La evaluación del drenaje linfático mediante imágenes en infrarrojo cercano y ultrasonidos de ICG tras fractura

Resumen

Este protocolo evalúa el drenaje linfático tras la fractura combinando imágenes de infrarrojo cercano verde de indocianina (ICG) con ultrasonidos para cuantificar la eliminación plantar de ICG y el agrandamiento de ganglios linfáticos poplíteos en ratones.

Resumen

Las fracturas traumáticas suelen ir acompañadas de una función linfática deteriorada. La reducción del drenaje linfático y el agrandamiento de los ganglios linfáticos tras la fractura indican procesos dinámicos y continuos de la respuesta inflamatoria aguda y el reclutamiento de células inmunitarias. Este artículo describe un método en el que se inyectaron 6 μL de 0,2 mg/mL de verde de indocyanina intradérmica en la región plantar de ratones sometidos a cirugía simulada o de fractura tibial. La imagen de fluorescencia en infrarrojo cercano cuantificó la señal plantar de ICG a 0 h y 24 h para calcular la tasa de eliminación en 24 horas como lectura del drenaje linfático murino. Se utilizó la ecografía simultáneamente para reconstruir en 3D los ganglios linfáticos poplíteos (PLN), comparar sus volúmenes y evaluar el agrandamiento inducido por fracturas.  Los resultados demostraron que, tras la fractura, la tasa de eliminación linfática disminuyó significativamente, la intensidad de fluorescencia de ICG en la región plantar fue notablemente mayor y el volumen de las PLN se agrandó significativamente.  En comparación con métodos anteriores para medir el sistema linfático, como las secciones histopatológicas o la linfescintigrafía, que a menudo no logran observación in vivo, dinámica y continua, este método demuestra alta estabilidad y reproducibilidad. Cabe destacar que permite un seguimiento dinámico in vivo. de la función del drenaje linfático, proporcionando un sólido apoyo técnico para investigar cambios en el reflujo linfático en modelos de fracturas.

Introducción

Las fracturas traumáticas suelen causar daños y hinchazón significativa en los tejidos, aumentando el riesgo de complicaciones como infección, necrosis y no unión^{ósea 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. demostraron que la disfunción del drenaje linfático, que conduce a edema tisular, está relacionada con un retraso en la^{cicatrización 3}. Los estudios indican que durante el proceso de curación de la fractura, además de la reparación del tejido óseo, el sistema linfático en el lugar de la fractura también desempeña un papel importante. Los vasos linfáticos no solo son responsables de drenar el líquido intersticial y prevenir la^hinchazón, sino también de regular la migración de las células inmunitarias y eliminar los desechos metabólicos. Sin embargo, en las primeras fases de la fractura, factores proinflamatorios como TNF-α, IL-1, IL-6 y el factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) pueden dañar las células endoteliales^{linfáticas 5}, provocando cambios patológicos como degeneración, edema y^{fibrosis 6}. Estudios relevantes han demostrado la presencia de células endoteliales linfáticas en el hueso y el periostio, así como en los tejidos adiposos y musculares circundantes. Además, el drenaje linfático también participa en la regulación del microambiente del hematoma tras la fractura; el drenaje linfático eficaz facilita la supervivencia de los osteoblastos y la proliferación de células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC)⁷. Durante una fractura, los factores proinflamatorios (TNF-α, IL-1 e IL-6) y los factores de crecimiento (TGFβ1 y PDGF) producidos por las células inmunitarias en el sitio dañado son factores reguladores importantes para la apoptosis de osteoblastos y la proliferación^{de la BMSC 8}. Hüseyin Arslan y otros estudiosos han confirmado el impacto negativo del edema linfático en los osteoblastos. Estos hallazgos de investigación destacan el importante papel del drenaje linfático en la cicatrización de fracturas. Los avances recientes en la imagen de fluorescencia por infrarrojo cercano (NIR) de ICG han facilitado la observación no invasiva y en tiempo real de la dinámica del flujo linfático tanto en modelos animales como en humanos ^9,10,11. Esta técnica permite una evaluación cuantitativa de la contractilidad de los vasos linfáticos, la velocidad de drenaje y la integridad de las^{vías 10,11}. Un estudio que utiliza modelos murinos de artritis e inflamación ha demostrado que la imagen ICG-NIR puede diferenciar entre respuestas linfáticas agudas y crónicas, destacando patrones de drenaje distintos durante la lesión y recuperación tisular. Además, se ha demostrado que la imagen linfática NIR es eficaz para monitorizar la recuperación funcional tras el drenaje linfático manual y para evaluar la eficacia de terapias dirigidas a linfáticos. La ecografía proporciona una modalidad cuantitativa complementaria para evaluar la morfología y el volumen de los ganglios linfáticos drenados, así como el edema tisular asociado a un drenaje linfático deficiente. La integración de la imagen por fluorescencia NIR con ultrasonidos permite una evaluación concurrente de la función linfática y los cambios anatómicos, proporcionando un enfoque multimodal para investigar la dinámica linfática in vivo. A pesar del creciente reconocimiento del papel crítico de la disfunción linfática en la curación postraumática, siguen faltando métodos estandarizados y reproducibles para evaluar el drenaje linfático tras fracturas. Muchos métodos de imagen actuales son invasivos, carecen de una resolución espacial adecuada o no monitorizan dinámicamente el flujo linfático. Por ello, se espera que desarrollar un protocolo que combine ICG-NIR e imágenes por ultrasonido aborde esta carencia metodológica y proporcione una herramienta eficaz para evaluar la recuperación linfática y su contribución a la reparación ósea.

Este estudio presenta un marco innovador que combina imágenes de fluorescencia ICG-NIR con ultrasonidos de alta resolución para evaluar el drenaje linfático tras fracturas tibiales en ratones. Este enfoque permite un análisis semicuantitativo de la eficiencia del drenaje y mide el volumen de ganglios linfáticos durante el proceso de cicatrización de fracturas. También tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el ICG-NIR se utiliza principalmente para evaluar vasos linfáticos superficiales, y su capacidad de imagen para estructuras profundas es limitada. En segundo lugar, aunque los cambios en el volumen de los ganglios linfáticos proporcionan cierta información, carecen de especificidad y no pueden sustituir completamente las mediciones funcionales directas. Esta metodología tiene un potencial traslacional significativo y mejora nuestra comprensión de la función linfática en la regeneración ósea.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Centro de Organismos Modelo de Shanghái (Aprobación nº NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). En este estudio se utilizaron ratones machos C57 con modelo de fractura (6–8 semanas de edad). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cuidados preoperatorios

1. Aclimatar a los ratones durante al menos una semana con acceso ad libitum. Acceso a comida y agua. Asigna aleatoriamente los animales al grupo de fractura o simulación usando una lista de aleatorización generada por ordenador.
2. Coloca a los ratones sobre una almohadilla térmica para animales y mantén una temperatura constante de 37 °C.
3. Enciende la máquina de anestesia por gases y coloca al ratón en la cámara de inducción durante 5 minutos al 2%–3% de isoflurano.
4. Tras la inducción, cambiar a isoflurano al 1%–2% y mantener la anestesia mediante un cono nasal hasta el final del procedimiento.

2. Procedimiento experimental

NOTA: Estandarizar la configuración de anestesia, dosis y volumen de ICG, lugar y profundidad de inyección, tiempo de exposición, definición de ROI y parámetros de ecografía en todas las sesiones para minimizar la variabilidad entre animales.

1. Imagen NIR-ICG
   NOTA: El procedimiento paso a paso para la imagen en infrarrojo cercano de ICG se muestra en la Figura 1.
   1. Pesa 0,2 mg de verde de indocianina (ICG), transfiere a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y disuelvéalo en 1 mL de PBS para preparar una solución de ICG de 0,2 mg/mL. Envuelve el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
   2. Enciende el sistema de imagen y abre FluoBeam v1.46. Ajusta la altura de la cámara según sea necesario.
   3. Humedece un hisopo de algodón con etanol al 75% y desinfecta la superficie plantar de la pata trasera modelada.
   4. Utilizando una microjeringa de 10 μL, aspira 6 μL de la solución ICG. Inserta la aguja aproximadamente 1 mm en la superficie plantar e inyecta la solución a una velocidad constante hasta que se administre el volumen completo.
   5. En el software, activa tanto las funciones de "cámara" como de "láser". Haz clic en "modificar" para crear una nueva carpeta y configúrala como el directorio de guardado. Mantén el tiempo de exposición idéntico para la adquisición de imágenes a 0 h y 24 h.
   6. Coloca el ratón bajo la cámara en posición tumbada con la extremidad trasera modelada centrada en el campo de visión. Asegúrate de que la extremidad trasera modelada esté centrada en el campo de visión.
   7. Configura el tiempo de exposición a 30 ms y mantenlo idéntico tanto para las imágenes de 0 h como para las de 24 h. Adquirir imágenes del mismo ROI de inyección plantar a 0 h y 24 h tras la inyección para medir la intensidad de la señal ICG. Mantén el tiempo de exposición idéntico en 0 h y 24 h.
   8. Cuando los vasos linfáticos de la extremidad posterior son claramente visibles en el campo visual, haz clic en "foto" para capturar las imágenes.
   9. Tras la adquisición de la imagen, exporta los datos y utiliza software de análisis de imágenes para cuantificar la intensidad de fluorescencia a 0 h y 24 h, y luego calcula la tasa de resolución de fluorescencia.
   10. Abre el software de análisis de imágenes.
   11. Importa las imágenes de fluorescencia haciendo clic en Archivo → Abrir, y abre la imagen plantar de 0 h correspondiente al mismo animal y al mismo día de examen (y luego abre la imagen coincidente de 24 horas).
   12. Selecciona Óvalo, luego haz clic en Editar → Selección → Especificar; pon Ancho = 30 y Alto = 30, elige Óvalo y haz clic en OK.
   13. Coloca el círculo sobre un área de fondo.
   14. Haz clic en Analizar → Medir y registra el valor medio en la ventana de Resultados como intensidad de fluorescencia a 0 h de fondo (FI0hbg).
   15. Coloca el círculo sobre el sitio de observación del objetivo, haz clic en Analizar → Medir y registra el valor Medio en la ventana de Resultados como FI0h.
   16. Calcular la intensidad de fluorescencia corregida a 0 h como FI0h corregido = FI0h − FI0hbg.
   17. Abre la imagen coincidente de 24 horas y repite los pasos 3–7 para obtener la FI24h corregida.
   18. Calcula la tasa de resolución usando la intensidad de fluorescencia corregida por fondo de la siguiente manera: Tasa de resolución = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%.
2. Ecografía en modo B
   NOTA: El procedimiento paso a paso para la ecografía, la imagen y la delimitación de ganglios linfáticos se muestra en Figura 2.
   1. Enciende el sistema de ultrasonidos, conecta el transductor y coloca el ratón de modo que la extremidad trasera se vea claramente. Bajo anestesia continua, coloca al ratón en posición prona en la etapa de imagen, con la cabeza orientada alejada del operador y la cola hacia él. Flexiona la rodilla de modo que la fosa poplítea mire hacia arriba y ligeramente lateralmente, y posiciona el transductor sobre la depresión de la fosa poplítea.
   2. Aplica gel de acoplamiento por ultrasonido en la extremidad trasera modelada.
   3. Gira el transductor para que su ángulo permanezca paralelo al eje longitudinal de la extremidad posterior.
   4. Ajusta la distancia de escaneo a 4 mm y el tamaño del paso a 0,04 mm. Identifica el ganglio linfático poplíteo en la imagen según su ubicación anatómica.
   5. Estabiliza al ratón sujetando la cola y la extremidad trasera modelada con ambas manos. No muevas al animal mientras el transductor está escaneando.
   6. Adquiere imágenes. Identificar el ganglio linfático poplíteo como un nódulo pequeño ovalado o ligeramente en forma de judía con ecogenicidad intermedia a baja, ligeramente inferior al de la grasa circundante, y claramente delimitado del músculo estriado y oscuro adyacente.
   7. Exporta las imágenes a un software de reconstrucción 3D para un procesamiento tridimensional de imágenes.
   8. Tras completar el escaneo 3D en la consola del sistema de imágenes de ultrasonidos, guarda el escaneo como un conjunto de datos 3D y registra la identificación del animal, el código del grupo y el momento (0 h / 24 h).
   9. Exportar los datos en bruto desde la consola de adquisición al ordenador de análisis, manteniendo la estructura original de carpetas sin cambios; Utiliza una carpeta para cada animal en cada momento siempre que sea posible.
   10. Abre el software de reconstrucción 3D.
   11. Haz clic en "Study" para entrar en el módulo y selecciona "Importar".
   12. Haz clic en la carpeta de datos , comprueba los datos a importar y haz doble clic para abrirla.
   13. En el modo de visualización, selecciona "Procesamiento de imágenes" → "Cargar en 3D" → "Vista transversal" → "Medición de volumen" → "Iniciar".
   14. Confirma que la orientación del corte y los parámetros de pasos ("voxel/espaciado") son consistentes con los ajustes de adquisición.
   15. Utiliza la rueda del ratón o el deslizador de cortes para desplazarte desde el extremo proximal hasta el distal e identificar la primera porción en la que aparece el PLN (normalmente aparece como una estructura ovalada o en forma de judía, ligeramente hipoecoica respecto a la grasa circundante, con un límite relativamente claro).
   16. Comienza a trazar la primera franja en la que aparece el PLN haciendo clic izquierdo para iniciar el contorno.
   17. Traza un contorno cerrado punto por punto a lo largo del borde del ganglio linfático, manteniendo el contorno lo más cerca posible de la cápsula externa y evitando la inclusión de la grasa o luz vascular circundante.
   18. Utiliza la rueda del ratón para moverte a la sección que muestra la sección transversal máxima del PLN, y repite el Paso 10 para completar el segundo contorno.
   19. Usa la rueda del ratón para moverte a la sección justo antes de que desaparezca el PLN, y repite el Paso 10 para completar el tercer contorno.
   20. Haz clic en "Terminar" para generar el volumen segmentado en 3D y mostrar la medición de volumen.
   21. Registra el volumen del PLN (mm³) en el panel de resultados.
   22. En el panel de resultados de medición, selecciona "Exportar" y exporta los resultados como un archivo .csv o .xls.
   23. Selecciona el tipo de archivo y exporta la imagen como Área de Imagen TIFF (.tif).
   24. Mantener el cegamiento durante el análisis mostrando solo el código animal y el punto de tiempo, sin mostrar la asignación de grupo (fractura/simulación), hasta que se haya completado toda la extracción de volumen y los grupos se decodifican para análisis estadístico.
3. Análisis estadístico utilizando software de análisis estadístico
   1. Selecciona Nueva tabla y gráfico, elige Agrupado.
   2. Configura el formato de entrada de datos en Introducir valores de replicación, apilados en subcolumnas.
   3. Introduce los valores en bruto para 1 / 7 / 14 y Sham / Fractura. -Abre el gráfico.
   4. Cambia el tipo de gráfico a Dispersión (valores individuales) + media + barras de error.
   5. Formatea los ejes: establece el eje Y y cambia el título del eje.
   6. Haz clic en Analizar y realiza una ANOVA bidireccional.
   7. Compara Sham con Fracture en cada momento.
   8. Añade los resultados de significación al gráfico.

3. Cuidados postoperatorios

1. Al final del experimento, coloca al ratón sobre una almohadilla térmica y deja que se recupere de la anestesia.
2. Controla de cerca su estado y, si no se observan anomalías, devuélvelo a la jaula para que continúe alojado.

4. Evaluación

NOTA: Que un investigador cegado respecto a la asignación de grupos realice la adquisición de imágenes y análisis cuantitativos, y mantenga todos los conjuntos de datos codificados hasta que se completen los análisis estadísticos.

1. Imagen NIR-ICG
   1. Utiliza software de análisis de imágenes para realizar un análisis cuantitativo relativo de la intensidad de fluorescencia en imágenes ICG recogidas de almohadillas de ratón.
      NOTA: La fórmula de cálculo para la tasa de eliminación de ICG en alfombrillas para ratones es la siguiente:
      Tasa de resoluciones (%) = [(FI_0h – FI_24h) / (FI_0h)] × 100%
   2. Utilizar el mismo método para registrar la tasa de eliminación de cada medición y analizar la relación entre la tasa de eliminación linfática y el tiempo utilizando software de análisis estadístico.
2. Ecografía en modo B
   1. Analizar imágenes en modo B y tridimensionales utilizando software de reconstrucción 3D para determinar el volumen de PLN.
   2. Evalúa los cambios en el drenaje linfático y el volumen de ganglios linfáticos a lo largo del tiempo creando diagramas de dispersión con software de análisis estadístico.
3. Análisis estadístico
   1. Analizar mediciones repetidas obtenidas en los días 1, 7 y 14 utilizando ANOVA de medidas repetidas bidireccionales.

Resultados

En los días 1, 7 y 14 tras establecer el modelo de fractura, la intensidad de fluorescencia plantar de ICG (FI_24h) a 24 horas en el grupo fracturado fue consistentemente mayor que en el grupo de cirugía simulada (Figura 3). El análisis cuantitativo relativo de la intensidad de fluorescencia de ICG a partir de imágenes plantares recogidas mostró que la tasa de eliminación de ICG linfático en el grupo fracturado fue significativamente menor que en e...

Discusión

El protocolo incluye varios detalles fácilmente pasados por alto. Por ejemplo, el tiempo de exposición no es fijo y debe determinarse en función de la intensidad específica de fluorescencia. Sin embargo, el tiempo de exposición para el mismo grupo de ratones a 0 h y 24 h debe mantenerse constante; de lo contrario, los resultados pueden ser poco fiables. Al utilizar ultrasonidos para observación, es esencial cubrir completamente las extremidades inferiores del ratón con agente acoplador, ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	El microsyringe Hamilton 80330/00 es un instrumento de precisión con una capacidad de 10L, que cuenta con una aguja de calibre 26s, 51 mm de longitud y estilo de punta 2. Está diseñado para una entrega precisa de pequeños volúmenes en aplicaciones de cromatografía, inyección de muestras y química analítica.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	El Vevo 2100 es un sistema de imagen de ultrasonido de alta frecuencia para investigación preclínica, que proporciona visualización 3D en tiempo real de pequeños animales. Ofrece una resolución superior para estudios cardiovasculares, oncológicos y de biología del desarrollo, integrado con el software Vevo LAB para el análisis de datos.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	El etanol al 75% es una solución desinfectante ampliamente utilizada en laboratorios para la esterilización de superficies, limpieza de equipos y antisepsia. Mata eficazmente bacterias, virus y hongos mediante la denaturación de proteínas y se aplica comúnmente en entornos biológicos y clínicos.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	Los hisopos de algodón son aplicadores estériles y absorbentes utilizados para la recolección precisa de muestras, la aplicación de soluciones o limpieza en procedimientos médicos, de diagnóstico y de laboratorio. Cuentan con palos de madera o plástico con puntas de algodón para un manejo higiénico.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	El agente de acoplamiento, comúnmente conocido como gel de ultrasonido, es un medio a base de agua que se utiliza para mejorar la transmisión acústica entre el transductor de ultrasonido y la piel. Elimina los bolsillos de aire para lograr una imagen clara, no es irritante y se suministra en un contenedor de 250 mL para uso médico y de diagnóstico.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Un software científico de gráficas y análisis estadístico utilizado para el análisis, visualización y presentación de datos.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Un programa de procesamiento y análisis de imágenes basado en Java de dominio público ampliamente utilizado para el análisis de imágenes biológicas y médicas.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	El verde de indocianina es un tinte aniónico hidrosoluble utilizado en diagnósticos médicos para determinar el gasto cardíaco, la función hepática, el flujo sanguíneo hepático y la angiografía oftálmica. Se suministra en viales de 25 mg para administración intravenosa y exhibe fluorescencia en el espectro del infrarrojo cercano para fines de imagen.
isoflurance	RWD	R650-IE	El isoflurano es un anestésico general inhalado. Tiene un pequeño coeficiente de partición sangre/gas. Cuando se usa para anestesia animal, puede inducir la anestesia de manera suave, rápida y cómoda, con una recuperación rápida, buena relajación muscular y sin efecto excitatorio en el sistema nervioso simpático. La tasa metabólica del isoflurano en el hígado es baja, por lo que tiene poca toxicidad para el hígado y no hay efectos secundarios evidentes incluso con un uso repetido. Para evitar los efectos adversos del gas de desecho del anestésico en el medio ambiente y el personal del laboratorio, se recomienda usarlo junto con un sistema de recuperación de gases.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	La microbalanza FA1004B es un instrumento analítico de alta precisión diseñado para el pesaje preciso de muestras pequeñas, que ofrece una legibilidad de hasta 0.0001 g y es adecuado para aplicaciones de laboratorio que requieren mediciones precisas en investigación y control de calidad.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	El Olympus MVX10 es un sistema de microscopio de fluorescencia macro zoom optimizado para imágenes de infrarrojo cercano. Ofrece visualización de alta resolución de especímenes grandes con un amplio rango de zoom, óptica avanzada para penetración profunda en tejidos y compatibilidad con técnicas de fluorescencia en investigación biológica y de materiales.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Un paquete de software de análisis de imágenes utilizado para analizar datos de imágenes Vevo, que incluye medición, cálculo y generación de informes.