. Esteriliza la nevera en un armario de bioseguridad antes de usarla.
  2. Cultura 3D de LGECs
    1. Obtén LGECs P1, tal y como se describe en los pasos 2.1 a 2.4.
    2. Resuspende el pellet celular en un medio de cultivo 2C y ajusta la densidad celular a 1 × 10⁴ celdas por 10 μL.
    3. Toma el gel de matriz descongelado del frigorífico de 4 °C y las puntas de la pipeta preenfriadas del congelador a -20 °C, y colócalos en la nevera dentro del armario de bioseguridad.
    4. Retira la placa de cultivo precalentada de 24 pozos de la incubadora y colócala en el armario de bioseguridad.
    5. Añade un volumen adecuado de la suspensión de celdas, mezclado con gel matricial en una proporción 1:1, usando puntas de pipeta preenfriadas. Mezcla suavemente para asegurar una distribución uniforme.
    6. Pipetear 20 μL de la mezcla del paso 3.2.5 cuidadosamente en el centro de cada pozo de la placa precalentada de 24 pozos.
    7. Invierte la placa e incuba en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 minutos para permitir que el gel de matriz se solidifique.
    8. Una vez que el gel de matriz se ha solidificado, añade 600 μL de medio de cultivo 2C a cada pozo.
    9. Incubar la placa de cultivo en una incubadora de 37 °C y 5% de CO2 durante 14 días. Cambia el medio el día 3 después de sembrar y cada 2-3 días después, dependiendo del estado de la célula.
    10. Observa diariamente la formación de esferoides 3D bajo un microscopio de contraste de fase invertido y captura imágenes para documentación.
  3. Diferenciación de esferoides LGEC 3D
    1. Cultivar esferoides LGEC 3D como se describe en el paso 3.2.
    2. Después de 7 días de cultivo, retira el medio de cultivo de 2 °C y lava suavemente las células dos veces con DPBS para eliminar los 2°C residuales. Ten cuidado de no alterar el gel de la matriz.
    3. Añade un medio sin suero sin 2°C (nulo) y continúa el cultivo durante 7 días adicionales para inducir la diferenciación.
    4. Cambia el medio cada 2-3 días durante el periodo de cultivo.
    5. Observa diariamente los cambios morfológicos de los esferoides 3D inducidos bajo un microscopio de contraste de fase invertido y captura imágenes para su documentación.

4. Incrustación y sección congelada de esferoides LGEC 3D diferenciados

NOTA: La diferenciación de los esferoides 3D se induce como se describe en la sección 3.3. Tras 7 días de diferenciación, sigue los pasos siguientes para la incrustación óptima a temperatura de corte (OCT) y la sección congelada de los esferoides 3D diferenciados.

  1. Aspira el medio de cultivo a lo largo de los bordes del pozo. Lava suavemente los esferoides diferenciados tres veces con DPBS estéril.
  2. Añade 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) al pozo en un armario de bioseguridad o campana extractora y fija los esferoides a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  3. Lava los esferoides suavemente tres veces con DPBS estéril, cada lavado durando 10 minutos para eliminar el fijador.
  4. Utiliza una espátula para raspar cuidadosamente la estructura de gel en forma de domo de matriz esferoide 3D y transfierela a un tubo microcentrífuga de 5 mL que contiene un 20% de solución de sacarosa.
  5. Incuba el tubo durante la noche a 4 °C hasta que la estructura de la cúpula se asiente en el fondo del tubo.
  6. Retira la estructura de la cúpula de la solución de sacarosa, elimina cuidadosamente cualquier residuo de sacarosa e incorpórala en el compuesto OCT. Congela en nitrógeno líquido y guarda a -80 °C.
  7. Antes de teñir, prepara secciones de 10 μm de grosor usando un microtomo congelante.

5. Detección de funciones de secreción de esferoides LGEC 3D diferenciados

  1. Recogida de muestras
    1. Inducir la diferenciación de esferoides 3D tal como se describe en la sección 3.3.
    2. Tras 7 días de diferenciación, retira el medio de cultivo y lava los esferoides 3D tres veces con DPBS.
    3. Añade 500 μL de medio sin suero sin 2C e incuba a 37 °C con 5% deCO2 durante 2 horas.
    4. Recoge el medio de cultivo y transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL como muestra base para medir la concentración de lactoferrina (LTF) antes de la estimulación con pilocarpino.
    5. Lava los esferoides 3D suavemente tres veces con DPBS estéril.
    6. Añade 500 μL de medio libre de suero que contiene 1 μg/mL de pilocarpina e incuba los esferoides 3D a 37 °C con un 5% deCO2 durante 24 horas.
    7. Tras la incubación, recoge el medio de cultivo en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL (para medir la concentración de LTF tras la estimulación de pilocarpina).
    8. Centrifuga las muestras del medio de cultivo recogidas a 4 °C a 1000 × g durante 20 minutos. Recoge el sobrenadante y guárdalo a -80 °C para usarlo después.
  2. Dilución de la muestra
    1. Saca las muestras del congelador a -80 °C y déjalas descongelarse completamente a temperatura ambiente.
    2. Toma 5 μL de la muestra y dilúyela con 495 μL de tampón de dilución de muestra del kit de ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) para preparar una dilución de 100 veces.
  3. Preparación del reactivo
    1. Lleva todos los reactivos del kit ELISA a temperatura ambiente 20 minutos antes de usarlos.
    2. Preparar el tampón de lavado: Calcular la cantidad requerida en función del número de muestras y diluir el tampón concentrado con agua destilada (1:24).
    3. Prepara la solución estándar de funcionamiento:
      1. Centrifugar el estándar liofilizado a 10.000 × g durante 1 minuto. Añade 1 mL de Reference Standard y Sample Diluent, déjalo reposar 10 minutos y invierte suavemente varias veces.
      2. Cuando se disuelva completamente, mézclalo bien con una pipeta. Esta reconstitución produce una solución funcional de 2000 pg/mL.
    4. Haz diluciones en serie según las instrucciones del kit para preparar el siguiente gradiente estándar de concentración: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Prepara la solución activa de anticuerpos de detección biotinilada:
      1. Calcula el volumen requerido para el ensayo (50 μL/pozo). Centrifugar el anticuerpo de detección biotinilado concentrado a 800 × g durante 1 minuto, luego diluir el anticuerpo de detección biotinilado concentrado al 50× en una solución operativa de 1× utilizando diluyente de anticuerpos biotinilados.
      2. Prepara la solución justo antes de usarla, haciendo un poco más de la cantidad calculada, normalmente añadiendo entre 100 y 200 μL más de lo necesario.
    6. Prepara la solución de trabajo conjugada de peroxidasa de rábano picante (HRP):
      1. Calcular el volumen requerido para el experimento (50 μL/pozo). Centrifuga el conjugado concentrado de HRP a 800 × g durante 1 minuto, luego dilúyelo hasta una concentración de trabajo 1x usando diluyente conjugado HRP.
      2. Prepara la solución justo antes de usarla, haciendo un poco más de la cantidad calculada, normalmente añadiendo entre 100 y 200 μL más de lo necesario.
  4. Procedimiento de ensayo ELISA
    1. Determina los pozos para el estándar diluido, el blanco y las muestras, con 3 réplicas para cada uno. Añadir 25 μL de la solución de trabajo estándar, solución en blanco o de muestra diluida en los pozos correspondientes. Cubre la placa con el sellador que viene en el kit y incuba a 37 °C durante 90 minutos.
      NOTA: Se deben añadir soluciones en la parte inferior del pozo de la placa micro ELISA. Evita tocar la pared interior y causar espuma tanto como sea posible.
    2. Decantar el líquido de los pozos sin lavarlo. Añadir inmediatamente 50 μL de la solución activa de anticuerpos de detección biotinilada a cada pozo. Cubre la placa con un sellador nuevo e incuba a 37 °C durante 60 minutos.
    3. Decanta el líquido de los pozos y añade 350 μL de tampón de lavado preparado a cada pozo. Remojo durante 1 minuto, luego aspira o decanta el líquido de cada pozo y sécalo con papel absorbente limpio. Repite este paso de lavado 3 veces.
      NOTA: No permitas que los pozos se sequen durante el proceso de lavado.
    4. Añade 50 μL de la solución de trabajo conjugada HRP preparada a cada pozo. Cubre la placa con un nuevo sellador e incuba a 37 °C durante 30 minutos.
    5. Decantar el líquido de los pozos y repetir el proceso de lavado cinco veces con tampón de lavado como se describe en el paso 5.4.3.
    6. Añade 50 μL de reactivo de sustrato a cada pozo. Cubre la placa con un nuevo sellador e incuba a 37 °C en la oscuridad durante 15 minutos.
    7. Añadir 25 μL de solución de parada a cada pozo para terminar la reacción. Asegúrate de que la solución de parada se añada en el mismo orden que la solución de sustrato.
    8. Determinar la densidad óptica (valor OD) de cada pozo inmediatamente a 450 nm usando un lector de microplacas.

6. Aislamiento de ARN

  1. Recogida de muestras
    1. Para tejido LG
      1. Aislar el tejido LG extraorbitario de ratones adultos como se describe en las secciones 1.1.2-1.1.2.
      2. Sumerge el tejido LG recién aislado en PBS para eliminar cualquier sangre.
      3. Seca la humedad superficial del LG con papel filtro y coloca el tejido en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de reactivo de extracción de ARN (Tabla suplementaria 1), manteniendo el tubo en hielo.
        NOTA: Realizar pasos de molienda antes de la extracción de ARN para asegurar la lisis completa del tejido.
      4. Añade dos bolas de molienda de acero limpias al tubo de la microcentrífuga y luego coloca el tubo en un molinillo de alta velocidad y baja temperatura preenfriado.
      5. Ajusta los parámetros del molinillo: frecuencia 70 Hz, tiempo de molienda 45 s, tiempo de pausa 15 s y repite durante 10 ciclos. Aprieta la maneta de la tapa del molinillo y empieza a moler.
      6. Coloque el tubo sobre hielo o guárdalo a -80 °C para la extracción posterior de ARN una vez completado el proceso de molienda.
    2. Para LGECs
      1. Retira el medio de cultivo y lava las células tres veces con DPBS estéril cuando los LGECs alcancen una confluencia del 80-90%.
      2. Añade 600 μL de reactivo de extracción de ARN a cada pozo (para una placa de 24 pozos) e incuba a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
      3. Utilice una pipeta de 1 mL para hacer repetidamente la solución de reactivo de extracción de ARN en cada pozo y así asegurar la lisis celular completa.
      4. Transfiere la solución a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      5. Coloca el tubo sobre hielo o guárdalo a -80 °C para la posterior extracción de ARN.
    3. Para esferoides LGEC 3D
      1. Recoge esferoides 3D LGEC indiferenciados y diferenciados cultivados durante 14 días, tal y como se describe en los pasos 3.2-3.3. Añadir 1 mL de solución digestiva (medio sin suero que contiene 1 mg/mL Dispase II) en cada pozo, asegurando que la estructura de gel en forma de cúpula en forma de matriz esferoide 3D esté completamente cubierta. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 30 minutos.
      2. Transfiere la solución digestiva que contiene los esferoides 3D a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL usando una pipeta de 1 mL. Centrifugar a 1000 × g durante 3 minutos para recoger la cápsula esferoide.
      3. Lava el pellet con 1 mL de DPBS y centrifuga a 1000 × g durante 3 minutos para recoger el pellet de nuevo.
      4. Añade 600 μL de reactivo de extracción de ARN (por cada 20 μL de gel matricial) e incuba a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
      5. Mezcla bien con una pipeta de 1 mL para asegurar la lisis completa de los esferoides 3D.
      6. Coloca el tubo sobre hielo o guárdalo a -80 °C para la posterior extracción de ARN.
  2. Extracción de ARN
    NOTA: Llevar el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, mascarilla) y realizar todos los procedimientos que impliquen cloroformo e isopropanol en una campana extractora. Eliminar los flujos de residuos químicos en contenedores designados para residuos peligrosos etiquetados para la generación de residuos peligrosos, siguiendo los protocolos institucionales de eliminación de residuos.
    1. Añadir cloroformo (1/5 volumen del reactivo de extracción de ARN) al tubo de la centrífuga que contiene la muestra de ARN en el reactivo de extracción de ARN (del paso 6.1).
      NOTA: Realiza el procedimiento en una campana extractora.
    2. Mezcla bien usando un vórtice e incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta la separación de fase.
    3. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Tras la centrifugación, el líquido se separará en tres capas, con ARN en la fase acuosa transparente más alta.
    4. Prepara un nuevo tubo de centrífuga libre de RNasa de 1,5 mL y añade isopropanol (la mitad del volumen del reactivo de extracción de ARN) en una campana extractora.
    5. Pipetear cuidadosamente la fase acuosa transparente superior (la mitad del volumen del reactivo de extracción de ARN) en el nuevo tubo libre de RNasa.
      NOTA: Ten cuidado de no contaminar la capa intermedia al pipetear.
    6. Invierte el tubo varias veces para mezclarlo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego centrifuga de nuevo a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
    7. Desecha el sobrenadante y añade 500 μL de etanol al 75% para lavar el pellet invirtiendo el tubo. Centrifugar de nuevo a 14.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
    8. Repite el paso 6.2.7. Desecha el sobrenadante y realiza una centrifugación rápida para eliminar cualquier líquido residual.
    9. Coloca el tubo sobre hielo en la campana extractora, abre la tapa y déjalo secar al aire durante 10-20 minutos hasta que el pellet blanco se vuelva semitransparente.
    10. Añade 20 μL de agua libre de RNasa para disolver el pellet. Mide la concentración y pureza del ARN usando un espectrofotómetro.
      NOTA: Si la concentración de ARN es demasiado alta, diluir con una cantidad adecuada de agua libre de RNasa.
    11. Coloca la solución de ARN sobre hielo o guárdala a -80 °C para el proceso posterior de transcripción inversa.

7. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)

  1. Transcripción inversa
    1. Añadir los siguientes componentes en secuencia al tubo de reacción PCR según las instrucciones del fabricante: 800 ng de ARN total (calcular el volumen según su concentración), 4 μL de SuperMix 5x All-in-One para q-PCR, 1 μL de removedor de ADNG y agua libre de RNasa para llevar el volumen total a 20 μL.
    2. Mezcla suavemente los componentes. Ajusta la máquina de PCR a las siguientes condiciones: 55 °C durante 6 minutos, 80 °C durante 1 minuto y luego 12 °C indefinidamente.
    3. Almacena el ADNc a -20 °C o mantenlo en hielo para el proceso qRT-PCR una vez completada la reacción de transcripción inversa.
  2. qRT-PCR
    1. Prepara la solución de premezcla qRT-PCR para dirigirse a diferentes genes de la siguiente manera: 5 μL de 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL de cebador directo (10 μM), 0,2 μL de cebador inverso (10 μM) y 3,6 μL de agua sin nucleasa. Mezcla suavemente y colócala sobre hielo.
    2. Añadir 9 μL de la premezcla qRT-PCR (preparada en el paso 7.2.1) y 1 μL de ADNc (preparado en el paso 7.1) en los tubos qRT-PCR según el diseño experimental.
    3. Centrifuga los tubos a 1000 × g a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    4. Coloca los tubos en la máquina de PCR cuantitativa de fluorescencia para su detección.
      NOTA: Utilice un método de tres pasos con el siguiente programa según las instrucciones del fabricante del reactivo: 94 °C durante 30 s, 94 °C durante 5 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 10 s. Empieza a pedalear desde el paso 2 durante 40-45 ciclos.
    5. Realizar análisis cuantitativo utilizando el método comparativo de TC (2-ΔΔCt).
      NOTA: Cada conjunto de datos debe repetirse al menos tres veces independientes para garantizar la fiabilidad de los resultados.

8. Tinción por inmunofluorescencia

NOTA: La tinción por inmunofluorescencia se realiza en LGECs cultivadas en placas de 24 pozos con tasas de confluencia del 70-80% o en secciones congeladas de estructuras 3D diferenciadas de LGECs.

  1. Para LGECs
    1. Retira el medio de cultivo de los pozos y lava las células tres veces con PBS.
    2. Añade 500 μL de PFA al 4% a cada pozo en un armario de bioseguridad o campana extractora e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar las células.
    3. Lava las células tres veces con PBS, cada lavado durando 5 minutos.
    4. Añade 500 μL de Triton X-100 al 0,2% para cubrir las células e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para permeabilizar la membrana celular.
    5. Lava las células tres veces con PBS, cada lavado durando 10 minutos.
    6. Retirar el PBS y utilizar un marcador inmunohistoquímico para dibujar un círculo alrededor de cada pozo de la placa de 24 pozos. Añade 50 μL de BSA al 2% a cada pozo para cubrir las celdas. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear.
    7. Retirar el BSA y añadir 50 μL del anticuerpo primario diluido (Tabla suplementaria 1) para cubrir los LGECs. Incubar a 4 °C durante 16-18 horas.
    8. Retira el anticuerpo primario y repite el paso 8.1.5.
    9. Añade 50 μL de anticuerpo secundario fluorescente a cada pozo para cubrir las LGEC. Incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora.
    10. Repite el paso 8.1.5, evitando la exposición a la luz.
    11. Añade 50 μL de solución 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para cubrir las LGECs y observa la tinción bajo un microscopio de fluorescencia.
  2. Para esferoides LGEC 3D
    1. Prepara las secciones congeladas de esferoides LGEC 3D como se describe en el paso 4. Realizar la tinción por inmunofluorescencia según se indica en los pasos 8.1.2-8.1.11.

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Resultados

Establecer un sistema de cultivo de LGECs sin suero usando 2C
En este protocolo, el objetivo era establecer un sistema de cultivo más sencillo y eficiente para expandir los LGECs primarios del ratón. Tras un extenso cribado, se desarrolló con éxito una combinación 2C sin suero, compuesta únicamente por Y27632 y SB431542, que permitió la expansión in vitro a largo plazo de las LGEC. Tras una digestión enzimática mixta, las LGECs primarias comenzaron a adherirs...

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Discusión

Como se describe en la Introducción, en los últimos años se han desarrollado varios sistemas de cultivo sin suero para célulasLG 10, 11, 12, 13. Sin embargo, muchos de estos métodos presentan limitaciones, incluyendo una pobre proliferación celular y la incapacidad para lograr una expansión a gran escala in vitro10,11...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82471048, 82271045); el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20240813145510014); el Proyecto Especial de Talentos en Investigación en Salud de la Provincia de Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); y el Proyecto de Desarrollo Científico y Tecnológico de la provincia de Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
 -20° C Frigorífico de ultra baja temperaturaHaier
 -80° C Frigorífico de ultra baja temperaturaHaier
0,25% de tripsina-EDTAGibco25200056
1,5 mL tubo de microcentrífuga  KirgenKG2211Libre de Rnase
Plato de cultivo celular de 35 mmLABSELECT12111
4 & deg; Frigorífico CHaier
4% de paraformaldehído (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Yeasen708939ES03Almacenar a -20 y grados; C, estopa a 1 mg/mL, 500x, diluir a 1x con 1x PBS
Tubo centrífugo de 5 mL y nbsp;ACMECAC17457
Tubo de centrífuga de 50 mL yLABSELECTCT-002-50-SS
Anticuerpo anti-alfa actina de conejo para músculo lisoAbcamAB5694Diluir con el buffer de dilución de anticuerpos a 1:100 
Anticuerpo anti-AQP5 del conejo  ABclonalA9927Diluir con el buffer de dilución de anticuerpos a 1:100 
Anticuerpo anticitoqueratina 14 en el conejoAbcamab181595Diluye con el tampón de dilución de anticuerpos a 1:200 
Anticitoqueratina 19  Anticuerpo de conejoAbcamAB52625Diluir con el buffer de dilución de anticuerpos a 1:400 
Anticuerpo anti-Ki67 del conejoAbcama.16667Diluye con el tampón de dilución de anticuerpos a 1:200 
Armario de bioseguridadSterilGARD
Alpómina sérica bovina (BSA) y nbsp;Yeasen36101ES60Tienda en 4° C
Ratones C57BL/6JCentro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Xiamen
Placa de cultivo celularLABSELECT1131224-pozo
Incubadora celularEppendorf
CentrifugadoraEppendorf
CloroformoHUSHI10006818PRECAUCIÓN, Realizando operaciones en una campana extractora
CO2  Incubadora de temperatura constanteEppendorf
Colagenasa ARoche10103586001Almacenar a -20 y grados; C, culata a 200 mg/mL, 100x
Solución definida de inhibidor de tripsina (DTI)GibcoR007100
Kit completo de medio de queratinocitos DermaLife K (medio sin suero) Línea de vidaLL-0007Tienda en 4 y grados; C
D-HanksBiosharpBL559A y nbsp;Utilizado para diluir Dispase II
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD4540Usado para diluir Y27632 y SB431542
Dispasa IISigmaD4693Almacenar a -20 y grados; C, culata a 200 mg/mL, 100x
DMEM básico (1X)GibcoC11995500BT
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Diluye con el tampón de dilución de anticuerpos a 1:300
Suero salino con fosfato tamponado de Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Absoluto del etanolHUSHI10009218PRECAUCIÓN, Úsalo para preparar otras diluciones de etanol  
Microtomo de congelaciónLeica
Molinillo de alta velocidad y baja temperaturaServicebio
Microscopio de fluorescencia invertidaLeica
Microscopio invertidoOlimpo
Isopropanol HUSHI80109270
Microscopio Confocal de Escaneo Láser FV3000OLYMPUS
Centrífuga de baja temperatura y alta velocidadEppendorf
Kit de ensayo inmunoabsorbente enzimático ligado a la LTF (ELISA)  ElabscienceE-MSEL-M0047Almacenar a -20 y grados; C
Gel de matriz (Matrigel)82703MogengelAlitera y almacena a -20 y grados; C
MicropipetadorEppendorf
Lector de microplacasThermo Fisher Scientific
Agua libre de nucleasasBiosharpBL510B
Compuesto OCTScigen4586
PBS,1 y horarios; (pH7.4)ServicebioG4202
Amplificador de PCRBIO-RAD
Penicilina-estreptomicinaBiosharpBL505A
Penicilina-Estreptomicina-AnfotericinaBiosharpBL142A
Kit PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Almacenar a -20 y grados; C
PerfectStart Uni RT& Kit qPCRTransGen BiotechAUQ-01Almacenar a -20 y grados; C
Pilocarpina y pilocarpina;AladdínP424663Almacenar a -20 y grados; C, 2500x
Cebador AQP5  secuencia:
Adelante:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Reverso:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Imprimador K14  secuencia:
Adelante:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Reversa: AAGCCTGAGCAGGTAGCAG		Sangon Biotech
Imprimador K15  secuencia:
Adelante:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Reverso:TCTGAGCCTCCATCTAC
AG		Sangon Biotech
Imprimador K19  secuencia:
Adelante:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Reverso:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Cebador K5  secuencia:
Adelante:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Reversa:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Imprimador Ki67  secuencia:
Adelante:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Reversa:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  secuencia:
Adelante:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Reversa:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Cebador P63  secuencia:
Adelante: ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Reversa: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Cebador SOX10  secuencia:
Adelante:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Reversa:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer α-SMA  secuencia:
Adelante:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Reverso:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo realRoche
Reactivo de extracción total de ARN aislador de ARNVazymeR401-01PRECAUCIÓN, Realizando operaciones en una campana extractora
SB431542 ApexbioA8249Almacenar a -20 y grados; C, de serie a 20 mM, 2000x
Espectrofotómetro NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificMedir la concentración de ARN
SacarosaMacklinS818046Disolver con agua destilada
Triton X-100SolarbioT8200
Sistema de purificación de agua ultra puraMillipore
Amortiguador universal de dilución de anticuerposEpizimaPS119Tienda en 4 y grados; C
Y27632 ApexbioB1293Almacenar a -20 y grados; C, de serie a 20 mM, 2000x

Referencias

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