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Artículo de investigación
Este estudio demuestra que la fórmula Shengdu Pingmu alivia el estreñimiento en las ratas al aumentar el contenido de agua fecal y la propulsión intestinal. Los efectos están asociados con la activación de la vía PI3K/AKT, la regulación al alza de AQP3 y AQP8, y la modulación de la composición de la microbiota intestinal.
El estreñimiento es un trastorno gastrointestinal común, y los tratamientos actuales suelen tener limitaciones. La Fórmula Shengdu Pingmu (SDPF), una formulación modificada derivada de la Medicina Tradicional China, se ha utilizado clínicamente para tratar el estreñimiento, pero su mecanismo de acción sigue sin estar claro. Este estudio empleó análisis UPLC-Q/TOF-MS para identificar 188 compuestos en SDPF, de los cuales 50 fueron confirmados de forma concluyente. En experimentos con animales, el tratamiento con SDPF mejoró significativamente la propulsión intestinal, incrementó el contenido de agua fecal y acortó el tiempo hasta la primera heces negras. La farmacología de redes y los análisis de acoplamiento molecular sugirieron la implicación de la vía PI3K/AKT, que posteriormente fue validada por la observación de la regulación al alza de esta vía y el aumento de la expresión de AQP3 y AQP8 en el recto. Además, la secuenciación del gen 16S rRNA reveló que SDPF restauró la homeostasis de la microbiota intestinal al elevar bacterias beneficiosas como Lactobacillus y Bacteroides , al tiempo que reducía las bacterias asociadas a la inflamación. En conjunto, SDPF alivia eficazmente el estreñimiento mediante mecanismos que regulan la vía PI3K/AKT y modulan la microbiota intestinal.
El estreñimiento es un trastorno gastrointestinal generalizado caracterizado por movimientos intestinales poco frecuentes, esfuerzo y heces duras, que afecta aproximadamente al 20% de la población mundial con importantes implicacionessocioeconómicas. El estreñimiento crónico no solo causa complicaciones físicas como hemorroides, fisuras anales e impactación fecal, sino que también contribuye al malestar psicológico, incluyendo ansiedad y depresión, comprometiendo gravemente la calidad de vida de lospacientes 2. Las terapias convencionales, incluyendo laxantes osmóticos y suplementación con fibra dietética, suelen ofrecer resultados subóptimos debido a la eficacia limitada, los posibles efectos secundarios y el riesgo de dependencia3. La Medicina Tradicional China (MTC) ofrece un enfoque holístico, utilizando formulaciones herbales y acupuntura para regular la motilidad intestinal restaurando el flujo de Qi y la homeostasisvisceral 4. Sin embargo, la falta de protocolos estandarizados y de claridad mecanicista limita una adopción clínica más amplia. La investigación emergente pone de manifiesto el potencial de intervenciones novedosas, como la modulación de la microbiota intestinal y compuestos bioactivos derivados de la MTC, que pueden mejorar sinérgicamente la función intestinal con efectos adversosmínimos 5. En consecuencia, el desarrollo de una terapia integrativa basada en la evidencia que combina los principios de la MTC con la farmacoterapia moderna promete revolucionar el manejo del estreñimiento.
El estreñimiento de tránsito lento (STC) es un modelo patológico vital en la investigación básica, simulando eficazmente el característico trastorno de motilidad del estreñimiento humano: un retraso significativo en el tránsitocolónico 6. Actúa como un "decodificador" para esclarecer los mecanismos moleculares del estreñimiento, permitiendo a los investigadores examinar directamente los cambios patológicos en el tejidorectal 7, el sistema nerviosoentérico 8, las células intersticiales de Cajal9 y las vías clavede señalización 10, uniendo así los síntomas macroscópicos con anomalías celulares y moleculares fuera del alcance de los estudiosclínicos 11. A nivel internacional, los métodos establecidos para desarrollar modelos STC en ratas incluyen principalmente enfoques inducidosquímicamente 12, destacando el uso de loperamida —un agonista periférico de los receptores opioides que suprime la actividad neuronal y la liberación de acetilcolina para inducir un tránsito retrasado en 5–7 días— y estrategias que imitan laetiología 13, como la administración prolongada de laxantes estimulantes en dosis altas, que conducen a deterioro del nervio colónico, melanosis coli, y la inercia colónica dependiente de laxantes posteriores. Así, el modelo de rata STC no solo ofrece una ventana a la compleja etiología del estreñimiento, sino que también sirve como un puente crucial que conecta conocimientos mecanicistas básicos con aplicaciones clínicas.
La Fórmula Shengdu Pingmu (SDPF), que comprende Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) y Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), es una preparación hospitalaria modificada derivada de la teoría de la Medicina Tradicional China y se ha utilizado durante mucho tiempo en nuestro departamento para trastornos relacionados. Las observaciones clínicas preliminares de nuestro hospital sugirieron que la SDPF podría aliviar los síntomas de estreñimiento (datos no publicados). Las investigaciones han demostrado que la vía de señalización PI3K/AKT está implicada en la regulación de la motilidadcolónica 14, en la que la microbiota intestinal y sus metabolitos pueden desempeñar un papel crítico al modular las actividades entéricas, neuronales y musculareslisas 15. No obstante, los mecanismos regulatorios precisos siguen siendo incompletamente comprendidos. Proponemos que la vía PI3K/AKT y la microbiota intestinal forman juntas un eje esencial para regular la motilidad del colon. Se plantea la hipótesis de que los efectos terapéuticos de las formulaciones de MTC sobre la dismotilidad del colon pueden estar asociados con la modulación de la vía PI3K/AKT y el reequilibrio del eje microbiota-intestino. Este estudio aborda esta carencia proponiendo y probando una hipótesis novedosa e integrada: que la vía PI3K/AKT y la microbiota intestinal funcionan como un eje crítico e interdependiente para la motilidad del colon. El objetivo principal de este trabajo es determinar si el efecto terapéutico de la SDPF sobre el estreñimiento de tránsito lento está mediado por la modulación dual de este eje. Específicamente, utilizando un modelo de rata, investigamos los efectos de SDPF sobre proteínas clave de señalización PI3K/AKT, cambios en la composición de la microbiota intestinal y función de motilidad colónica. Al elucidar este mecanismo combinado, esta investigación proporciona, hasta donde sabemos, la primera evidencia experimental de un eje microbiota-PI3K/AKT como objetivo unificado de la intervención basada en la MTC, ofreciendo así una base molecular más completa para el tratamiento de los trastornos de motilidad del colon.
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Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Institutos Nacionales de Salud, revisada en 2011) y fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (número de licencia de ética en bienestar: SDUTCM20250421238).
Preparación del SDPF
La mezcla herbal consiste en Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g y Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Esta proporción combinada se determinó en función de la experiencia clínica. La fórmula se extrajo primero en remojo en agua desionizada a una proporción sólido-líquido de 1:9 (g/mL) durante 30 minutos, seguida de ebullición durante 60 minutos. La solución resultante se filtró inmediatamente a través de una gasa y se centrifugó a 4.500 × g durante 5 minutos para recoger el sobrenadante. El residuo se reextrajo dos veces bajo las mismas condiciones (proporción 1:9, agua desionizada) con un tiempo de ebullición reducido de 30 minutos para cada extracción posterior. Los sobrenatantes de las tres extracciones se combinaron, concentraron y liofilizaron al vacío durante 5–7 días para obtener el polvo SDPF, que se almacenó refrigerado para su uso posterior.
Análisis de los componentes de SDPF
Para preparar muestras sólidas, se transfirió una cantidad adecuada de material homogeneizado a un tubo centrífugo de 2 mL, combinado con 1 mL de metanol al 70% en agua y perlas de acero inoxidable de 3 mm, y luego se procesó en un molinillo automático durante 3 minutos, seguido de 10 minutos de vórtice. Las muestras líquidas se diluyeron con metanol puro y se pusieron en vórtice durante 10 minutos. Posteriormente, todas las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes resultantes se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm. Antes del análisis instrumental, se incorporaba 2-clorofenilalanina (estándar interno, 100 μg/mL) al filtrado para lograr una concentración final de 1 mg/L. La separación cromatográfica se realizó en un sistema LC-MS equipado con una columna de C18 (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), mantenida a 30 °C, con un caudal de 0,3 mL/min. La fase móvil consistía en 0,1% de ácido fórmico en agua (A) y acetonitrilo puro (B). El volumen de inyección se ajustó a 2 μL y el automuestreador se mantuvo a 4 °C. La detección por espectrometría de masas se realizó tanto en modos de ionización positivo como negativo bajo las siguientes condiciones: temperatura del calentador a 325 °C, gas de vaina a 45 unidades arbitrarias, gas auxiliar a 15 arb, gas de barrido a 1 arb, voltaje de electropulverización a 3,5 kV, temperatura capilar a 330 °C y nivel RF de la lente S al 55%. Los datos se adquirieron en un rango m/z de 100–1500 en modo MS de barrido completo con una resolución de 120.000, mientras que la fragmentación MS/MS se realizó en modo de adquisición dependiente de datos (dd-MS2, TopN=5) a 60.000 de resolución usando disociación colisional de mayor energía.
Experimento con animales
Setenta y dos ratas Sprague-Dawley machos (de 6 semanas, peso corporal inicial 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) se alojaron bajo condiciones de SPF (24 ± 1 °C, ciclo luz/oscuro de 12 horas) con acceso libre a comida y agua. Tras una semana de aclimatación, se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n=12/grupo) según el peso corporal: (1) control en blanco (solución salina normal), (2) grupo modelo de estreñimiento (10 mg/kg cloruro de loperamida), (3) grupos bajos (SDPF-L), (4) grupos medios (SDPF-M) y (5) dosis altas (SDPF-H) (6, 9 y 12 g/kg, respectivamente), y (6) control positivo (2 mg/kg de citrato de mosaprida). La SDPF se preparó frescamente en suspensión en agua destilada a concentraciones de 3, 4,5 y 6 g/mL y se administró por gavage oral a un volumen fijo de 2 mL/kg, correspondientes a dosis de 6, 9 y 12 g/kg, respectivamente. El clorhidrato de loperamida se preparaba fresco en suspensión en agua destilada a una concentración de 5 mg/mL y se administraba por gavage oral a un volumen fijo de 2 mL/kg (equivalente a 10 mg/kg). Tras una semana de aclimatación, el estreñimiento se indujo en grupos (2) – (6) por la inhalación oral de clorhidrato de loperamida una vez al día durante una semana. El grupo control en blanco recibió un volumen equivalente de solución salina normal. Posteriormente, durante la semana siguiente, las ratas de los grupos (3)–(5) recibieron tratamiento SDPF mediante gavage oral una vez al día, el grupo control positivo (6) recibió además citrato de mosaprida (2 mg/kg) simultáneamente, mientras que las ratas en los grupos (2) – (6) continuaron recibiendo cloruro de loperamida (10 mg/kg) una vez al día para mantener el modelo de estreñimiento. El grupo de control en blanco continuó recibiendo solución salina normal. Al final del periodo de tratamiento, todas las ratas fueron ayunadas durante la noche con acceso libre al agua. Después, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg/kg de peso corporal). Tras una anestesia profunda confirmada por la ausencia de reflejos pedales, las ratas fueron eutanasiadas por dislocación cervical. Inmediatamente después, se extrajeron rápidamente los tejidos rectales. Para análisis histológicos e inmunohistoquímicos, los segmentos tisulares se fijaron en un 4% de paraformaldehído. Para el análisis de expresión proteica, las muestras de tejido se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Primer heces negro
El tiempo hasta la excreción de las primeras heces negras se registró para tres ratas por grupo. Antes del experimento, todas las ratas estaban en ayunas durante 12 horas con acceso libre al agua. A cada animal se le administró entonces una suspensión de tinta preparada (5% carbón activado y 5% goma arábiga) a una dosis de 10 mL/kg de peso corporal, registrándose el momento exacto de administración. Tras la gavage, las ratas fueron alojadas individualmente en jaulas separadas con acceso improvisado a comida y agua. Se observó cuidadosamente y registró la aparición de las primeras heces negras de cada rata para calcular el tiempo de tránsito intestinal.
Contenido de agua fecal
Tras el establecimiento exitoso del modelo y al finalizar el tratamiento, se recogieron muestras heces frescas excretadas en un plazo de 2 horas de cada grupo de ratas (n = 6) y se colocaron en tubos EP secos previamente pesados. El peso húmedo de las heces se registró de inmediato. Posteriormente, las muestras se trasladaron a un horno de secado y se deshidrataron a 60 °C durante 36 horas. Tras el periodo inicial de secado, las muestras se pesaban y se devolvían al horno, repitiendo las mediciones de peso cada 2 horas hasta alcanzar un peso constante (indicando deshidratación total). El porcentaje de contenido de agua fecal se calculó entonces usando la siguiente fórmula:
Contenido de agua fecal (%) = [(Peso húmedo - Peso seco) / Peso húmedo] × 100%
Tasa de propulsión intestinal
Tras un periodo de ayuno de 12 horas (con acceso libre al agua), a las ratas de cada grupo (n = 6) se les administró una dosis intragástrica (10 mL/kg) de suspensión de tinta que contenía un 5% de carbón activado y un 5% de goma arábiga. Veinticinco minutos después, los animales fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de cloral hidrato al 5%. La zona abdominal se desinfectó limpiando con etanol al 75% antes de la recogida del tejido, y luego se sujetaron las extremidades a una tabla de disección. La cavidad abdominal fue cuidadosamente expuesta con tijeras quirúrgicas y se extirpó el tracto intestinal desde el pilor hasta la unión ileocecal. El intestino aislado se enderezó sobre papel filtro estéril y se registraron dos mediciones: (1) la longitud total del intestino delgado y (2) la distancia recorrida por la parte frontal de la tinta. La relación de propulsión intestinal se calculó entonces usando la siguiente fórmula:
Tasa de propulsión intestinal (%) = (Distancia de migración de la tinta / Longitud intestinal total) × 100%
Mancha HE
Para los grupos control, modelo, SDPF-M y Mos (n = 3 por grupo), se recogieron y procesaron muestras rectales para la tinción de hematoxilina y eosina (HE). Los ejemplares se fijaron en un 4% de paraformaldehído, se deshidrataron en etanol graduado e incrustaron bloques de parafina. Se prepararon secciones delgadas, de 4 a 5 μm de grosor, y se colocaron a portaobjetos de vidrio antes de someterse a la tinción convencional de hematoxilina y eosina. El procedimiento comenzó con la deparafinización usando xileno, seguida de rehidratación mediante una serie de concentraciones descendentes de etanol. Los núcleos se tiñeron exponiendo secciones a hematoxilina durante 5–8 minutos. Tras la diferenciación en alcohol ácido al 1% y el azulado en agua al 0,2% de amoníaco, el citoplasma y la matriz extracelular se contra-teñieron con eosina durante 1–2 minutos. Finalmente, las secciones teñidas se deshidrataron, limpiaron y montaron cubiertas para observación microscópica. Este enfoque permitió una evaluación detallada de la morfología mucosa intestinal, incluyendo la estructura de las vellosidades y criptas, el estado de las células epiteliales y la presencia de infiltrados inflamatorios en la lámina propia.
Análisis de enriquecimiento de vías KEGG y GO
Aprovechando el perfil químico previamente establecido de SDPF, se realizaron predicciones de sílice de los objetivos proteicos para cada componente utilizando la plataforma SwissTargetPrediction. Los objetivos potenciales relevantes para el estreñimiento fueron filtrados y sometidos a anotación funcional utilizando la base de datos DAVID 6.8, con un corte de significancia de P < 0,05. El conjunto de genes resultante fue posteriormente sometido a clasificación GO para esclarecer sus roles en procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares. Para aclarar aún más su implicación en la patogénesis de la enfermedad, estos objetivos fueron posteriormente mapeados en las vías KEGG, revelando varias cascadas de señalización que se enriquecieron significativamente y podrían implicar en el inicio y desarrollo del estreñimiento.
Construcción de la red "Componente-Objetivo-Camino"
En Cytoscape (versión 3.6.1) se ensambló una red "Componente-Objetivo-Vía" integrando sistemáticamente los constituyentes químicos de SDPF, sus respectivos objetivos terapéuticos para el estreñimiento y las correspondientes vías enriquecidas. Dentro de este modelo gráfico, se emplearon diferentes geometrías de nodos para representar los tres tipos de datos: círculos para compuestos, triángulos para objetivos y rectángulos para caminos. La fuerza de las conexiones entre estos nodos se cuantificó mediante ponderación de aristas, proporcionando una visión holística de las intrincadas interacciones farmacológicas multilayer.
Acoplamiento molecular
Para el análisis de acoplamiento molecular, se seleccionaron cuatro compuestos bioactivos —a saber, ciclocurcumina, albiflorina, ácido clorogénico y quercetina— como moléculas de ligando, con sus estructuras descargadas de la base de datos PubChem usando los correspondientes números de registro CAS. Para preparar los receptores proteicos, se consultó la base de conocimientos UniProt para confirmar las proteínas objetivo PI3K y AKT, y sus estructuras tridimensionales fueron posteriormente recuperadas del Banco de Datos de Proteínas RCSB. Estas estructuras de proteínas y compuestos fueron procesadas en Discovery Studio 2019, donde se añadieron átomos de hidrógeno, se asignaron cargas y se definieron tipos de átomos; Además, se identificaron posibles bolsas de unión en los receptores. Los ligandos y receptores preparados se guardaron posteriormente en formato PDBQT para simulaciones de acoplamiento. El procedimiento de acoplamiento se realizó con la siguiente configuración: un radio de clúster de pose de 0,5, generación de 10 conformaciones aleatorias de ligandos y 10 orientaciones de refinamiento. Tras completar las misiones de acoplamiento, los complejos candidatos fueron evaluados y clasificados según sus energías libres de enlace previstas. Las posturas de unión más favorables energéticamente fueron finalmente seleccionadas y visualizadas usando PyMOL para ilustrar interacciones intermoleculares clave.
Inmunohistoquímica
Las muestras rectales incrustadas en parafina, cortadas a un grosor de 4 μm y obtenidas de las cohortes de tratamiento Control, Modelo y SDPF-M, fueron primero eliminadas de parafina y se hidrataron progresivamente. Los sitios antigénicos se desenmascararon calentando las láminas en un tampón de citrato ajustado a pH 6,0. Para apagar las peroxidasas endógenas, los tejidos se trataron con una solución de peróxido de hidrógeno al 3%, seguida de incubación con suero de cabra normal para reducir la unión inespecífica de anticuerpos. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios dirigidos a PI3K y AKT fosforilados; Las secciones paralelas incubadas con PBS sirvieron como controles negativos. Tras un lavado exhaustivo, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y se desarrolló la inmunotinción utilizando un cromógeno DAB bajo observación microscópica para controlar el tiempo de reacción. Finalmente, los tejidos se contratinyeron ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron mediante alcoholes graduados, se limpiaron y se montaron. Los niveles de expresión de p-PI3K y p-AKT fueron evaluados cualitativamente por dos investigadores independientes que no se identificaron con los grupos experimentales, y se seleccionaron imágenes representativas para ilustrar las diferencias entre los grupos.
Western blot
Las muestras de tejido rectal de ratas se enjuagaron dos veces con solución salina fría protegida con fosfato antes de homogeneizarse sobre hielo durante 10 minutos en un volumen adecuado de tampón lisis RIPA. Tras la homogeneización, la mezcla se centrifugó a 15.000 × g y el sobrenadante se conservó para su análisis. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el método del ácido bicinconínico. Posteriormente, las muestras se combinaron con el tampón de carga SDS y se desnaturalizaron mediante incubación a 95 °C durante 5 minutos. Las cantidades equivalentes de proteínas se resolvieron entonces mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se electrotransfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno con un tamaño de poro de 0,45 μm. Tras la transferencia, las membranas se dejaron secar al aire antes de ser bloqueadas con leche seca desnatada al 5% en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras este paso, las membranas se enjuagaron con TBST y luego se incubaron durante la noche a 4 °C, con anticuerpos primarios dirigidos a AQP3 (RRID: AB_2837708) y AQP8 (RRID: AB_605941). Al día siguiente, tras lavados adicionales con TBST, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante correspondiente durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se detectaron bandas inmunorreaccionantes y se capturaron mediante un sistema de imagen.
Inmunofluorescencia
El procedimiento de tinción por inmunofluorescencia se realizó en secciones de tejido rectal de ratas tratadas con Control (Model), modelo y tratadas con SDPF-M, de la siguiente manera: tras la criosección, los tejidos se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 y se bloquearon con un tampón bloqueador adecuado para evitar la unión inespecífica. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con una mezcla de anticuerpos primarios contra AQP3 y AQP8, tras lo cual se lavaron los anticuerpos no unidos y los tejidos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con una mezcla de anticuerpos secundarios—concretamente, IgG anticonejo conjugado a Alexa Fluor 594 (rojo) para marcar AQP3 y IgG anti-ratón de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (verde) para marcar AQP8. Tras la incubación secundaria de anticuerpos y lavados posteriores, los núcleos celulares se contrateñieron con DAPI, y las láminas se cubrieron con un medio acuoso antes de la visualización y adquisición de imagen mediante microscopio de fluorescencia o confocal.
Secuenciación de ARNr 16S en la microbiota fecal
Para cada grupo experimental (n = 8), se aisló ADN genómico bacteriano de material fecal de rata utilizando un kit comercial de extracción de ADN de suelo, siguiendo estrictamente el protocolo del proveedor. La amplificación por PCR dirigida a las regiones hipervariables V3–V4 del gen 16S rRNA se realizó en un ciclador térmico utilizando el par cebador 338F/806R. La secuenciación de amplicones se realizó en la plataforma Illumina MiSeq según las directrices del fabricante, generando suficiente profundidad de secuenciación para lograr saturación de la curva de rarefacción y garantizar un análisis fiable de la diversidad microbiana. Al finalizar la secuenciación, las lecturas en bruto se filtraron por calidad, eliminaron el adaptador y se fusionaron usando Trimmomatic y FLASH. Las secuencias de alta calidad se agruparon posteriormente en unidades taxonómicas operativas (OTUs) con un umbral de similitud del 97% usando UPARSE, y las posibles secuencias quiméricas se identificaron y eliminaron usando UCHIME. La asignación taxonómica de secuencias representativas se realizó utilizando el clasificador RDP frente a la base de datos de referencia SILVA, con un umbral de confianza del 70%. Para evaluar la diversidad alfa dentro de las comunidades microbianas, se calcularon el estimador de riqueza de Chao1 y el índice de diversidad de Shannon utilizando el paquete de software Mothur (v.1.30.2). Para el análisis de beta-diversidad, se realizó análisis de coordenadas principales para visualizar las diferencias composicionales entre grupos. Se construyó un diagrama de Venn para ilustrar la distribución de OTUs únicas y compartidas a través de diferentes condiciones experimentales. La identificación de taxones diferencialmente abundantes entre cohortes se realizó mediante análisis discriminante lineal tamaño del efecto. Por último, se realizó un perfilado predictivo de las funciones de la comunidad microbiana utilizando PICRUSt2, que infirió potencial funcional a partir de anotaciones ortológicas de KEGG.
Estadísticas
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 23.0 y GraphPad Prism 8.0. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). La normalidad de la distribución de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro–Wilk. Para comparaciones entre dos grupos, se utilizó la prueba t de Student con muestras independientes para datos distribuidos normalmente, y la prueba U de Mann–Whitney para datos distribuidos de forma no normal. Para comparaciones que involucran tres o más grupos, se empleó análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido por la prueba post-hoc de Tukey para datos distribuidos normalmente, mientras que para datos no distribuidos normalmente se empleó la prueba de Kruskal–Wallis seguida por la prueba post-hoc de Dunn. Para análisis del microbioma, se identificaron taxones diferencialmente abundantes utilizando el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) con el umbral por defecto (puntuación LDA > 2,0), y se aplicó corrección con múltiples pruebas utilizando el método de tasa de descubrimiento de errores (FDR) de Benjamini–Hochberg. Se realizaron análisis estadísticos del microbioma utilizando Mothur (v.1.30.2), LEfSe (herramienta online, laboratorio de Huttenhower) y PICRUSt2 (v.2.5.0). Se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05.
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Extracción y liofilización de SDPF
SDPF es una formulación multihierba que comprende cinco plantas medicinales: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) y Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Figura 1A). La mezcla se extrajo con agua purificada y se liofilizó hasta convertirse en polvo para un análisis pos...
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El estreñimiento crónico es un trastorno multifactorial que implica interacciones complejas entre la microbiota intestinal, la disbiosis, el deterioro de la función neuromuscular y la alteración de la secreción intestinal. Estas manifestaciones persisten durante más de seis meses y afectan significativamente la calidad de vida de lospacientes 19. El estreñimiento puede clasificarse en varios subtipos, incluyendo tránsito lento, tránsito normal, trastorno de defeca...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Financiación: Esta investigación fue apoyada por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (subvención nº JCYJ20220531092203007).
Estamos profundamente agradecidos al Dr. Liqun Qu de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong por proporcionar orientación técnica en el establecimiento del modelo de estreñimiento de ratas.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Moledor automático | Homogeneizador de tejido de alto rendimiento para molienda de muestras | JXFSTPRP-48 | |
| Sistema LC-MS | Thermo Fisher Scientific | Sistema HF LC-MS exactivo Q | Cromatografía líquida de ultra-alto rendimiento y guion; Sistema de espectrometría de masas |
| Espectrómetro de masas | Thermo Fisher Scientific | P HF exactivo | Espectrómetro de masas Orbitrap de alta resolución |
| Columna C18 | Agilent Technologies | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 y multiplicado por 100 mm, 1,8 y mu; m) | Columna de fase inversa para separación de compuestos |
| Sistema de escaneo de imágenes | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | Sistema de imagen en gel y blot |
| Termociclador | Biosistemas Aplicados (Thermo Fisher Scientific) | Sistema de PCR GeneAmp 9700 | Instrumento de amplificación por PCR |
| Kit de extracción de ADN en suelo | Omega Bio-Tek | D5625 | Kit para la extracción de ADN microbiano a partir de muestras fecales/de suelo |
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