Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

Summary

Aquí describimos un método para la visualización basada en células, la localización subcelular y el análisis cuantitativo de focos enriquecidos con poli(ADP-ribosa) (PAR) en células fijas de mamíferos. Este ensayo permite cuantificar los sitios de activación de PARP inducida por daño al ADN, incluyendo los asociados con la reparación por escisión de bases o la reparación de rotura de cadena simple, en los núcleos de células expuestas a genotoxinas.

Abstract

La poli(ADP-ribosa) (PAR) es un polímero de ADP-ribosa sintetizado por cuatro miembros de la familia de enzimas ADP-ribosa polimerasa: PARP1, PARP2, PARP5a y PARP5b. Sin embargo, solo PARP1 y PARP2 sintetizan PAR en respuesta a rupturas de ADN. La PAR se define como una modificación postraduccional de proteína, pero también se ha demostrado que existe como una modificación del ADN o ARN. Los niveles de PAR están además regulados por PARG, una glicohidrolasa PAR que, junto con PARP1 y PARP2, modula el nivel celular de PAR inducida por daño al ADN. La síntesis dinámica y degradación de la PAR es fundamental para su papel regulador en la reparación del ADN y la respuesta al daño en el ADN, que a su vez afecta la reorganización, replicación, transcripción y muerte celular de la cromatina. La activación de PARP1/PARP2 y la acumulación de PARP pueden considerarse sitios de reparación continua por escisión de bases o reparación de rotura de cadena simple de ADN; sin embargo, numerosos activadores de PARP1/PARP2 también están asociados con el estrés de replicación y otros procesos metabólicos del ADN. Una vez formadas, las cadenas PAR facilitan el reclutamiento de factores de reparación del ADN y respuesta al daño al ADN (DDR) en los sitios de daño al ADN o insulto genómico a través de sus dominios de unión al PAR (PBDs). Diez PBDs diferentes reconocen diversas regiones de la molécula de PAR, incluyendo el motivo de unión a PAR, el dedo de zinc que se une a PAR, el dominio WWE y el macrodominio, entre otros PBDs. Para facilitar el análisis celular de la dinámica de PAR, utilizamos PBDs fusionados con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) para optimizar la cuantificación celular de focos de PAR. Describimos un ensayo que utiliza un fragmento de RNF146 que codifica el dominio PBD/WWE, vinculado a EGFP, para visualizar y cuantificar la acumulación de PAR en sitios de insulto genómico y BER o SSBR en curso. Describimos pasos experimentales, incluyendo la producción de partículas lentivirales, la transducción de la línea celular objetivo, el tratamiento de células de mamíferos para inducir daño genómico al ADN, la adquisición de micrografías de fluorescencia confocal y la cuantificación semiautomatizada de los datos.

Introduction

Este protocolo describe el ensayo LivePAR, que permite la visualización y el análisis cuantitativo de poli(ADP-ribosa) (PAR) en sitios de insulto genómico, principalmente asociados con la reparación por escisión de bases (BER) o la reparación de ruptura de cadena simple (SSBR), en células de ^{mamíferos 1,2,3}. La BER es una vía crucial de reparación del ADN que elimina bases dañadas o modificadas del ADN (para revisiones sobre BER y PARilación, véase 4,5,6,7). La BER comienza con ADN glucosilasas que reconocen y extienden bases^{modificadas 4}, dejando un sitio apurínico/apirimidínico (AP), por ejemplo, la metilpurina glicosilasa (MPG), que elimina las bases^{metiladas 8,9}, o la 8-oxoxaguanina glicosilasa (OGG1), que elimina la 8-oxoG ^9,10. Los sitios AP son luego escindidos por la endonucleasa AP 1 (APE1)11,12,13, creando una mella en la columna vertebral del ADN. Una polimerasa, es decir, la ADN polimerasa β (Polβ)^14,15, ajusta y rellena el hueco usando la hebra intacta como plantilla, y finalmente, las ligases de ADN sellan la hebra^{reparada 16,17}, por ejemplo, la ligasa I o ligasa III.

Los actores clave en BER y SSBR son las poli(ADP-ribosa) polimerasas 1 y 2 (PARP1/PARP2)^18,19,20, enzimas que detectan rápidamente rupturas de cadenas de ADN durante BER o SSBR. Al detectar estas rupturas, PARP1/PARP2 cataliza la adición de polímeros ADP-ribosa a sí mismo y a otras proteínas—un proceso llamado PARylation (para revisión,^{véase 6})—hidrolizando ^NAD+. Esto crea un andamiaje dinámico de proteínas (PAR) que recluta otros factores de reparación del ADN hacia el lugar del daño, mejorando la fidelidad de la reparación del ADN. Para gestionar este andamiaje dinámico de PAR, varias proteínas contribuyen a la hidrólisis y eliminación de cadenas de PAR, incluyendo la hidrolasa aceptora de ADP-ribosa 3 (ARH3), la hidrolasa terminal ADP-ribosa glicosil 1 (TARG1), la mono-ADP-ribosil hidrolasa 1/2 (MacroD1/2) y la poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa (PARG⁾ 6,21,22,23,24,25,26 . Sin embargo, PARG es el principal responsable de este^{proceso 21,27} y desempeña un papel crucial en la respuesta al daño al ADN (DDR^)28,29.

Por tanto, PARG está vinculado de forma crítica a la función de PARP1 y PARP2. Mientras que PARP1 y PARP2 crean los polímeros PAR, PARG actúa como una enzima de "limpieza", hidrolizando estos polímeros y invirtiendo efectivamente la PARilación^30,31. Este proceso es esencial para completar tanto el BER como el SSBR y permitir que PARP1/PARP2 se recicle y responda a nuevos daños en el ADN. En consecuencia, PARP1, PARP2, PARylation y PARG trabajan de manera coordinada, asegurando una reparación eficiente y reversible del ADN mediante BER y SSBR ^4,6.

El grado de la PARylation puede verse influenciado por diversos factores y desempeña un papel esencial en la respuesta global al daño del^{ADN 32}. Estos factores incluyen la exposición a genotoxinas que añaden aductos a las bases del ADN, como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metilmetanasolifenonato (MMS), peróxido de hidrógeno (_{H2O 2}) o tert-butil hidroperóxido (tBuOOH). Además, el grado de PARylation puede verse influenciado por moléculas que modulan el proceso de PARilación, como el ribosido de dihidronicotinamida (NRH), precursor de NAD⁺, que potencia la activación de PARP aumentando los niveles de NAD⁺, o FK866, un inhibidor de NAMPT, que puede disminuir los niveles de ^NAD+ y regular negativamente la activación^{de PARP-3}. Finalmente, mutaciones genéticas o la inhibición de pequeñas moléculas de enzimas como PARP1/PARP2, PARG u otras proteínas de reparación del ADN (por ejemplo, defectos en BER o factores homólogos de recombinación como BRCA1/BRCA2) pueden alterar la activación^{de PARP 33,34,35,36}.

El ensayo LivePAR utiliza un fragmento de la proteína anular 146 (RNF146) que codifica un dominio WWE (aminoácidos 100–182), vinculado a una proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP⁾³. El dominio WWE es un dominio globular llamado así por los residuos conservados triptófano (W) y glutamato (E) en su sitio^{de unión 37}. Los dominios de la WWE se unen a la iso-ADP-ribosa, la unidad estructural interna más pequeña dentro de las cadenas^{PAR 38,39}. RNF146 es una ligasa de ubiquitina E3 que reconoce iso-ADP-ribosa^38,40 y se informa que es un objetivo de proteínas implicadas en BER (XRCC1, ligasa de ADN III y PARP1) para la degradación^{proteasómica 41}. Vincular este dominio de la WWE con EGFP permite la visualización y detección de sitios de par-ilación inducidos por genotoxinas en células de mamíferos. En este protocolo, describimos la generación de líneas celulares estables que expresan el reportero LivePAR (Figura 1A), la inducción de daño en el ADN para activar PARP1/PARP2, la producción de PAR y la adquisición y análisis de datos de microscopía de fluorescencia confocal (Figura 1).

El plásmido pMD2.g(VSVG) proporciona la glicoproteína del envolvente viral (VSVG), que amplía el rango de células que el virus puede infectar en comparación con la proteína del envolvente del lentivirus nativo. El plásmido pRSV-REV proporciona la proteína del elemento regulador (REV), que es un transactivador crucial que se une al ARN viral y activa la transcripción de los genes virales; Es esencial para una replicación viral eficiente. El plásmido pMDLg/pRRE proporciona varios componentes internos clave de empaquetado, a saber: gag, que codifica la matriz (MA), cápside (CA) y proteínas nucleocápsides (NC), pol, que codifica las enzimas necesarias para la replicación viral e integración en el genoma de la célula huésped, y el elemento regulador del ARN (RRE), que es un elemento de ARN que mejora la eficiencia de la traducción de ARN viral y el empaquetado genómico del ARN. El plásmido pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (Figura 1A) contiene cDNA codificando para la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) que está fusionada con el C-terminal del dominio WWE de RNF146 (aminoácidos 100–182), un dominio proteico que se une a cadenas de poli(ADP-ribosa), y el vector también codifica un casete de resistencia a la higromicina. El virus se aísla del sobrenadante de cultivo celular y puede almacenarse a -80 °C o utilizarse inmediatamente para la transducción (Figura 1B).

Protocol

1. Producción de lentivirus

NOTA: Este protocolo emplea un sistema de empaquetado lentiviral de tercera^{generación 42,43} para generar células que expresen un reportero de PAR codificado genéticamente. Las partículas lentivirales se producen en células 293FT utilizando un sistema de cuatro plásmidos que comprende componentes envolvente, reguladores y de envase, junto con la construcción pLV-EF1A-LivePAR-Hygro que codifica un dominio WWE etiquetado con EGFP de RNF146, que une cadenas poli(ADP-ribosa). El virus resultante se utiliza para generar líneas celulares estables para la visualización y cuantificación de la acumulación de PAR.

1. Cultivar células de bajo paso de 293FT en DMEM que contienen un 10% de FBS y un 1% de Pen/Strep en una atmósfera humidificada a 37 °C y 5% de_CO2. Asegúrese de que las células de 293FT no hayan estado en cultivo más de 3 semanas.
   NOTA: Usamos habitualmente células de 293 FT con números de paso entre 3 y 10. Las células 293FT fueron transformadas e inmortalizadas por el antígeno T grande SV40. Estas células tienen una alta eficiencia de transfección, esencial para la producción de proteínas recombinantes y los estudios de expresión génica. Responden bien tanto a los métodos de transfección basada en lípidos como a los de transducción viral.
2. Placa 1,7 × 10⁵ células de 293 FT sobre una placa de cultivo de 60 mm en un volumen final de 5,5 mL de medio de cultivo en el día 1. Devuelve las células a la incubadora durante 24 horas.
3. El día 2 (el día de la transfección), añadir 375 μL de medio DMEM libre de FBS y sin pluma/estreptococos a un tubo de microcentrifugación estéril de 1,5 mL. Luego, se añaden 10 μL de un reactivo transfectido a base de lípidos, 4 μg del plásmido pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg del plásmido pMD2.g(VSVG), 2 μg del plásmido pRSV-REV y 2 μg del plásmido pMDLg/pRRE. Golpea suavemente el tubo de microcentrifugación para mezclar el medio, el reactivo de transfección y el ADN plasmídico (evita el vórtice). Incubar durante 15–30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de ADN/reactivos de transfección.
4. Añade la mezcla de plásmido y reactivo de transfección al plato de 60 mm que contiene las celdas de 293FT a transfectar sin eliminar el medio, gota a gota. Devuelva las células a la incubadora durante 48 horas.
   NOTA: Este periodo permite la producción y liberación de las partículas lentivirales en el medio de crecimiento.
5. En el día 4, se recoge el medio de cultivo de las células transfectadas de 293FT para aislar las partículas de lentivirus. Filtrar a través de un filtro estéril de 0,45 μm para separar los residuos celulares de las partículas lentivirales.
6. Determina el título del lentivirus con los reactivos disponibles (opcional).
   NOTA: Este método generalmente produce entre 10^y 10⁶ unidades infecciosas por mL (IFU/mL), lo que se correlaciona con una multiplicidad aproximada de infección (MOI) de ~5 cuando se utiliza como se indica en el paso de transducción a continuación.
7. Alicuota, los medios que contienen las partículas de lentivirus en cuatro crioviales estériles (1,0 mL por tubo) y almacenan a -80 °C.

2. Transducción

NOTA: Esta sección describe el protocolo de transducción lentiviral utilizado para introducir un transgen en líneas celulares (Figura 1B). Ha sido consistentemente eficaz en nuestro laboratorio^{1, 3, 33, 37, 44, 45}.

1. Cultiva una línea celular de elección (bajo número de pasos) en el medio adecuado en una atmósfera humidificada a 37 °C y 5% de_CO2.
   NOTA: Empieza con un paso temprano del tipo celular necesario. Un nuevo vial de células debe descongelarse y pasarse al menos una vez antes de sembrar para la transducción.
2. El día 1, la semilla 1 × 10⁵–1,5 × 10⁵ células por pozo, sobre cada pozo de una placa de 6 pozos en 2 mL de medio de crecimiento. Devuelve las células a la incubadora durante 24 horas.
3. El día 2 (el día de la transducción), asegúrate de que las células estén entre un 20% y un 40% confluente. Añade 1 mL de virus, 1 mL de medio de crecimiento y 2 μL de polibreno (2 mg/mL de caldo) a un tubo cónico de 15 mL y mezcle suavemente por inversión (evitando el vórtice).
   NOTA: La polibrena se utiliza durante la transducción de lentivirus para evitar la repulsión electrostática entre las partículas virales y la membrana celular. Como la polibrena tiene carga positiva, interactúa con las glicoproteínas virales cargadas negativamente, neutralizando su carga. Además, el polibreno se une a los glicosaminoglicanos en el medio de cultivo celular, impidiendo su interacción con el virus. Por tanto, la polibrena mejora enormemente la eficiencia de la transducción.
4. Retira el medio de crecimiento de la placa de 6 pozos y añade la mezcla de virus/medio/polibreno a cada pozo. Colocar las células con la mezcla de transducción en una incubadora que contenga una atmósfera humidificada a 32 ^°C y un 5% de_CO2 durante 16–18 horas.
   NOTA: Incubar células a 32 °C durante la noche durante la transducción lentiviral es una práctica común, aunque no esencial, que aumenta significativamente la eficacia de la infección viral. Reducir la temperatura ralentiza el metabolismo celular, reduciendo así las defensas celulares y aumentando la susceptibilidad a la infección viral.
5. En el tercer día, se sustituye el medio de las células transducidas por el virus por un medio fresco y muévelo a una incubadora a 37 °C. Incubar durante 48 horas.
   NOTA: Estos 2 días son suficientes para que las células produzcan el transgen RNF146(100–182)-EGFP y se hagan resistentes a la higromicina.
6. Para desarrollar las líneas celulares policlonales estables resultantes que expresan el transgen RNF146(100–182)-EGFP, a continuación se inicia la selección de higromicina tras 2 días de incubación, según se indica en el paso 2.5.
   1. Alternativamente, ampliar esta población de células transducidas en ausencia de higromicina y utilizarla para análisis de PAR durante los siguientes 10–14 días (transducción transitoria), como se describió^{anteriormente 1}.
7. Transfiere las células a una placa de 100 mm una vez que crezcan en presencia de higromicina y expande todo lo que sea necesario.
8. Prepara criogenias de las celdas transducidas para su uso futuro.
9. Validar la expresión del transgen RNF146(100–182)-EGFP mediante microscopía confocal según se detalla en la sección 3. El transgen RNF146(100–182)-EGFP se expresará en toda la célula.
10. Validar la expresión del transgen RNF146(100–182)-EGFP mediante inmunoabsorción, como se describe en otro^{lugar 1,37}.

3. Microscopía confocal y análisis

NOTA: Esta sección del protocolo detalla la preparación de las hojas de cobertura, la siembra de las células que expresan LivePAR, la exposición a tratamientos (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi y/o NRH) y la preparación de células fijas en portaobjetos de microscopio para imagen confocal y análisis de focos PAR (Figura 1C). También describe el uso del software ImageJ y una macro personalizada para la cuantificación semiautomatizada de focos PAR. Este protocolo puede utilizarse para investigar la influencia de diversos factores (por ejemplo, moléculas pequeñas, eliminaciones de proteínas BER) en la PARylation dependiente del daño al ADN y se ha empleado con éxito en nuestro laboratorio^34,37.

1. Preparación del cubrimiento
   1. Remoja 20 × cubiertas de 20 mm durante 20 minutos en éter dietílico en un recipiente de cristal dentro de una campana extractora.
      NOTA: Utiliza una campana extractora cuando se trabaja con éter dietílico debido a su inflamabilidad y posibles peligros.
   2. Retirar el éter dietílico y lavar las cubiertas en concentraciones decrecientes de etanol [100%, 70%, 50%, luego 0% (ddH₂O)].
   3. Retira el agua y remoja las fundas durante 20 minutos en 1 N HCl con una agitación suave.
   4. Quita el HCl y lava las fundas 3 veces con_{ddH 2}0.
   5. Guarda las cubiertas en etanol al 70% a 4 °C hasta su uso.
2. Placado de celdas
   1. Coloca dos fundas estériles de 20 × 20 mm en un plato de cultivo celular de 60 mm uno al lado del otro. Prepara tantos platos como sea necesario para el experimento. Asegúrate de que todo el etanol se haya evaporado antes de añadir cualquier célula al plato que contiene los tapas. Lava cualquier etanol residual añadiendo PBS estéril al plato durante 10–15 minutos; Quita PBS antes de sembrar las células.
   2. Semillar 200.000 células que expresan LivePAR por plato de cultivo celular. Deja que las células se adhieran a las cubiertas durante 24–36 horas, condiciona el medio y comienza a replicarse (crecer).
3. Inducción de focos de PAR
   1. Exponer las células que expresan LivePAR a 100 μM NRH, 10 μM de PARGi y 10 μM de MNNG o 40 μM tBuOOH. Además, para detectar la formación de PARP1/PARP2 dependiente de PARP1/PARP2, inhibe PARP1/PARP2 añadiendo 10 μM de PARPi. Añade compuestos directamente al medio que contiene las células de las cubiertas y haz girar suavemente el medio en los platos de cultivo celular para distribuir los compuestos. Incuba los platos de 60 mm a 37 °C durante 60–90 minutos.
      NOTA: La NRH se utiliza para asegurar que haya niveles suficientes de NAD⁺ celular disponibles para una par-ilación óptima mediada por PARP1/^PARP2 33,46,47. PARGi se utiliza para evitar que las cadenas PAR sintetizadas por PARP1/PARP2 sean desglosadas por PARG. El MNNG o tBuOOH se utiliza para inducir las modificaciones de la base del ADN que inician el BER, lo que conduce a la activación de PARP1/PARP2. PARPi se utiliza para confirmar que la señal (focos) resulta de la activación de PARP1/PARP2.
4. Fijación de celdas y montaje de las cubiertas
   1. Quita el medio y lávate con PBS.
      NOTA: Lavar una o dos veces con PBS es importante, ya que el medio utilizado para cultivar células contiene una alta concentración de proteínas séricas. Lavar con PBS también elimina cualquier residuo de MNNG o tBuOOH que quede en el medio.
   2. Prefijo en formaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lava las células 3 veces con PBS.
   3. Soluciona añadiendo 3 mL de metanol frío (-20 ^°C): acetona (7:3) a las células. Coloca los platos a -20 ^°C durante 9 minutos.
   4. Quita metanol: acetona. Lava 3 veces con PBS.
   5. Pipeta 15 μL de medio anti-desvanecimiento que contiene DAPI en las láminas de vidrio. Monta suavemente las cubiertas en el punto del medio de montaje con las celdas mirando hacia dentro, minimizando las burbujas.
   6. Centra, asegura y sella los laterales de la capa de cubierta a la lámina de vidrio aplicando una pequeña cantidad de esmalte transparente para clavos en los laterales de la cubierta. Coloca las láminas en la oscuridad para que la capa superior se seque el esmalte de las uñas (~10 min). Guarda las diapositivas en la oscuridad a 4 °C hasta que esté listo para la imagen.
5. Células de imagen
   1. Fotografía todas las láminas al menos 10x a una ampliación del 63×, usando un microscopio confocal. Detectar focos PAR usando el láser de 488 nm y tinción nuclear (DAPI) usando el láser de 405 nm (por ejemplo, véase la Figura 2).
6. Análisis de imágenes confocales
   1. Crea un archivo de texto que contenga el siguiente texto y nómbralo "LivePAR_Macro". Este macro facilita la cuantificación "automática" de los focos de PAR en los núcleos de las células que expresan LivePAR:
      macro "DAPI positive staining [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplicado...", "título=DAPI duplicado");
      selectWindow ("DAPI")
      run("8-bit");
      run("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      cerca();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gaussian Blur...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Invertir")
      corre("Rellenar agujeros")
      run("Cuenca hidrográfica")
      run("Analizar partículas...", "size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 mostrar=Esquemas añadir excluir incluir in_situ");
      rename("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      cerca();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Duplicado...", "título=GB1 duplicado");
      run("Duplicado...", "título=GB20 duplicado");
      selectWindow("GB20")
      run("Gaussian Blur...", "radius=20 stack");
      selectWindow("GB1");
      run("Gaussian Blur...", "radius=1 stack");
      imageCalculator("Restar crear pila", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      cerca();
      selectWindow("GB20");
      cerca();
      selectWindow("Resultado de GB1");
      rename("Blank_GB1-GB20_"+t);
      título = obtenerTítulo();
      run("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+título);
      cerca();
      selectWindow("C2-"+título);
      setThreshold(90,255) //el valor 90 puede cambiarse para tener en cuenta la variabilidad experimental
      run("Analizar partículas...", "size=0,00-200 circularidad=0,00-1,00 mostrar=Máscaras resumen");
      close ("C2-"+título);
      selectWindow("Máscara de C2-"+título);
      Cerrar ();
      setBatchMode(false);
      }
   2. Descarga e instala ImageJ en el ordenador (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Abre ImageJ e instala la macro (archivo de texto: LivePAR_Macro) haciendo clic en Plugins | Macros | Instalar.
   4. Abre todos los archivos de confocales en ImageJ y guárdalos como archivos *.tif para preservar los archivos originales.
   5. Abre un documento de hoja de cálculo y guárdalo como [fecha]_[Línea Celda]_Foci Análisis.
   6. Analiza un archivo *.tif a la vez. Pulsa 1 para encontrar los núcleos; cuando se abra una ventana titulada ROI Manager , selecciona todas las entradas de la ventana y pulsa añadir para superponer el área del núcleo sobre la imagen original. Eliminar núcleos identificados incorrectamente. Dibuja el núcleo usando la herramienta de selección a mano alzada y pulsa 2 para cuantificar los focos de PAR.
      NOTA: No incluyas núcleos que no estén completamente dentro del marco.
   7. Selecciona cada núcleo en el gestor de ROI uno por uno y pulsa 2. Aparecerá un conteo que indica el número de focos dentro del núcleo seleccionado. Una vez que se hayan puntuado los focos en todos los núcleos del archivo, copia y pega la información en el documento de hoja de cálculo abierta.
   8. Repite los pasos 3.6.6 y 3.6.7 con todos los archivos *.tif.
   9. Grafica los focos PAR por núcleo en el software elegido (por ejemplo, véase la Figura 3).

Results

Las células que expresan la sonda LivePAR pueden generarse produciendo un lentivirus que codifica la proteína de fusión RNF146(100-182)-EGFP (Figura 1A). Las células pueden evaluarse tras la expresión transitoria durante hasta dos semanas después de la transducción o como líneas celulares estables tras la selección en higromicina (Figura 1B)¹. Tras el tratamiento con genotoxinas, los focos de PAR inducido...

Discussion

El ensayo LivePAR se desarrolló para detectar sitios de daño en el ADN genómico nuclear donde PARP1/PARP2 sintetiza activamente cadenas PAR. Para lograrlo, un fragmento de RNF146 que codifica el dominio WWE (aminoácidos 100–182) se fusionó con EGFP 1,2,3,37. Las sondas PAR adicionales que hemos descrito codifican EGFP fusionadas con residuos de aminoácidos 1 a ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
reactivos, químicos y péptidos
0,45 & micro; Filtros steriflip m Durapore	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
Cubiertas de microscopio de 20 x 20 mm	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Acetona	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Placas de cultivo celular, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Platos de cultivo celular, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Placas de cultivo celular, 6 pozos	VWR	Cat# 62406-161
Crioviales, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Éter dietílico	Thermo Fisher Scientific	Cat# 60-29-7
Dimetilsulfóxido	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Filtros estériles desechables, 0,45 y micro; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Etanol, 200 proof	Laboratorios de Descontaminación	Cat# 2701
Láminas de microscopio de vidrio	Thermo Fisher Scientific	Cat# 12-544-4
Suero fetal bovino inactivado por calor	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Ácido clorhídrico	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Higromicina	Thermo Fisher Scientific	Gato# 10687010
Toallitas Kim grandes	Kimberly-Clark	Cat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Cat# 631280
Metanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Gato# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihidroxi-5-(hidroximetil) tetrahidrofurano-2-il]-4H-piridina-3-carboxamida)	Marie Migaud or  NuChem Sciences Inc
Inhibidor de PARG (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
Inhibidor de PARPi (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penicilina/estreptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Reactivo de transfección)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Medio de montaje anti-descolorido Vectashield (H-1000)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
Líneas celulares
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(derivado de células renales embrionarias humanas transformadas con el antígeno grande T SV40)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Donación generosa de	N/A
(Línea celular de tumores de glioblastoma humano)	Dr. Ian Pollack (Universidad de Pittsburgh)	N/A
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(células epiteliales de pigmento retiniano inmortalizado por hTERT humano)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(Línea celular de osteosarcoma humano)	ATCC	Cat# HTB-96
ADN recombinante
pMDLg/pRRE	Acción de laboratorio # 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Acción de laboratorio # 254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Acción de laboratorio # 252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR es el dominio WWE de RNF146, residuos de aminoácidos 100-182, fusionados con EGFP; contiene un casete de resistencia a la higromicina)	Acción de laboratorio # 1727	Addgene, Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator (para la preparación de figuras)	Adobe Systems	Versión 2024
GraphPad Prism	GraphPad	Versión 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html