Efectos bioquímicos e histopatológicos de la hirudoterapia en un modelo de rata de estrés fisiológico inducido por el ejercicio crónico

Resumen

Este protocolo establece un modelo de rata de estrés fisiológico crónico inducido por el ejercicio para investigar las respuestas al estrés. Permite una evaluación controlada de las interacciones hirudoterapia–ejercicio mediante perfilado bioquímico sérico y análisis histopatológico. Proporciona un marco reproducible para estudiar los mecanismos de recuperación tras el ejercicio.

Resumen

El ejercicio crónico puede inducir estrés fisiológico caracterizado por daño muscular, desequilibrio oxidativo y alteraciones hormonales, lo que puede afectar la recuperación y el rendimiento. La hirudoterapia, una intervención bioterapéutica tradicional que contiene componentes antiinflamatorios, antioxidantes y que mejoran la circulación, ha despertado interés como una posible estrategia natural de recuperación. Este estudio tenía como objetivo evaluar los efectos bioquímicos e histopatológicos de la hirudoterapia tras el ejercicio crónico en un modelo de rata de estrés fisiológico inducido por el ejercicio. Treinta y dos ratas machos fueron asignadas a cuatro grupos: control, hirudoterapia, ejercicio y hirudoterapia más ejercicio. Se analizaron los parámetros bioquímicos séricos y los marcadores de estrés oxidativo, y se examinaron histopatológicamente los músculos esqueléticos y los tejidos hepáticos para evaluar alteraciones inducidas por el ejercicio y posibles efectos moduladores de la hirudoterapia. Las ratas expuestas a ejercicio crónico mostraron indicadores bioquímicos y estructurales de estrés fisiológico. La hirudoterapia se asoció con una atenuación parcial de estas alteraciones, especialmente en los hallazgos histopatológicos, mientras que los cambios en los marcadores de estrés oxidativo no fueron estadísticamente significativos. Estos hallazgos sugieren que la hirudoterapia puede ejercer un efecto modulador sobre los procesos de recuperación tras el ejercicio; sin embargo, se requieren más estudios para aclarar su impacto en las vías de estrés oxidativo.

Introducción

Las prácticas médicas tradicionales se han utilizado en una amplia variedad de contextos clínicos para el manejo de diversas condiciones agudas y^{crónicas 1,2}. Entre ellas, la terapia medicinal con sanguijuelas (hirudoterapia) tiene una larga historia de uso en diferentes culturas y sistemas médicos. En los últimos años, este enfoque tradicional ha recuperado el interés científico debido a sus posibles efectos terapéuticos en diversas condiciones clínicas, incluyendo enfermedades inflamatorias, osteoartritis y trastornos^{vasculares 1,2,3}. Estos efectos se deben principalmente a la compleja mezcla de moléculas bioactivas presentes en la saliva de sanguijuela, que presentan propiedades anticoagulantes, antiinflamatorias y ^{antimicrobianas 3,4,5}. Además, estudios experimentales en modelos animales han demostrado que la hirudoterapia puede ejercer efectos protectores contra la lesión tisular mediante mecanismos antioxidantes, antiinflamatorios y^{apoptóticos.}

La saliva de Hirudo verbana, la especie más utilizada en terapias, contiene una amplia variedad de componentes bioactivos, incluyendo hirudin, bdellin, eglin y calin, así como enzimas como la hialuronidasa y varios metabolitos de bajo peso molecular. Estos componentes presentan actividades anticoagulantes, antiinflamatorias, antioxidantes, fibrinolíticas, analgésicas y^{anticancerígenas 2,7}. Este amplio perfil de actividad biológica sugiere que la saliva de las sanguijuelas (LS) puede servir como una herramienta terapéutica complementaria en aplicaciones biomédicas modernas; sin embargo, sus efectos sistémicos bajo condiciones específicas de estrés fisiológico siguen siendo incompletamente^{comprendidos 3}.

La actividad física intensa o prolongada puede inducir daños microestructurales en las membranas musculares, lo que conduce a aumentos significativos en los niveles séricos de enzimas como la creatina quinasa (CK), la lactato deshidrogenasa (LDH) y la aspartato aminotransferasa (AST). La alanina aminotransferasa (ALT) también puede aumentar en respuesta a una lesión muscular, aunque normalmente en menor medida que la^{AST 5,8,9}. Además, el ejercicio de alta intensidad o de larga duración desencadena elevaciones del cortisol, una hormona clave del estrés, con respuestas que varían según la intensidad del ejercicio, la duración y el estado fisiológico^{individual 10,11}. También pueden producirse aumentos de glucosa en sangre tras el ejercicio, impulsados en gran medida por la gluconeogénesis mediada por el cortisol, que representa una característica distintiva de la respuesta al estrés^{metabólico 12}. En conjunto, estos hallazgos demuestran que tanto los marcadores bioquímicos de daño muscular como los indicadores de estrés metabólico tienden a aumentar tras un ejercicio^{intenso 5}.

Se han investigado diversas estrategias, incluyendo masajes, inmersión en agua fría y suplementos nutricionales ricos en antioxidantes (por ejemplo, polifenoles, extracto de cereza ácida y curcumina), para determinar su potencial para apoyar la recuperación tras el ejercicio. Las revisiones sistemáticas sugieren que estas intervenciones pueden influir en los parámetros del estrés oxidativo y del daño muscular; sin embargo, su efectividad varía considerablemente entre individuos y puede no proporcionar de forma consistente una protección bioquímica^suficiente 13,14,15. Por ello, existe un interés creciente en explorar enfoques alternativos o complementarios que puedan aportar beneficios adicionales bajo condiciones de estrés fisiológico inducido por el ejercicio. En este contexto, se ha informado que los compuestos bioactivos presentes en la saliva de las sanguijuelas modulan el estrés oxidativo y las respuestas^{inflamatorias 7}. Además, las observaciones clínicas sugieren que la hirudoterapia puede reducir el dolor y la inflamación, especialmente en afecciones musculoesqueléticas y^vasculares.

Varios compuestos identificados en el LS, incluidos flavonoides, moléculas fenólicas y otros constituyentes bioactivos, contribuyen a la atenuación de las respuestas inflamatorias mediante la modulación de las vías de estrés oxidativo. Estas propiedades antioxidantes pueden actuar en sinergia con otros componentes salivales, aumentando el potencial antiinflamatorio global de la hirudoterapia ^7,16. Además, se ha demostrado que inhibidores de proteasas como bdellin y eglin reducen la actividad de enzimas derivadas de neutrófilos, limitando así el daño^{tisular 4}. Además, se ha reportado que varios péptidos y moléculas derivadas de lípidos identificadas en tejidos de sanguijuelas ejercen efectos inhibidores sobre las vías de señalización^{inflamatoria 17}.

A pesar de estos hallazgos, el posible papel de la hirudoterapia en el estrés fisiológico inducido por el ejercicio sigue siendo insuficientemente explorado, especialmente en los modelos experimentales ^{controlados 1,2,4}. Aunque estudios previos han demostrado sus efectos antiinflamatorios, anticoagulantes y microcirculatorios, y se sabe que el ejercicio induce daño muscular y respuestas al estrés^oxidativo, los estudios que integran resultados bioquímicos, hormonales e histopatológicos dentro de un único marco experimental son limitados.

Por ello, el presente estudio fue diseñado para proporcionar una evaluación experimental integral de la hirudoterapia en un modelo controlado del estrés fisiológico inducido por el ejercicio, integrando resultados bioquímicos, hormonales e histopatológicos. Este enfoque multidimensional tiene como objetivo contribuir a la comprensión de los posibles efectos moduladores de la hirudoterapia y proporcionar un marco reproducible para evaluar intervenciones bioterapéuticas complementarias.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices^{ARRIVE 19}. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité Local de Ética para Experimentos con Animales de la Universidad Kırşehir Ahi Evran (Aprobación: 06/03/2025-05-1, Turquía). Todos los procedimientos cumplían con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Selección y alojamiento de animales

Se utilizaron treinta y dos ratas albinas Wistar machos (RRID: RGD_2308852; 8–12 semanas, 200–250 g). Los animales se alojaban individualmente en jaulas de policarbonato (40 cm × 25 cm × 20 cm) con cama de afeitado de madera. Las condiciones ambientales se mantuvieron entre 22 y 24 °C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Se proporcionaban comida y agua ad libitum.

Se realizó un periodo de aclimatación de 1 semana antes de la experimentación. Durante este periodo, los animales eran monitorizados diariamente para su ingesta de alimento, estado de hidratación, comportamiento de acicalación y actividad locomotora. Solo se incluyeron animales que mostraron un comportamiento fisiológico normal.

2. Grupos experimentales y aleatorización

Los animales fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos experimentales (n = 8 por grupo) mediante una secuencia de aleatorización generada por ordenador. Se aseguró la ocultación asignando a los animales identificadores numéricos antes de la asignación de grupos. Los grupos experimentales consistieron en el grupo control (C), que no recibió intervención; el grupo de ejercicio (E), que solo realizaba ejercicios en cinta de correr; el grupo de hirudoterapia (H), que recibía hirudoterapia solo tres veces por semana; y el grupo combinado de hirudoterapia y ejercicio (HE), que se sometió a ambas intervenciones según el protocolo del estudio. Todas las intervenciones se realizaron durante un periodo de 2 semanas. Para minimizar la variabilidad circadiana, todos los procedimientos se realizaron entre las 09:00 y las 11:00 de la mañana.

3. Protocolo de ejercicio crónico

El ejercicio se realizaba utilizando una cinta de correr motorizada para roedores equipada con una rejilla de estimulación eléctrica ajustable. Los animales se colocaron en carriles individuales del aparato de la cinta de correr (Figura 1). Se llevó a cabo una fase de adaptación de 2 días a una velocidad de 15 m/min durante 15 min/día. Tras el periodo de adaptación, la intensidad del ejercicio aumentó a 20 m/min y los animales fueron sometidos a sesiones diarias de carrera de 45 min/día durante 2 semanas. Se aplicaba un estímulo eléctrico leve (1,0 mA ) a través de la red cuando era necesario para mantener un funcionamiento continuo.

1. Criterios de agotamiento
   El agotamiento se definió como la incapacidad de salir de la rejilla de choque durante tres estimulaciones consecutivas (~5 s cada una). Los animales que alcanzaban este umbral eran eliminados inmediatamente. Este protocolo se adaptó a partir de modelos previamente establecidos en roedores con ejercicios en cinta de correr con criterios definidos de adaptación, progresión de intensidad y agotamiento²⁰.
2. Aplicación de la hirudoterapia
   Las sanguijuelas medicinales (Hirudo verbana, ~2 g) se obtuvieron de una fuente certificada institucionalmente. Antes de aplicarla, la región dorsal de cada animal se afeitaba con una máquina de cortar eléctrica y la piel se limpiaba suavemente con solución salina estéril, sin antisépticos, para evitar la fijación de sanguijuelas. Después, los animales se colocaban en un tubo acrílico transparente para limitar el movimiento y minimizar el estrés. Se colocó una sola sanguijuela en la línea media dorsal, y la fijación oral se confirmó visualmente con una fijación oral por succión. Se permitió la alimentación durante 10 minutos (Figura 2). Tras el periodo de aplicación, las sanguijuelas se desprendieron exponiendo la zona de fijación al 70% de vapor de etanol mediante un aplicador de algodón situado aproximadamente a 1–2 cm del lugar. Tras el desprendimiento, el sangrado local se controló con gasas estérils usando una presión suave durante aproximadamente 1–2 minutos, sin sutura. Las solicitudes se realizaron tres veces por semana durante 2 semanas. Este procedimiento se llevó a cabo basándose en protocolos de hirudoterapia experimental y clínica previamente descritos con parámetros de aplicación^{estandarizados 21}.

4. Eutanasia y extracción de sangre

Al final del experimento (24 horas después de la última intervención⁾⁶, los animales fueron anestesiados intraperitonealmente con ketamina (75 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Se confirmó una profundidad adecuada de anestesia por la ausencia de retirada del pedal y reflejos corneales. A continuación, se realizó la extracción de sangre intracardíaca utilizando una jeringuilla estéril de 5 mL mediante punción ventricular izquierda. La eutanasia se completó con exanguinación seguida de toracotomía. Posteriormente, se recogieron el músculo gastrocnemio medial y los tejidos hepáticos para análisis adicionales. Las muestras de sangre se procesaron en menos de 1 hora tras la recogida transfiriéndolas a tubos activadores de coágulos y centrifugándolas a 1.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. El suero separado se aliquote en porciones de 200 μL y se almacenó a −80 °C hasta el análisis.

5. Análisis bioquímico y ELISA

Los parámetros bioquímicos, incluyendo ALT, AST, LDH, CK, glucosa, electrolitos y cortisol, se analizaron mediante un analizador bioquímico automatizado según procedimientos de laboratorio estandarizados. Todos los ensayos ELISA para CAT, SOD, MDA y GPX se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante bajo condiciones estandarizadas. Las muestras de suero se diluyeron 1:5 con buffer de muestra cuando el protocolo del kit lo requería. Posteriormente, se añadieron 50 μL de estándares y 50 μL de muestras de suero a los pozos designados e incubados a 37 °C durante 60 minutos. Tras la incubación, las placas se lavaron cinco veces utilizando el tampón de lavado proporcionado para eliminar los componentes no unidos. El anticuerpo de detección (50 μL) se añadió a cada pozo e incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después, se añadió la solución de sustrato y la mezcla de reacción se incubó durante 10–15 minutos en condiciones oscuras para permitir el desarrollo del color. La reacción se terminaba añadiendo 50 μL de solución de parada, y la densidad óptica se medía a 450 nm usando un lector de microplacas. Todas las muestras se analizaron en duplicado para garantizar la fiabilidad analítica y la reproducibilidad.

6. Análisis histopatológico

Para la evaluación histopatológica, las muestras de tejido se procesaron según procedimientos histopatológicos estándar²². Los tejidos se fijaron inicialmente en formalina neutral amortiguada al 10% durante 72 horas, seguida de deshidratación mediante una serie de etanol graduado compuesta por 50%, 70%, 80%, 96% y 100% etanol, con incubación de 1 hora en cada concentración. Tras la deshidratación, los tejidos se limpiaron en xileno durante dos periodos consecutivos de 30 minutos y posteriormente se incrustaron en bloques de parafina. Se obtuvieron secciones de 5 μm de espesor utilizando un microtomo rotatorio y se teñieron con hematoxilina y eosina (H&E) y Tricromo de Masson para examen histológico. Finalmente, las láminas teñidas se examinaron utilizando un microscopio óptico equipado con un sistema de imagen digital.

7. Análisis estadístico

El análisis de datos se realizó mediante software estadístico. La distribución de los datos se evaluó utilizando la prueba de Kolmogorov–Smirnov. Para datos normalmente distribuidos, se aplicó ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey. Para datos de distribución no normal, se utilizó la prueba de Kruskal–Wallis seguida de la prueba Mann–Whitney U. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

Resultados

Parámetros de daño muscular y fatiga

Los marcadores de daño muscular sérico revelaron que los niveles de creatina quinasa (CK) diferían significativamente entre los grupos (p < 0,05). Aunque los valores de LDH, AST y ALT mostraron tendencias al alza en el grupo de ejercicio (E), estos cambios no fueron estadísticamente significativos (p > 0,05). Las concentraciones de CK fueron más altas en el grupo E, mientras que el grupo H...

Discusión

Este estudio demostró que la hirudoterapia se asoció con cambios medibles en parámetros seleccionados relacionados con el estrés fisiológico inducido por el ejercicio. Las elevaciones en CK, LDH, AST y ALT observadas en el grupo de ejercicio reflejan alteraciones sarcolemmáticas y fuga enzimática, coherentes con informes previos que describían estos marcadores como indicadores de tensión muscular 23,24,25.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
-80°C; C Congelador (Modelo DF590)	Nü ve	DF590	Almacenamiento de muestras en − 80º C
Tubo de contención acrílico	N/A	N/A	Restringente acrílico transparente (6 cm de diámetro, 20 cm de longitud) utilizado para la inmovilización durante la hirudoterapia
Analizador Bioquímico Automatizado (Alinity)	Abbott	N/A	Utilizado para el análisis de parámetros bioquímicos séricos
Procesador automático de tejidos	Leica Biosystems	N/A	Deshidratación tisular e infiltración de parafina
Centrífuga (Modelo FC5706)	Corporación OHAUS	FC5706	Velocidad máxima: 6000 rpm (&asínpico; 4.000 y veces g, dependiendo del radio del rotor)
Cámara de microscopio digital (Axiocam 208 en color)	Carl Zeiss	Axiocam 208 color	Adquisición de imágenes para histopatología
Eosina Y (amarillenta)	Merck / Sigma-Aldrich	1.15935.0025	H& Tinción por E (componente de eosina)
Etanol absoluto (99,5%)	Tekkim Kimya	TK.200655.05001	Utilizado para series de deshidratación por etanol
Solución de formaldehído (~37%)	Merck / Sigma-Aldrich	1.04002.2500	Utilizado para la fijación de tejidos
Solución de hematoxilina de Harris	BESTLAB	BS-002	H& Tinción por E (componente de hematoxilina)
Clorhidrato de ketamina	Grado farmacéutico (fuente comercial no especificada)	N/A	Usado para anestesia intraperitoneal (75 mg/kg)
Microscopio óptico (Primo Star)	Carl Zeiss	Estrella Primo	Imagen histopatológica
Masson' s Kit de tinte tricromo	GBL	REF 5022	Utilizado para la tinción de tejido conectivo
Cinta de correr motorizada para roedores	Columbus Instruments	Exer-3/6	Utilizado para ejercicios estandarizados en cinta con velocidad controlada y estimulación eléctrica
Kit ELISA de Catalase Rata (CAT)	BT LAB	E0869Ra	placa de 96 pozos; Medición de la actividad del TAC en suero
Kit ELISA de peroxidasa de glutatión para ratas (GPX1)	Reed Biotech	RE2557R	placa de 96 pozos; Medición de la actividad del TAC en suero
Kit ELISA de Malondialdehído de Rata (MDA)	BT LAB	E0156Ra	placa de 96 pozos; Medición de la actividad del TAC en suero
Kit ELISA de Dismutasa de Superóxido de Rata (SOD)	BT LAB	E0168Ra	placa de 96 pozos; Medición de la actividad del TAC en suero
Microtomo rotatorio (Autocut)	Leica Biosystems	RM Autocut	Corte 5 y mu; Secciones de parafina m
Calentador de corredera	Leica Biosystems	HI1210	Portaobjetos de histoología de secado
Clorhidrato de xilazina	Grado farmacéutico (fuente comercial no especificada)	N/A	Usado para anestesia intraperitoneal (10 mg/kg)
Xileno (mezcla de isómeros)	Tekkim Kimya	TK.090270.05003	Limpieza de tejidos antes de la incrustación de parafina