La evaluación del drenaje linfático mediante imágenes en infrarrojo cercano y ultrasonidos de ICG tras fractura

Resumen

Este protocolo evalúa el drenaje linfático tras la fractura combinando imágenes de infrarrojo cercano verde de indocianina (ICG) con ultrasonidos para cuantificar la eliminación plantar de ICG y el agrandamiento de ganglios linfáticos poplíteos en ratones.

Resumen

Las fracturas traumáticas suelen ir acompañadas de una función linfática deteriorada. La reducción del drenaje linfático y el agrandamiento de los ganglios linfáticos tras la fractura indican procesos dinámicos y continuos de la respuesta inflamatoria aguda y el reclutamiento de células inmunitarias. Este artículo describe un método en el que se inyectaron 6 μL de 0,2 mg/mL de verde de indocyanina intradérmica en la región plantar de ratones sometidos a cirugía simulada o de fractura tibial. La imagen de fluorescencia en infrarrojo cercano cuantificó la señal plantar de ICG a 0 h y 24 h para calcular la tasa de eliminación en 24 horas como lectura del drenaje linfático murino. Se utilizó la ecografía simultáneamente para reconstruir en 3D los ganglios linfáticos poplíteos (PLN), comparar sus volúmenes y evaluar el agrandamiento inducido por fracturas.  Los resultados demostraron que, tras la fractura, la tasa de eliminación linfática disminuyó significativamente, la intensidad de fluorescencia de ICG en la región plantar fue notablemente mayor y el volumen de las PLN se agrandó significativamente.  En comparación con métodos anteriores para medir el sistema linfático, como las secciones histopatológicas o la linfescintigrafía, que a menudo no logran observación in vivo, dinámica y continua, este método demuestra alta estabilidad y reproducibilidad. Cabe destacar que permite un seguimiento dinámico in vivo. de la función del drenaje linfático, proporcionando un sólido apoyo técnico para investigar cambios en el reflujo linfático en modelos de fracturas.

Introducción

Las fracturas traumáticas suelen causar daños y hinchazón significativa en los tejidos, aumentando el riesgo de complicaciones como infección, necrosis y no unión^{ósea 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. demostraron que la disfunción del drenaje linfático, que conduce a edema tisular, está relacionada con un retraso en la^{cicatrización 3}. Los estudios indican que durante el proceso de curación de la fractura, además de la reparación del tejido óseo, el sistema linfático en el lugar de la fractura también desempeña un papel importante. Los vasos linfáticos no so....

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Centro de Organismos Modelo de Shanghái (Aprobación nº NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). En este estudio se utilizaron ratones machos C57 con modelo de fractura (6–8 semanas de edad). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cuidados preoperatorios

1. Aclimatar a los ratones durante al menos una semana con acceso ad libitum. Acceso a comida y agua. Asigna aleatoriamente los animales al grupo de fractura o simulación usando una lista de aleato....

Resultados

En los días 1, 7 y 14 tras establecer el modelo de fractura, la intensidad de fluorescencia plantar de ICG (FI_24h) a 24 horas en el grupo fracturado fue consistentemente mayor que en el grupo de cirugía simulada (Figura 3). El análisis cuantitativo relativo de la intensidad de fluorescencia de ICG a partir de imágenes plantares recogidas mostró que la tasa de eliminación de ICG linfático en el grupo fracturado fue significativamente menor que en e.......

Discusión

El protocolo incluye varios detalles fácilmente pasados por alto. Por ejemplo, el tiempo de exposición no es fijo y debe determinarse en función de la intensidad específica de fluorescencia. Sin embargo, el tiempo de exposición para el mismo grupo de ratones a 0 h y 24 h debe mantenerse constante; de lo contrario, los resultados pueden ser poco fiables. Al utilizar ultrasonidos para observación, es esencial cubrir completamente las extremidades inferiores del ratón con agente acoplador, .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	El microsyringe Hamilton 80330/00 es un instrumento de precisión con una capacidad de 10L, que cuenta con una aguja de calibre 26s, 51 mm de longitud y estilo de punta 2. Está diseñado para una entrega precisa de pequeños volúmenes en aplicaciones de cromatografía, inyección de muestras y química analítica.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	El Vevo 2100 es un sistema de imagen de ultrasonido de alta frecuencia para investigación preclínica, que proporciona visualización 3D en tiempo real de pequeños animales. Ofrece una resolución superior para estudios cardiovasculares, oncológicos y de biología del desarrollo, integrado con el software Vevo LAB para el análisis de datos.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	El etanol al 75% es una solución desinfectante ampliamente utilizada en laboratorios para la esterilización de superficies, limpieza de equipos y antisepsia. Mata eficazmente bacterias, virus y hongos mediante la denaturación de proteínas y se aplica comúnmente en entornos biológicos y clínicos.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	Los hisopos de algodón son aplicadores estériles y absorbentes utilizados para la recolección precisa de muestras, la aplicación de soluciones o limpieza en procedimientos médicos, de diagnóstico y de laboratorio. Cuentan con palos de madera o plástico con puntas de algodón para un manejo higiénico.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	El agente de acoplamiento, comúnmente conocido como gel de ultrasonido, es un medio a base de agua que se utiliza para mejorar la transmisión acústica entre el transductor de ultrasonido y la piel. Elimina los bolsillos de aire para lograr una imagen clara, no es irritante y se suministra en un contenedor de 250 mL para uso médico y de diagnóstico.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Un software científico de gráficas y análisis estadístico utilizado para el análisis, visualización y presentación de datos.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Un programa de procesamiento y análisis de imágenes basado en Java de dominio público ampliamente utilizado para el análisis de imágenes biológicas y médicas.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	El verde de indocianina es un tinte aniónico hidrosoluble utilizado en diagnósticos médicos para determinar el gasto cardíaco, la función hepática, el flujo sanguíneo hepático y la angiografía oftálmica. Se suministra en viales de 25 mg para administración intravenosa y exhibe fluorescencia en el espectro del infrarrojo cercano para fines de imagen.
isoflurance	RWD	R650-IE	El isoflurano es un anestésico general inhalado. Tiene un pequeño coeficiente de partición sangre/gas. Cuando se usa para anestesia animal, puede inducir la anestesia de manera suave, rápida y cómoda, con una recuperación rápida, buena relajación muscular y sin efecto excitatorio en el sistema nervioso simpático. La tasa metabólica del isoflurano en el hígado es baja, por lo que tiene poca toxicidad para el hígado y no hay efectos secundarios evidentes incluso con un uso repetido. Para evitar los efectos adversos del gas de desecho del anestésico en el medio ambiente y el personal del laboratorio, se recomienda usarlo junto con un sistema de recuperación de gases.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	La microbalanza FA1004B es un instrumento analítico de alta precisión diseñado para el pesaje preciso de muestras pequeñas, que ofrece una legibilidad de hasta 0.0001 g y es adecuado para aplicaciones de laboratorio que requieren mediciones precisas en investigación y control de calidad.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	El Olympus MVX10 es un sistema de microscopio de fluorescencia macro zoom optimizado para imágenes de infrarrojo cercano. Ofrece visualización de alta resolución de especímenes grandes con un amplio rango de zoom, óptica avanzada para penetración profunda en tejidos y compatibilidad con técnicas de fluorescencia en investigación biológica y de materiales.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Un paquete de software de análisis de imágenes utilizado para analizar datos de imágenes Vevo, que incluye medición, cálculo y generación de informes.