Aquí presentamos un protocolo para evaluar la actividad sinérgica de la fosfomicina en combinación con ceftriaxona, meropenema y gentamicina frente a aislados de Escherichia coli resistentes a carbapenemos utilizando el método de dilución del agar. Se observó sinergia con meropenema y gentamicina, pero no con ceftriaxona.
Artículo de revisión
Protocolo para el análisis de tablero de addicciones por dilución de agar de combinaciones de antibióticos basadas en fosfomicina contra Escherichia coli resistente a carbabenemos
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Resumen
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Debido a las limitadas opciones de tratamiento para los Enterobacterales resistentes a carbapenemos, los regímenes de terapia combinada han cobrado cada vez más importancia. Este estudio tuvo como objetivo investigar las tasas de resistencia a la fosfomicina y evaluar las interacciones sinérgicas in vitro de la fosfomicina en combinación con meropenem, gentamicina y ceftriaxona frente a aislados de Escherichia coli resistentes a carbapenemos. Se incluyeron sesenta cepas de E. coli resistentes a los carbabenós, aisladas de diversas muestras clínicas (orina, sangre, aspiración, herida, líquido cefalorraquídeo, aspiración endotraqueal) obtenidas de pacientes en las plantas clínicas y unidades de cuidados intensivos de los hospitales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Digle. La identificación de especies se realizó mediante un sistema automatizado de identificación microbiana. Se realizaron pruebas de susceptibilidad a antibióticos y confirmación de resistencia a los carbapenemas mediante difusión discal con ertapenem, imipenem y meropenem. La resistencia a la fosfomicina y las interacciones entre antibióticos se evaluaron mediante dilución de agar. Además, se evaluaron combinaciones de antibióticos a través de gradientes de concentración dobles en serie utilizando el protocolo basado en dilución de agar, y se calcularon índices fraccionarios de concentración inhibitoria (IC) para determinar sinergia, indiferencia o antagonismo. Las tasas de resistencia fueron del 76,6% para fosfomicina, 61,6% para meropenem, 85,0% para gentamicina y 98,3% para ceftriaxona. Se observaron interacciones sinérgicas en el 35% de los aislados para la combinación fosfomicina–meropenem, el 33,4% para la combinación fosfomicina–gentamicina y el 1,7% para la combinación fosfomicina–ceftriaxona. Solo se detectó antagonismo en un aislado de la combinación fosfomicina–meropenem. Las combinaciones de fosfomicina con meropenema y gentamicina mostraron actividad sinérgica in vitro contra E. coli resistente a los carbapenemos. Se requieren más estudios in vitro para confirmar estos hallazgos.
Introducción
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La familia Enterobacterales comprende un grupo muy diverso de bacilos gramnegativos, muchos de los cuales tienen una importancia clínicasignificativa 1. Entre ellas, Escherichia coli es la especie más aislada en los laboratorios clínicos de microbiología y está ampliamente asociada con infecciones que afectan a casi todos los sistemas orgánicos, incluyendo infecciones urinarias, infecciones de heridas, neumonía en pacientes inmunodeprimidos, gastroenteritis y meningitis neonatal. También es una causa importante de sepsis Gram negativa y shock séptico mediado por endotoxinas. Más allá de la medicina humana, E. coli es también un patógeno veterinario importante, causando infecciones respiratorias y sistémicas en diversas especies animales, incluidos los equinos, ampliando la perspectiva del rango de hospedadores de la patogénesis de E. coli en hospedadoreshumanos y animales 2,3,4.
Los enterobacterales productores de beta-lactamasa de espectro extendido (ESBL), especialmente E. coli y Klebsiella pneumoniae, se han asociado con un aumento de la mortalidad, hospitalizaciones prolongadas y mayores costes sanitarios. El uso generalizado de antibióticos es un factor principal de la resistencia multirresponsable (MDR) entre estosorganismos 1. Los mecanismos de resistencia incluyen la producción de carbapenemasa, ESBLs, enzimas modificadoras de aminoglucósidos (AMEs), mutaciones que confieren resistencia a quinolonas y alteraciones en los sistemas de porinas y efluentes. En E. coli y Klebsiella pneumoniae, la resistencia es principalmente mediada por plásmidos, facilitando la transferencia horizontal de genes. Estos rasgos de resistencia también se reportan cada vez más en E. coli de origen animal, incluidos aislados de bovino, lo que apoya el concepto de One Health e indica un posible riesgo de transmisión zoonótica 2,3.
Los carbabenosos se consideran agentes de última línea para infecciones graves multirresistentes. Sin embargo, los Enterobacterales resistentes a los carbapenemas (CRE) han surgido como una importante preocupación sanitariaglobal 4. Esta resistencia está mediada principalmente por carbapenemasas, incluyendo metalo-beta-lactamasas de clase B, que contribuyen a fenotipos extensamente resistentes a medicamentos ypan-resistentes 5.
Las cepas MDR de E. coli limitan significativamente las opciones terapéuticas y complican el manejo de la infección. Esto subraya la necesidad de estrategias de tratamiento alternativas, como las terapias combinadas, para mejorar los resultados clínicos. Además, estas cepas resistentes se reportan cada vez más no solo en entornos clínicos, sino también en fuentes alimentarias como los productos lácteos. Esto amplía el contexto epidemiológico de la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos y apoya la terapia combinada como una estrategia potencial para mitigar su propagación e impactoclínico 6,7. Los aminoglucósidos, tigeciclina y polimixinas son agentes terapéuticos comúnmente utilizados en las infecciones porMDR 8. La fosfomicina también ha demostrado actividad contra E. coli productora de ESBL, especialmente en infeccionesurinarias.
La fosfomicina, descubierta por primera vez en 1969, inhibe la síntesis temprana de la pared celular bacteriana y ha resurgido como un agente prometedor en la terapiacombinada 10. Se han reportado efectos sinérgicos entre fosfomicina y aminoglucósidos o β-lactámicos en organismosMDR 11,12. Además, la fosfomicina ha sido evaluada en grandes cohortes clínicas, demostrando eficacia en infecciones graves cuando se usa sola o en regímenescombinados 13. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos incluyen poblaciones bacterianas heterogéneas, y los datos específicos sobre E. coli resistentes a los carbabenos siguen siendo limitados.
Los métodos estándar de prueba de susceptibilidad antimicrobiana incluyen la dilución de agar, la dilución de caldo y la difusión de disco. Las pruebas combinadas basadas en dilución de agar permiten la evaluación cuantitativa de las interacciones antimicrobianas mediante la determinación de los MICs y el cálculo de los FICI. Métodos alternativos como time-kill y difusión por gradiente proporcionan datos de interacción dinámica o simplificada, pero pueden diferir en reproducibilidad yestandarización 13,14. Este protocolo es más adecuado para la evaluación in vitro controlada de combinaciones definidas de antibióticos. Sin embargo, no refleja completamente las condiciones farmacocinéticas invivo 15. Entre ellas, la dilución de agar se considera un método de referencia para la determinación de la CIM; sin embargo, su uso para evaluar la actividad combinada de fosfomicina frente a E. coli resistente a los carbabenos sigue siendo limitado.
Este estudio proporciona una evaluación sistemática de combinaciones basadas en fosfomicina frente a aislados de E. coli resistentes a carbapenemas confirmados clínicamente. Se utilizó un enfoque estandarizado de tablero de ajedrez por dilución del agar, generando datos comparativos directos de interacción bajo condiciones controladas in vitro.
Por lo tanto, el presente estudio pone a prueba la hipótesis de que la fosfomicina en combinación con meropenem, gentamicina o ceftriaxona exhibe actividad sinérgica in vitro contra aislados de CRE E. coli.
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Revisión y perspectiva
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La aprobación para este estudio fue obtida por el Comité de Ética en Investigación Clínica No Intervencionista de la Facultad de Medicina de la Universidad Dicle (Decisión nº 100, Fecha: 01.01.2021).
El protocolo a continuación describe un método estandarizado de tablero de addicciones de dilución de agar para evaluar la sinergia de combinación de fosfomicina contra aislados de E. coli resistentes a carbapenemos.
Colección de aislados
Entre el 15.02.2021 y el 15.12.2021, se incluyeron un total de 60 cepas de E. coli resistentes a los carbapenemos, aisladas de diversas muestras clínicas (orina, sangre, aspiración, herida, líquido cefalorraquídeo y aspiración endotraqueal) obtenidas de pacientes hospitalizados en los hospitales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Digle. La identificación se realizó utilizando un sistema de espectrometría de masas MALDI-TOF. Cuando se recuperaron múltiples aislados del mismo paciente, solo se incluyó el primer aislado. Se excluyeron muestras de clínicas ambulatorias y pacientes hospitalizados por menos de 48 horas. Todos los aislados de E. coli resistentes a carbapenemas que cumplieron los criterios de inclusión predefinidos durante el periodo del estudio se incluyeron consecutivamente; Por lo tanto, el tamaño de la muestra se determinó por el número total de aislados elegibles disponibles y no se realizó un cálculo previo del tamaño de la muestra. Se usaron las cepas ATCC 13846 de E. coli y ATCC 25922 de E. coli como cepas de control de calidad. Las cepas de control de calidad se probaron en paralelo con aislados clínicos bajo condiciones idénticas de dilución de agar. Todas las pruebas fueron evaluadas por dos observadores independientes. Los resultados de las cepas de control de calidad mostraron patrones esperados de inhibición del crecimiento en todos los experimentos, y no se observaron resultados fuera de rango o inválidos.
Todos los procedimientos que involucraron aislamientos clínicos se realizaron bajo condiciones de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Se utilizó el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular), y todas las manipulaciones se realizaron en un gabinete certificado de seguridad biológica.
Identificación de especies y pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos
Se realizaron pruebas de resistencia a los carbapénems y susceptibilidad antimicrobiana utilizando un sistema automatizado de identificación microbiana y pruebas de susceptibilidad. La resistencia a los carbapenemas detectada por el sistema fue confirmada mediante pruebas de difusión de disco con discos de ertapenem, ipeñenem y meropenem. Los diámetros de las zonas se interpretaron según los puntos de interrupciónEUCAST 16,17 (Tabla 1). Todos los aislados se conservaron en un caldo de soja tríptico con un 20 % de glicerol y se almacenaron a −20 °C.
Tabla 1: Puntos de ruptura del diámetro de la zona para carbapenems determinados para E. coli mediante prueba de difusión de disco (DDT). Criterios interpretativos de difusión de discos utilizados para pruebas de susceptibilidad a los carbapenemas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Se incubaron frascos de hemocultivo adecuados para muestras pediátricas y aeróbicas en un sistema automatizado de hemocultivo. Los frascos positivos se subcultivaron en agar EMB, agar de sangre de oveja al 5% y agar Sabouraud de dextrosa.
Las muestras de orina y aspirado endotraqueal se cultivaron mediante métodos cuantitativos, mientras que otras muestras se procesaron mediante métodos semicuantitativos. Se evaluaron muestras de aspirado endotraqueal mediante tinción de Gram, y solo se consideraron significativas las muestras con puntuación de Bartlett > 0 y puntuación de Murray > 3, incluyendo18.
Para muestras de heridas, se realizó la evaluación por tinción de Gram según el sistema de puntuación Q; se incluyeron muestras con una puntuación Q superior a0 en 19.
Los aislados bacterianos fueron identificados mediante espectrometría de masas asistida por láser asistida por matriz/tiempo de ionización en tiempos de vuelo. Se consideró que una puntuación de ≥2,0 era fiable para la identificación a nivel de género y especie, mientras que las puntuaciones entre 1,7 y 2,0 indicaban una identificación fiable a nivel de género20,21. Solo se incluyeron aislados con puntuaciones de ≥2,0.
Determinación de la susceptibilidad a la fosfomicina mediante el método de dilución del agar
Según el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST), se recomienda el método de dilución del agar para determinar la susceptibilidad a la fosfomicina en miembros de la familiaEnterobacterales 16.
Preparación de fosfomicina y otras soluciones antibióticas activas
Para el método de dilución del agar, se utilizó fosfomicina hidrato de sal sódica en polvo y agua destilada estéril para crear la dilución. Se planificaron ocho diluciones diferentes para cada antibiótico, que iban desde 4 veces por debajo hasta 3 veces por encima del límite de CMI determinado por EUCAST.
Se preparó una solución de fosfomicina (que contenía 2560 μg/mL fosfomicina) disolviendo 51,2 mg de fosfomicina disodio estéril, calculada usando la fórmula volumen/peso/potencia (Volumen (mL) = Peso (mg) × Potencia (μg/mg)/ Concentración (μg/mL)) y pesada en condiciones estériles, en 20 mL de agua destilada estéril. La concentración final estaba prevista para ser de 256 μg/mL, resultado de una dilución de 10 veces la solución original al añadir MHA.
En consecuencia, se determinaron los rangos de dilución para fosfomicina (2-256 μg/mL), meropenema y gentamicina (0,125–16 μg/mL), y ceftriaxona (0,0625–8 μg/mL).
Las diluciones se preparaban mediante diluciones dobles en serie en tubos cónicos estériles que contenían 10 mL de agua destilada estéril. Se realizaron un total de 7 diluciones dobles en serie en los tubos hasta alcanzar una concentración de 2 μg/mL. Los 10 mL restantes en el último tubo fueron descartados. Esto resultó en ocho concentraciones diferentes de antibióticos: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 y 2 μg/mL.
El mismo método utilizado para la fosfomicina se empleó para los otros antibióticos para preparar la solución inicial de serie. Se pesaron 1,6 mg de antibiótico en polvo para ceftriaxona y 3,2 mg para meropenem y gentamicina usando una báscula de precisión. Se hicieron siete diluciones para cada antibiótico. Así, se obtuvieron ocho concentraciones diferentes de diluciones antibióticas para meropenem, gentamicina y ceftriaxona (Figura 1).
Figura 1: Pasos de preparación de las soluciones de dilución de fosfomicina. Pasos de dilución en serie usados para obtener concentraciones de trabajo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Preparación del medio de agar
El ágar Mueller-Hinton ajustado por catión (CAMHA) fue preparado siguiendo las instrucciones del fabricante. Se esterilizó a 121 °C y 1 atm durante 15–20 minutos usando un autoclave, y luego se mantuvo a 45–55 °C en baño marea.
Todos los materiales biológicos se esterilizaron mediante autoclave a 121 °C durante 15–20 minutos antes de su eliminación. Los residuos que contenían antibióticos se eliminaron de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad y residuos químicos.
Paso crítico: Mantener la temperatura del agar entre 45 y 55 °C antes de añadir antibióticos. El calor excesivo puede reducir la actividad de la fosfomicina y afectar los resultados de la CMI.
Adición de G6P al medio
Para determinar la susceptibilidad a la fosfomicina, EUCAST recomienda añadir 25 μg/mL de glucosa-6-fosfato (G6P) al agar y al mediode caldo 5. Por cada litro de agar, se disolvían 25 mg de G6P en 20 mL de MHA, se filtraban para esterilizar y luego se mezclaban en el lote principal de agar.
Preparación de placas de dilución de agar
Para determinar los valores de CMI en monoterapia para fosfomicina, meropenem, gentamicina y ceftriaxona, se utilizó una placa de Petri por dilución (por ejemplo, 8 diluciones para fosfomicina, que varian entre 2 y 256 μg/mL). Se anotaron las concentraciones de antibióticos en las placas.
Para el estudio combinado, se observaron las concentraciones de fosfomicina y del otro antibiótico investigado en las placas (por ejemplo, fosfomicina 256 μg/mL y meropenemia 32 μg/mL). Así, se prepararon 64 placas para cada combinación, y se anotó la concentración de fosfomicina y el otro antibiótico utilizado en las placas. Se prepararon un total de 32 placas de meropenem-gentamicinetri para monoterapia y 192 para combinación. Se realizó un dibujo estándar que contenía 56 pequeños cuadrados de 1 cm sobre una superficie de mármol. Todas las planchas fueron inoculadas directamente en este dibujo. Así, la lectura y la inoculación se estandarizaron (Figura 2 y Figura 3).
Figura 2: Diagrama estándar creado para fines de inoculación y lectura. Esquema estandarizado utilizado para la inoculación y evaluación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Método de evaluación de placas de dilución de ágar. Evaluación del crecimiento bacteriano para determinar la CIM. F = fosfomicina; M = meropenem. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Se mezclaron dos mililitros de solución antibiótica con 18 mL de CAMHA fundido para obtener la concentración final de trabajo. Este medio, preparado según el folleto del fabricante, se enfriaba a 45−55 °C en un baño maria. Se utilizó una parte (2 mL) de la mezcla antibiótica y 9 partes (18 mL) de MHA se mezclaron en las placas de Petri (el antibiótico se diluyó en 1/10). El volumen final de la placa de agar se estandarizó a aproximadamente 20 mL por placa (18 mL de agar + 2 mL de solución antibiótica), y las concentraciones finales de antibiótico se calcularon tras dilución. De este modo, se lograron concentraciones de antibióticos en las placas de dilución del agar (2–256 μg/mL para fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL para ceftriaxona y 0,125–16 μg/mL para meropenema y gentamicina). Se utilizaron placas preparadas a partir del medio sin solución antibiótica como controles de crecimiento (Figura 4). Las mezclas compuestas por medio y solución antibiótica se dejaron solidificar a temperatura ambiente.
Figura 4: Medio de control sin solución antibiótica. Se utiliza medio sin antibióticos para confirmar la viabilidad bacteriana. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Paso crítico: Una profundidad desigual del agar o una mezcla insuficiente de antibióticos puede llevar a una interpretación inexacta de la CIM y a resultados de interacción falsa.
Preparación e inoculación de aislados
Las cepas puras previamente almacenadas se pasaron sobre agar sanguíneo de oveja al 5% a temperatura ambiente e incubaron a 37 °C durante 16–24 horas. Las colonias de cultivos frescos se suspendieron en solución salina estéril, y se logró una turbidez McFarland de 0,5 utilizando un lector óptico.
El método de dilución del agar requería un inoculo bacteriano de aproximadamente 10,4 UFC por punto. Un valor de McFarland de 0,5 contiene aproximadamente 10,8 UFC/mL de bacterias. Se logró una densidad bacteriana de10,7 UFC/mL diluyendo la solución 1:10 con solución fisiológica estéril.
Se recogían 2 μL de cada suspensión bacteriana del tubo mediante una pipeta automática. Este volumen corresponde aproximadamente a 2 × 104 CFU por punto. La inoculación se realizó en áreas específicas de la superficie del ágar, comenzando por la placa con la concentración más baja de fosfomicina y progresando hasta la más alta.
Así, la inoculación se definió como UFC por punto, con cada punto de inoculación conteniendo aproximadamente 10UFC de 4 . La inoculación de cada suspensión bacteriana se completó en 15 minutos.
Antes de inocular las placas que contienen fosfomicina, se inoculó una placa de control de crecimiento para comprobar la contaminación posible. La inoculación se dejó secar a temperatura ambiente. La incubación se realizó a 35–37 °C durante 16–24 horas en condiciones aeróbicas, y se midió la turbidez con un densitómetro calibrado.
Un exceso de densidad de inoculo puede causar crecimiento residual y dificultad para determinar los puntos finales. Reajustar la turbidez a 0,5 McFarland y repetir la inoculación si se produce crecimiento confluente.
Pruebas combinadas
Se utilizaron los antibióticos en polvo meropenem, fosfomicina, gentamicina, ceftriaxona y glucosa-6-fosfato.
Las cantidades de antibióticos se calcularon usando la fórmula volumen/peso/potencia. Tras preparar las soluciones estándar, se prepararon soluciones antibióticas a concentraciones de tres diluciones dobles por encima y cuatro diluciones dobles por debajo del rango de CMI susceptible. Los rangos de dilución se calcularon como 2–256 μg/mL para fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL para ceftriaxona y 0,125–16 μg/mL para gentamicina y meropenem (Tabla 2, Tabla 3 y Tabla 4).
Tabla 2: Preparación de soluciones antibióticas para la combinación fosfomicina-gentamicina. Pasos de preparación y concentraciones utilizadas para el stock y las soluciones de trabajo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Preparación de soluciones antibióticas para la combinación fosfomicina-meropenem. Pasos de preparación y concentraciones utilizadas para el stock y las soluciones de trabajo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Preparación de soluciones antibióticas para la combinación de fosfomicina-cetriaxona. Pasos de preparación y concentraciones utilizadas para el stock y las soluciones de trabajo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
En este estudio, se prepararon soluciones separadas de stock de fosfomicina para monoterapia y experimentos de combinación para compensar las diferencias en los factores finales de dilución durante pruebas basadas en ágar. Se utilizó una solución estándar estándar para experimentos monoterapéuticos, mientras que para experimentos combinados se empleó una solución estándar de mayor concentración para compensar la dilución adicional durante la premezclación de antibióticos.
Se preparaban soluciones estándar como primer paso para la dilución en serie. Para la fosfomicina, se pesaron con precisión 256 mg de polvo utilizando una balanza analítica en condiciones estériles y se disolvieron en 50 mL de agua destilada estéril con mezcla continua (agitador magnético) hasta lograr la disolución completa, resultando en una concentración final de 5120 μg/mL de fosfomicina disodio. Se prepararon soluciones estándar separadas de gentamicina, meropenem y ceftriaxona.
Para diluciones dobles en serie, se prepararon siete tubos cónicos estériles con 25 mL de agua destilada estéril. Desde la solución original, se transfirieron 25 mL al primer tubo usando una pipeta ajustable, seguido de una transferencia secuencial a tubos posteriores para lograr diluciones en serie dobles. Cada tubo se mezclaba minuciosamente con un mezclador de vórtice durante 5–10 segundos tras cada paso de transferencia. Del tubo final, se descartaron 25 mL para mantener volúmenes iguales. De este modo, se obtuvo una serie de diluciones que dio una concentración mínima de 40 μg/mL, y se prepararon un total de ocho concentraciones diferentes de fosfomicina.
El mismo procedimiento se aplicó para gentamicina, meropenem y ceftriaxona. Sin embargo, debido a diferencias en los rangos de concentración objetivo, se pesaron y disolvieron por separado 16 mg de gentamicina y meropenem (para un rango de 0,125–16 μg/mL) y 8 mg de ceftriaxona (para un rango de 0,0625–8 μg/mL) se pesaron y disolvieron por separado en agua destilada estéril de 50 mL bajo condiciones asépticas a temperatura ambiente. Se realizaron diluciones en serie de doble vía como se describió anteriormente. Las concentraciones finales más bajas fueron 2,5 μg/mL para gentamicina y meropenem, y 1,25 μg/mL para ceftriaxona. Para cada antibiótico se prepararon ocho tubos con 25 mL de diferentes concentraciones. Como la fosfomicina se probó en combinación con tres antibióticos, se prepararon un total de 24 tubos de dilución de fosfomicina (8 × 3).
Para la preparación del agar, 18 mL de agar Mueller–Hinton suplementados con glucosa-6-fosfato (25 μg/mL) se preenfriaron a 45–50 °C y se dispensaron en placas de Petri estériles. Posteriormente, se añadieron 1 mL de solución de fosfomicina y 1 mL de la segunda solución antibiótica utilizando pipetas estériles. Las placas se mezclaban suavemente mediante rotación circular para asegurar una distribución homogénea y se dejaba solidificarse a temperatura ambiente. Debido a la mezcla de igual volumen y la adición de ágar, las concentraciones de antibióticos se redujeron aproximadamente 9 veces.
Para la prueba combinada, se combinó 1 mL de la concentración más baja de fosfomicina (40 μg/mL) con 1 mL de cada una de las ocho diluciones de gentamicina (2,5–320 μg/mL), luego se añadió a placas de Petri separadas y se mezcló suavemente. El mismo procedimiento se repitió para la siguiente concentración de fosfomicina (80 μg/mL), y continuó escalonado hasta 5120 μg/mL, asegurando que se probaran todas las combinaciones posibles de concentración. Se utilizaba una nueva punta estéril de pipeta para cada transferencia para evitar la contaminación cruzada. En total, se prepararon 64 placas de Petri (8 × 8 combinaciones) para la combinación fosfomicina–gentamicina (Tabla 5).
El mismo procedimiento se aplicó a fosfomicina en combinación con meropenema y ceftriaxona, resultando en 64 placas para cada combinación de antibióticos (Tabla 6 y Tabla 7).
Tabla 5: Disposición de la combinación fosfomicina-gentamicina en medio MHA. Disposición de concentraciones de antibióticos en el agar de Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; GN = gentamicina. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 6: Disposición de la combinación fosfomicina-meropenema en medio MHA. Disposición de concentraciones de antibióticos en el agar de Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; MEM = meropenem. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 7: Disposición de la combinación fosfomicina-ceftriaxona en el medio MHA. Disposición de concentraciones de antibióticos en el agar de Mueller–Hinton. FF = fosfomicina; CRO = ceftriaxona. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tras preparar las mezclas de antibióticos, se añadieron 18 mL de agar Mueller–Hinton fundido (45–50 °C) a cada placa que contenía 1 mL de la mezcla antibiótica, asegurando que las condiciones de temperatura no comprometieran la actividad antibiótica. Esto resultó en una dilución aproximada de 9 veces la solución inicial de antibiótico.
Para una evaluación sistemática, las placas se organizaron en formato de tablero de ajedrez (dilución bidimensional). Las concentraciones de fosfomicina se organizaron a lo largo del eje vertical (filas A–H), con la concentración más alta en la fila A y concentraciones decrecientes hacia la fila H. El segundo antibiótico se dispuesta a lo largo del eje horizontal (columnas 1–8), con concentraciones crecientes de la columna 1 a la columna 8. Por tanto, cada posición bien equivalente representaba una combinación única de dos concentraciones de antibióticos, permitiendo una evaluación exhaustiva de los efectos de interacción.
Evaluación de resultados
Los resultados de la concentración mínima inhibitoria se evaluaron según las recomendaciones de EUCAST v.11. Las placas de control del crecimiento mostraron crecimiento bacteriano visible, mientras que las placas de control de esterilidad (no inoculadas) no mostraron crecimiento. La CMI se definió como la concentración más baja en la que no se produjo crecimiento visible. Para las pruebas combinadas, los efectos de interacción se interpretaron utilizando valores FICI. La sinergia se definía como FICI ≤ 0,5, la indiferencia como > 0,5–4 y la antagonía como > 4. Para la fosfomicina, se consideraron susceptibles valores de CIM ≤ 32 μg/mL, y los > 32 μg/mL se consideraron resistentes. Para gentamicina y meropenemia (en infecciones por meningitis), los valores de CMI ≤ 2 μg/mL se consideraron susceptibles, y los > 2 μg/mL se consideraron resistentes. Para meropenema (en infecciones no meningitis), se consideraron susceptibles valores de CMI ≤ 2 μg/mL. Se consideraron resistentes valores > 8 μg/mL, la CMI ≤ 1 μg/mL para ceftriaxona (para infecciones no meningitis) se consideraron susceptibles, la CMI ≤ 2 μg/mL para ceftriaxona (para infecciones por meningitis) se consideró susceptible, y la CMI > 1 μg/mL para ceftriaxona (para infecciones por meningitis) se consideró resistente16.
El análisis estadístico de los datos del estudio se realizó utilizando software estadístico.
Estadística: Las variables categóricas se expresaron en números y porcentajes. La prueba de chi-cuadrado de Pearson se utilizó para comparaciones en las que todos los recuentos celulares esperados eran ≥5. La prueba exacta de Fisher se utilizó para análisis con muestras pequeñas o cuando el recuento celular esperado era <5. Específicamente, la prueba de chi cuadrado se utilizó para comparaciones generales de las tasas de resistencia a la fosfomicina, mientras que la prueba exacta de Fisher se empleó para análisis de subgrupos de tasas de interacción sinérgicas, aditivas y antagónicas debido a distribuciones de baja frecuencia en algunas combinaciones. Se consideró estadísticamente significativo un valor P ≤ 0,05.
Nota de interpretación: Las pequeñas colonias individuales dentro de zonas de inhibición no se consideraron en crecimiento a menos que fueran confluentes o reproducibles en pruebas repetidas.
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Conclusiones
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En el estudio se incluyeron un total de 60 aislados de E. coli resistentes a los carbapenemos. Todos los aislados se obtuvieron de pacientes hospitalizados en unidades de cuidados intensivos o en plantas clínicas de los hospitales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Digle. Los pacientes adultos representaron el 83,3% de los casos, mientras que los pacientes pediátricos representaron el 16,7% (Tabla 8 y Tabla 9). Se observó resistencia a múlti...
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Divulgaciones
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Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
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Este estudio fue apoyado por la Unidad de Coordinación de Proyectos de Investigación Científica de la Universidad de Dicle (DÜBAP) con el número de proyecto SBE.21.004.
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