Artículo de método

Un protocolo optimizado para la infección por Candida albicans en Schmidtea mediterranea para estudiar la patogénesis fúngica y la defensa del hospedador

DOI:

10.3791/70500

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17 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo proporciona una guía optimizada y detallada para utilizar la planaria Schmidtea mediterranea como sistema modelo para estudiar las interacciones huésped-patógeno durante la infección fúngica. El método se basa en el procedimiento previo para infectar planarias con el patógeno fúngico humano Candida albicans, proporcionando una guía detallada para mejorar la reproducibilidad y la consistencia experimental.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans es un patógeno fúngico oportunista común que coloniza asintomáticamente a la mayoría de los humanos. Aunque normalmente es una enfermedad comensal benigna, la disbiosis causada por el uso de antibióticos, la disfunción inmunitaria o la alteración de la barrera epitelial puede desencadenar un crecimiento excesivo y una infección por hongos, que van desde enfermedades mucosas superficiales hasta candidiasis sistémica potencialmente mortal. Se necesitan nuevos modelos preclínicos de infección para diseccionar la patogénesis de C. albicans in vivo a través de distintas fases de infección y con diferentes resultados medibles en el hospedador. El planario Schmidtea mediterranea se estableció previamente como hospedador invertebrado para estudiar las interacciones huésped-patógeno durante la infección por C. albicans . S. mediterranea depende completamente de mecanismos inmunitarios innatos conservados capaces de superar la infección por microorganismos patógenos, incluyendo bacterias y hongos. La notable capacidad regenerativa de las planarias y su acceso acceso a poblaciones de células madre hacen de este organismo un modelo manejable para analizar respuestas inmunitarias tempranas, reparación tisular y eliminación de patógenos in vivo. Este modelo soporta el análisis simultáneo de la virulencia fúngica y las respuestas transcripcionales del huésped, proporcionando información valiosa sobre la dinámica de la infección. Aquí se ha presentado un protocolo actualizado con modificaciones detalladas, procedimientos estandarizados y pasos optimizados para infectar S. mediterranea con C. albicans , diseñado para mejorar la reproducibilidad y permitir estudios sistemáticos de la patogénesis fúngica y la defensa del hospedador.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans es un patógeno fúngico oportunista común que coloniza asintomáticamente al 50-70% de loshumanos 1,2,3. Normalmente, un comensal inofensivo, C. albicans, puede crecer en exceso bajo condiciones como el desequilibrio microbiota, el uso de antibióticos, la inmunosupresión, la alteración de la barrera epitelial o la presencia de dispositivos médicos, lo que puede provocar enfermedades que van desde infecciones mucosas superficiales hasta candidiasis sistémica potencialmente mortal 4,5. En personas inmunodeprimidas —incluyendo aquellas con VIH/SIDA, pacientes sometidos a quimioterapia o terapias inmunosupresoras, personas con enfermedades crónicas o personas en unidades de cuidados intensivos— las tasas de mortalidad pueden superar el 70%, lo que subraya la significativa carga de salud pública de la candidiasisinvasiva 6,7,8. A nivel mundial, las infecciones fúngicas invasivas afectan a más de 6,5 millones de personas anualmente, con costes sanitarios directos solo en Estados Unidos superiores a los 8.000 millones de dólares anuales para las infecciones relacionadas con Candida 9,10. A pesar de la disponibilidad de tratamientos antifúngicos, las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones por C. albicans se han mantenido en gran medida sin cambios durante décadas, lo que pone de manifiesto la urgente necesidad de comprender mejor las interacciones huésped-patógeno en las enfermedades fúngicas.

C. albicans emplea un repertorio diverso de factores de virulencia que apoyan la colonización, persistencia y patogénesis en diversos entornos hospedadores. Estos incluyen la adhesión a los tejidos del huésped, la evasión inmunitaria, la remodelación de la pared celular, la secreción de enzimas hidrolíticas, la plasticidad morfológica y la formación de biopelículas 11,12,13,14,15,16. En conjunto, estos rasgos permiten a C. albicans adaptarse a diversos nichos de huésped, modular respuestas inmunitarias y resistir las terapias antifúngicas 16,17,18,19,20,21. Esclarecer cómo estos procesos influyen en los resultados de la infección —incluyendo morbilidad del huésped, mortalidad y eliminación de patógenos— es esencial para desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas más eficaces.

Para investigar estas dinámicas huésped-patógeno, establecimos un sistema modelo utilizando la planaria Schmidtea mediterranea comohospedadora 22,23,24. Este modelo sirve como una plataforma versátil para estudiar la respuesta multisistémica del huésped ante la infección fúngica, aprovechando un método de infección basado en remojo que permite la exposición síncrona de animales a C. albicans. La siguiente sección presenta procedimientos actualizados paso a paso que perfeccionan este protocolo, mejoran la reproducibilidad y facilitan una implementación consistente entre laboratorios.

Las planarias son invertebrados de vida libre con una capacidad regenerativa excepcional, capaces de reemplazar rápidamente los tejidos perdidos por lesiones oinfecciones 25. Carecen de un sistema inmunitario adaptativo y dependen completamente de defensas innatas conservadas —incluidos receptores de reconocimiento de patrones, péptidos antimicrobianos, secreción de moco y células fagocíticas— para eliminar patógenos bacterianos y fúngicos en los primeros días26, 27, 28 y 29. Dado que la inmunidad innata representa la primera línea de defensa entre los eucariotas y sigue siendo poco estudiada fuera de los sistemasmamíferos, las planarias ofrecen la oportunidad de examinar estos procesos in vivo con resolución celular y molecular. Su capacidad regenerativa está impulsada por células madre pluripotentes adultas, conocidas como neoblastos, que constituyen aproximadamente el 30% de las células adultas y contribuyen a la recuperación tras lainfección 23,30. Estas características convierten a S. mediterranea en un modelo poderoso para diseccionar la virulencia de patógenos y la defensa del huésped a escalas genética, celular, tisular y del organismo, permitiéndonos abordar cuestiones que a menudo son difíciles de estudiar usando sistemas mamíferos tradicionales.

Además, el tamaño reducido de las planarias (normalmente de unos pocos milímetros de longitud), el bajo coste y la facilidad de mantenimientode las planarias permiten experimentos a gran escala evitando las restricciones financieras, éticas y regulatorias inherentes a los modelos de vertebrados. Al igual que C. albicans, S. mediterranea es genómicamente manejable, con un genoma completamente secuenciado y anotado, y soporta técnicas moleculares y celulares avanzadas, incluyendo perfilado transcripcional, inmunohistoquímica e histología de alta resolución, y una robusta interferencia de ARN (ARN)32,33,34,35,36,37,38. Estas herramientas permiten el análisis paralelo de las respuestas del huésped y del patógeno durante la infección.

Se han utilizado varios modelos preclínicos alternativos para estudiar infecciones fúngicas. Hospedadores invertebrados como Galleria mellonella (polilla cera), Caenorhabditis elegans (gusano redondo) y Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), así como el vertebrado Danio rerio (pez cebra), ofrecen ventajas experimentales distintas pero también tienen limitaciones notables. Estos sistemas a menudo dependen de la supervivencia como objetivo principal porque las infecciones inducen rápidamente la muerte del huésped, impidiendo una evaluación detallada de la morbilidad, la recuperación y las respuestas multisistémicas, características que el modelo planario capta fácilmente.

Modelos mamíferos como Mus musculus (ratón), Rattus norvegicus (rata), Oryctolagus cuniculus (conejo) y Cavia porcellus (conejillo de indias) recapitulan más fielmente la fisiología humana, pero están limitados por altos costes, pequeños tamaños de cohorte, requisitos éticos y regulatorios, y el desafío de distinguir la respuesta inmune innata de la adaptativa. Además, décadas de investigación sobre la patogénesis fúngica en ratones se han centrado predominantemente en infecciones sistémicas en faseavanzada 39,40,41,42,43, a menudo pasando por alto eventos tempranos como la alteración de la barrera epitelial y el sobrecrecimiento mucoso, las vías más comunes de inicio de enfermedades fúngicas en humanos 44,45,46.

Por tanto, estudiar las interacciones huésped-patógeno es esencial para comprender los procesos biológicos que subyacen a la virulencia fúngica, la defensa del huésped y la progresión de la enfermedad. Las infecciones fúngicas invasoras representan una amenaza global en aumento, con múltiples especies que ahora muestran resistencia a todas las principales clases de fármacos antifúngicos. Se estima que más de 1.000 millones de personas se ven afectadas por infecciones fúngicas, y factores como el cambio climático, el uso generalizado de antimicrobianos y el creciente número de individuos inmunodeprimidos están acelerando la aparición de patógenos resistentes aantifúngicos 47,48,49,50. Comprender cómo los hongos patógenos colonizan e interactúan con sus hospedadores es fundamental para desarrollar nuevas estrategias preventivas y terapéuticas.

Lo siguiente describe un protocolo de infección sistémica revisado y estandarizado para las interacciones entre S. mediterranea y C. albicans, diseñado para promover la reproducibilidad y permitir la investigación sistemática de la patogénesis fúngica y los mecanismos de defensa del hospedador. El protocolo original se siguió en publicacionesanteriores 22, 23 y 24. La Tabla 1 resume las principales actualizaciones incorporadas en esta versión revisada, incluyendo mejoras en los procedimientos de inoculación fúngica, reducción del volumen de pozos, criterios definidos de inclusión animal, determinación de dosis infecciosas y letales, y recomendaciones actualizadas sobre la ganadería. Este flujo de trabajo proporciona una guía detallada para el cultivo de C. albicans, la infección de planarias mediante exposición a remojo y la evaluación de la virulencia fúngica y las respuestas del hospedador utilizando lecturas cualitativas y cuantitativas bajo condiciones sintomáticas y de dosis letal (Figura 1). Los procedimientos optimizados presentados aquí incorporan variables identificadas empíricamente como determinantes clave de la dinámica de la infección y los resultados del huésped, mejorando así la reproducibilidad y permitiendo una evaluación sistemática de las interacciones huésped-patógeno.

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Protocolo

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Este protocolo se basa en los métodosanteriores 22,23,24 y establece procedimientos claros y estandarizados para mejorar la reproducibilidad y permitir la investigación sistemática de la patogénesis fúngica y las respuestas del hospedador en S. mediterranea. Las mejoras clave del protocolo incluyen criterios predefinidos de inclusión y exclusión animal, preparación microbiana estandarizada y evaluación exhaustiva de los objetivos del hospedador.

Todos los procedimientos deben realizarse utilizando técnicas adecuadas de bioseguridad estériles y asépticas de nivel 2. El equipo estándar de protección individual (EPP) de laboratorio, incluidos guantes, bata de laboratorio y zapatos cerrados, debe llevarse en todo momento. Los procedimientos relacionados con la planaria S. mediterranea se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para el uso ético de invertebrados.

Todas las mejoras del protocolo se resumen en la Tabla 1. Todos los reactivos, equipos críticos y recetas de medios, tampones e inmunotinción se enumeran en la Tabla de Materiales y la Tabla 2.
NOTA: Todos los procedimientos que involucren el modelo animal invertebrado S. mediterranea deben realizarse para garantizar los más altos estándares de bienestar animal. S. mediterranea debe alojarse en condiciones optimizadas que simulen hábitats naturales. Los experimentos deben diseñarse para minimizar el dolor o la angustia potencial y garantizar un tratamiento ético durante todo el estudio.

1. Cultivo fúngico

  1. Información sobre la cepa de C. albicans
    1. La cepa estándar de laboratorio de C. albicans SN25051 se utilizó como cepa de tipo salvaje para todos los experimentos, y está disponible públicamente en el Centro de Stock de Genética Fúngica (http://www.fgsc.net/). SN250 se deriva del aislado clínico SC5314, recogido originalmente de un hemocultivo de un paciente con candidiasisdiseminada 52.
    2. Las cepas de C. albicans se mantienen en reservas de glicerol al 25% a −80°C.
  2. Cultivando cepas de C. albicans para detectar infección
    1. Rayado desde el material criogénico
      1. Utilizando un aplicador estéril, estira la cepa deseada desde el material de −80°C sobre las placas de agar del extracto de peptona de levadura (YPD) (extracto de levadura al 1%, 2% peptona, 2% glucosa; pH 6,8).
      2. Incuba estáticamente a 30°C durante 72 horas.
  3. Preparación de cultivos nocturnos
    1. Inocular una sola colonia en 4 mL de YPD líquido en tubos de cultivo borosilicato estériles (18 mm × 150 mm) usando un aplicador estéril.
    2. Incluir un tubo control negativo que contenga YPD no inoculado bajo condiciones idénticas.
    3. Tapa ligeramente los tubos para permitir la aireación e incuba durante la noche (16 h) a 30 °C con agitación a 220 rpm (orbital) en una incubadora agitada.
      NOTA: Si se produce crecimiento microbiano en el control negativo, abortar el experimento y reiniciar con nuevo medio y técnica estéril.
  4. Recolección y lavado de celdas
    1. Utilizando técnica aséptica, transfiere los cultivos a tubos centrífugos de 15 mL etiquetados.
    2. Cultiva en centrifugadora durante 5 minutos a ~3.000 × g para pelletar las células.
    3. Retira cuidadosamente el sobrenadante YPD sin mover la bola.
    4. Resuspende el pellet en agua planaria (véase la Tabla 2 para la composición) en un volumen igual al del YPD utilizado.
    5. Mezcla bien mediante vórtice.
    6. Repite los pasos 1.4.2-1.4.4 dos veces más para eliminar por completo el medio de cultivo.
    7. Tras el lavado final, resuspende la pellet celular en agua planaria fresca mediante vórtice.
  5. Cuantificación de la concentración celular de C. albicans
    1. Dilución para la medición de OD
      1. Preparar tres tubos microcentrífugas estériles de 1,7 mL con una dilución 1:20 (cultivo de 50 μL + 950 μL de agua planaria) o un factor de dilución alternativo elegido. Mezcla bien.
      2. Prepara un tubo en blanco que contenga 1000 μL de agua planaria.
    2. Espectrofotometría
      1. Configura el espectrofotómetro para medir la densidad óptica en 600 nm (OD600).
      2. Borra el espectrofotómetro con agua planaria.
      3. MideOD 600 para cada muestra diluida y registra los valores.
      4. Promedia las tres lecturas y multiplica por el factor de dilución para determinar el OD600 del cultivo de stock. Convierte OD600 a concentración de celda.
        NOTA: El factor de conversión de densidad óptica debe determinarse empíricamente para cada espectrofotómetro. Según la instrumentación específica utilizada, un OD600 de 1 corresponde aproximadamente a 2 ×10 célulasde C. albicans/mL53.
  6. Determinación de las concentraciones experimentales de inóculo
    1. Prepara la concentración deseada del inoculo para cada condición experimental.
      NOTA: Realizar al menos tres réplicas biológicas para determinar la dosis efectiva para la colonia planaria, especialmente para los extremos infecciosos o letales. Un cálculo representativo para preparar concentraciones de inoculo infeccioso y letal se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

2. Especies planarias y mantenimiento

  1. Especies planarias y mantenimiento
    1. Utiliza la línea clonal asexual CIW4 de la planaria S. mediterranea para todos los experimentos.
    2. Mantener las colonias planarias en recipientes plásticos transparentes de grado alimentario que contengan entre 1.500 y 2.000 mL de 1× de agua planaria.
    3. Mantén los recipientes en la oscuridad a 20 °C con las tapas ligeramente cerradas para permitir el intercambio de gases.
    4. No trates las planarias con antibióticos.
  2. Mantenimiento y alimentación de la colonia
    1. Alimentar colonias con puré de hígado de ternera colado fresco una vez por semana.
    2. Limpia los recipientes dos veces por semana.
    3. Mantener la densidad planaria en 200–400 animales por contenedor. Trabajos previos demuestran procedimientos detallados sobre la preparación de colonias y el mantenimiento a largoplazo 31.
  3. Condicionamiento previo al experimento
    1. Antes de la infección experimental, privar de hambre las planarias durante 7–12 días para estandarizar condiciones metabólicas y de tamaño.
    2. Utilizar grupos de 5–10 animales por pozo para cada condición experimental. Asegurarse de que el número igual de animales sea en todas las condiciones, incluidos controles positivos y negativos.
  4. Selección del tamaño del animal
    1. Selecciona planarias de aproximadamente 5 mm de longitud, correspondientes a ~5 × 10 5células hospedadoras poranimal 54.
    2. Evita usar planarias de menos de 5 mm, ya que animales de este tamaño pueden incluir individuos con blastemas o desarrollo incompleto que puede producir resultados inconsistentes.
    3. Evita usar planarias mayores de 5 mm, ya que los animales más grandes son menos adecuados para la inmunotinción por fluorescencia.
    4. Utilizar planarias de aproximadamente 5 mm de longitud al establecer condiciones de dosis infecciosas (ID50) y dosis letal (DL50).
      NOTA: Para facilitar una selección consistente de tamaño, imprime una cuadrícula de referencia de 5 mm × 5 mm y colócala dentro de una funda de plástico bajo el recipiente planario transparente. Asegúrate de que las planarias estén completamente extendidas antes de medir la longitud.
  5. Criterios de salud e inclusión
    1. PASO CRÍTICO: Examina todas las planarias bajo un estereomicroscopio antes de su uso.
    2. Excluir animales con daños o lesiones visibles, incluyendo las siguientes condiciones:
      1. Presencia de blastemas (tejido carente de pigmentación) o desarrollo de pigmentación incompleto.
      2. Pigmentación anormal, como regiones significativamente más oscuras.
      3. Tejido perdido o dañado.
      4. Lesiones o cicatrices.
      5. Lesiones abiertas.
      6. Anomalías o deformidades morfológicas.
      7. Cualquier condición crónica o que no cure.
    3. Excluye a los animales con anomalías del desarrollo.
      1. Regiones bifurcadas o duplicadas de la cabeza o la cola.
      2. Morfología corporal deformada o asimétrica.
      3. Número incorrecto de fotorreceptores (solo un par bilateral es aceptable).
      4. Faringe anormalmente posicionada.
      5. Ciliación defectuosa que resulta en motilidad deteriorada o comportamiento irregular de planeo.
    4. Incluye solo animales de aproximadamente 5 mm de longitud, completamente desarrollados y libres de lesiones o anomalías visibles.
  6. Preparación de la placa
    1. Transfieran planarias sanas que cumplan todos los criterios de inclusión en 2 mL de agua planaria fresca por pozo en una placa de poliestireno de 6 pozos no tratada con cultivo tisular.
      NOTA: Transfiere a los animales un día antes de la infección para permitir la adaptación al nuevo entorno y densidad poblacional.
    2. Asignar pozos para las siguientes condiciones experimentales:
      1. Control negativo: animales no infectados o tratados simuladamente.
      2. Controles positivos: animales infectados con C. albicans silvestre.
    3. Retira y sustituye toda el agua por 2 mL de agua planaria fresca para asegurar la uniformidad entre pozos.

3. Configuración de la infección

  1. Preparar la inoculación (véase el Archivo Suplementario 1 para el cálculo de la muestra)
    1. Utilizando la técnica aséptica, retira suavemente toda el agua de la placa de 6 pozos inclinándola hacia el usuario.
    2. Añade el volumen calculado de agua planaria a cada pozo.
      NOTA: Procede un pozo a la vez para evitar que los animales se sequen.
    3. Añade el volumen calculado de cultivo de C. albicans a cada pozo.
      NOTA: Evita exponer a los animales al aire durante períodos prolongados, ya que el secado puede causar estrés y alterar los resultados de la infección.
  2. Condiciones experimentales de incubación de placas
    1. Coloque la placa inoculada de 6 pozos en un lugar oscuro y estático a temperatura ambiente.
    2. Mantener las placas experimentales en un área separada de las colonias planarias no infectadas para evitar la contaminación cruzada.
    3. Anota la fecha y hora de la inoculación (designada como hora 0 h).
      NOTA: Evita zonas de mucho tráfico o propensas a vibraciones (por ejemplo, cajones, superficies de instrumentos o encimeras concurridas), ya que el movimiento puede estresar a los animales y desconcertar los resultados.
    4. Incubar planarias con C. albicans durante hasta 72 horas, dependiendo del punto final deseado.
  3. Resuspensión de células fúngicas
    1. En cada punto temporal, resuspende suavemente las células asentadas de C. albicans sin perturbar las planarias.
      NOTA: El tiempo (horas [h] o días [d] tras la infección) se refiere al tiempo transcurrido desde la exposición inicial (tiempo 0).
    2. A las 24 horas post-infección (hpi)
      1. Usando una pipeta de transferencia estéril de 3 mL, inclina ligeramente la placa hacia el usuario.
      2. Aspira el agua planaria y dispensa suavemente en una zona del pozo libre de animales para mezclar la capa fúngica asentada.
      3. Repite este paso 5–10 veces por pozo para romper la capa fúngica asentada, evitando el contacto directo con planarias.
      4. Observa el asentamiento fúngico sobre un fondo oscuro para obtener la mejor visibilidad antes y después de los pasos de resuspensión.
      5. Resuspender pozos de control no infectados bajo condiciones idénticas.
    3. A 48 hpi
      1. Repite el procedimiento de resuspensión descrito anteriormente.
      2. Realizar todos los pasos de resuspensión dentro de ± 1 hora desde el momento designado.
  4. Fin de exposición (72 hpi)
    1. A 72 hpi, transfiere suavemente las planarias a una nueva placa de 6 pozos que contenga 2 mL de agua planaria fresca por pozo.
    2. Minimizar la transferencia de cultivo fúngico utilizando el menor volumen posible de líquido.
    3. Una vez que los animales hayan sido transferidos, retira toda el agua y reemplázala por agua planaria fresca.
      NOTA: Manipular los animales y cualquier fragmento de tejido con cuidado para evitar lesiones mecánicas o estrés adicional.

4. Evaluación del endpoint del host

  1. Registro de los resultados del huésped
    1. Comienza a evaluar los resultados del huésped al día siguiente de la infección (dpi) y continúa diariamente hasta el punto final experimental deseado.
    2. Cuantificar el daño al huésped usando el sistema estandarizado de puntuación 0–3 (Figura 2).
      Puntuación 0: Sin cambios respecto a los controles no infectados (sanos, asintomáticos).
      Puntuación 1: Síntoma leve.
      Puntuación 2: Síntoma(s) grave(s).
      Puntuación 3: Muerte.
  2. Criterios para la evaluación de síntomas del huésped
    1. Puntuación 0 (Asintomático):
      1. Identificar animales que presenten morfología, pigmentación, comportamiento y capacidad de respuesta normales sin cambios observables respecto a los controles no infectados.
    2. Marcador 1 (Suave):
      Asignar una puntuación leve cuando se observe al menos uno de los siguientes síntomas en relación con los controles asintomáticos.
      1. Reducción de velocidad de movimiento o comportamiento anormal al planeo.
      2. Pérdida parcial o total de la respuesta fototáctica.
      3. Contracciones corporales sostenidas o repetitivas.
      4. Pigmentación anormal o no uniforme (regiones más claras o oscuras).
      5. Regresión del tejido de la cabeza o la cola.
    3. Puntuación 2 (Severa):
      Asignar una puntuación grave cuando uno o más de los siguientes síntomas están presentes mientras los animales siguen vivos.
      1. Película ocular o pérdida de uno o ambos ojos.
      2. Pérdida total de cabeza o daño notable en tejido anterior.
      3. Pérdida de tejido importante en la región prefaríngea.
      4. Fragmentación en múltiples regiones del cuerpo (cefálicos, faríngeos o posteriores).
      5. Lesiones abiertas con o sin secreción de moco o filtraciones internas.
      6. Lisis parcial tisular que provoca pérdida de integridad estructural.
      7. Postura corporal en forma de "C", parálisis o deterioro severo de la motilidad.
    4. Marcador 3 (Muerte):
      Identificar la muerte basándose en uno o más de los siguientes criterios.
      1. Lisis completa de tejido o de animal entero.
      2. Pérdida total de respuesta a los estímulos.
      3. No recuperarse o regenerarse.
        NOTA: La Figura 2 proporciona imágenes representativas y características definitorias para cada puntuación para asegurar una clasificación consistente del fenotipo del huésped.

5. Determinación de la supervivencia del huésped tras exposición a hongos

  1. A 3 dpi, transfiera suavemente las planarias a una nueva placa de 6 pozos que contenga 2 mL de agua planaria fresca por pozo, evitando la transferencia de cultivo fúngico residual.
  2. Observa animales usando microscopía óptica (≥ objetivo 10x).
  3. Registrar los resultados del anfitrión utilizando la hoja de puntuación estandarizada proporcionada en el Archivo Suplementario 2.
  4. Determinación de animales vivos
    1. Identificar animales vivos basándose en uno o más de los siguientes criterios.
      1. Fototaxis negativo.
      2. Respuesta a una perturbación suave de la pipeta de transferencia.
      3. Estructura corporal intacta.
      4. Fijación estable a la placa.
  5. Determinación de animales muertos
    1. Identifica animales muertos basándose en uno o más de los siguientes criterios.
      1. Lisis o desintegración completa (solo restos residuales).
      2. Cuerpo transparente o eviscerado.
      3. Ausencia de movimiento o respuesta a estímulos.
      4. Fracaso en la regeneración (ausencia de formación de blastemas).
  6. Retirada de animales muertos
    1. Retirar animales muertos y restos solo después de confirmar la no viabilidad mediante microscopía.
    2. PASO CRÍTICO: Retirar inmediatamente los animales muertos para evitar contaminación cruzada o alteraciones en las mediciones de supervivencia.
    3. Si quedan restos o residuos de hongos, transfiere de nuevo a los animales supervivientes a una placa fresca que contenga agua planaria limpia para evitar que C. albicans se resembre o se forme biopelícula.
      NOTA: Colocar placas de 6 pozos sobre un fondo oscuro durante la inspección visual para mejorar el contraste y facilitar la evaluación fenotípica.

6. Evaluación de la carga fúngica

  1. Cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC)
    1. En los tiempos de infección deseados, recolecta planarias (5–10 animales por condición al día). Incluye controles no infectados/simulados emparejados y controles infectados de tipo salvaje.
    2. Enjuaga suavemente los pozos dos veces con 2 mL de agua planaria fresca para eliminar las células de fondo de C. albicans .
    3. Transfiere planarias a tubos microcentrífugas estériles y etiquetados de 1,7 mL o 5,0 mL y elimina toda el agua residual.
    4. Añade 300 μL de agua planaria fresca a cada tubo.
    5. Homogeneizar a los animales usando un mano estéril hasta que no queden fragmentos grandes (aproximadamente 30–45 s).
    6. Realizar diluciones en serie del homogeneado (por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Lámina de 100 a 200 μL de cada dilución sobre placas de agar YPD suplementadas con 50 μg/mL de ampicilina, rifampicina, estreptomicina y neomicina. Extiende uniformemente usando cuentas de vidrio estériles o un separador de células estériles.
    8. Deja que los platos permanezcan en posición vertical sobre la mesa durante 5–10 minutos después del emplatado para permitir la absorción del líquido en el agar.
    9. Prepara placas triplicadas para cada dilución y condición.
    10. Incubar las placas a 30 °C durante 48 horas.
    11. Cuenta las UFC y multiplica por el factor de dilución.
    12. Normalizar los valores de CFU al número de planarias para calcular las CFUs medias por planaria por condición. Por ejemplo, si se observan 100 colonias con una dilución del 10× a partir de un homogeneado de 5 animales, el valor calculado es de 200 UFC por animal.

7. Tinción anti-Candida por inmunofluorescencia

  1. Consideraciones generales sobre la tinción
    1. Realiza todos los pasos con un suave balanceo orbital (100–140 rpm) a temperatura ambiente, salvo que se especifique lo contrario. Consulte el Archivo Suplementario 1 para detalles sobre anticuerpos y fuentes de reactivos.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído, el dodecilo sulfato de sodio (SDS) y el peróxido de hidrógeno son productos químicos peligrosos y deben manipularse conforme a las normativas de seguridad institucionales. El formaldehído es tóxico y está clasificado como carcinógeno; El SDS es un irritante; y el peróxido de hidrógeno es un oxidante fuerte que puede causar quemaduras. Lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes de nitrilo, zapatos cerrados y gafas de seguridad). Realizar procedimientos que involucran reactivos volátiles en una campana extractora certificada y eliminar los residuos conforme a las directrices institucionales de Salud y Seguridad Ambiental.
  2. Recogida de muestras
    1. Recoge animales de cada condición experimental y de cada momento temporal.
    2. Transfiere a los animales en viales de centelleo marcados de 20 mL que contienen 2 mL de agua planaria.
    3. Retira todo el líquido, enjuaga una vez con 2 mL de agua planaria fresca y luego vuelve a aplicar todo líquido.
  3. Fijación y permeabilización
    1. Sacrificar animales en N-acetilcisteína (NAC) al 7,5% en 1× PBS durante 3 minutos.
    2. Retira la solución y fija a los animales en un 4% de formaldehído y un PBSTx al 0,3% durante 15 minutos.
    3. Enjuaga muestras dos veces con 1× PBS.
    4. Permeabiliza muestras en SDS al 1% durante 15 minutos.
    5. Enjuaga muestras tres veces con 1× PBS.
  4. Blanqueamiento
    1. Muestreos de lejía en peróxido de hidrógeno al 6% en 1× PBS bajo una luz LED brillante durante 4–12 horas.
      NOTA: Si el blanqueo no puede proceder inmediatamente, almacenar muestras fijas en 1× PBS a 4 °C durante hasta 1 semana o deshidratar muestras en metanol 100% para almacenamiento a largo plazo.
  5. Bloqueo e incubación de anticuerpos
    1. Transfiere animales a placas de 24 pozos que contengan 1× PBS.
    2. Bloquear la unión inespecífica en un 2,5% de PBS-TB (PBS que contiene Tritón X-100 y albúmina sérica bovina) durante 4 horas a temperatura ambiente o 8 horas a 4 °C.
    3. Incubar muestras con anticuerpo anticándida primario (1:500 en PBS-TB) durante 4 horas a temperatura ambiente o 8 horas a 4 °C.
    4. Retira muestras primarias de anticuerpos y lava las muestras ocho veces cada 20 minutos con un PBSTx al 0,3% (total ~2,5 horas).
    5. Incubar muestras con anticuerpo secundario anticonejo conjugado con Alexa-568 (1:800 en PBS-TB) durante 4 horas a temperatura ambiente o 8 horas a 4 °C.
      NOTA: Proteger las muestras de la luz para evitar el fotoblanqueamiento. Las soluciones de anticuerpos pueden reutilizarse.
    6. Retira el anticuerpo secundario y lava muestras ocho veces cada 20 minutos con PBSTx al 0,3%.
  6. Montaje opcional de la corredera
    1. Coloca los animales sobre una lámina de microscopio con todos orientados hacia arriba.
    2. Elimina el exceso de agua usando una pipeta de transferencia.
    3. Absorbe cuidadosamente el líquido restante de los bordes usando el borde de una toalla de papel.
    4. Añadir 150–175 μL de medio de montaje de Gelvatol (Tabla 2 para composición) en gota hasta que los animales estén completamente cubiertos.
    5. Coloca cuidadosamente una cubierta sobre la muestra, evitando burbujas de aire.
    6. Deja que el Gelvatol se solidifique al menos 2 horas antes de la imagen.
    7. Guarda los toboganos en un lugar fresco y oscuro para su conservación a largo plazo.
  7. Imagen
    1. Imágenes muestrean con excitación amarillo-verde (~578 nm) y observan la emisión naranja-roja (~603 nm).
    2. Utiliza una lente objetivo 2x para visualizar patrones de manchas de animales enteros.

8. Resolución de problemas

  1. Si los resultados de la infección son inconsistentes, se realiza una curva dosis-titulación usando SN250 tipo salvaje u otra cepa basal en incrementos de 5–10 × 107 células/mL.
  2. Realizar al menos tres réplicas biológicas que contengan entre 5 y 10 animales por grupo.
  3. Incluir grupos de control negativos y positivos para identificar posibles problemas como contaminación cruzada, fallo en la técnica aséptica, problemas de viabilidad de la cepa o mala salud base animal.
  4. Tras completar el experimento de dosis-titulación, el pool replica para determinar la supervivencia mediana por grupo.
  5. Analizar las diferencias de supervivencia utilizando el análisis logarítmico de rango por pares de Mantel–Cox.
  6. Utiliza el análisis de supervivencia de Kaplan–Meier para evaluar las diferencias de tiempo antes de la muerte entre cepas o tratamientos.
  7. Para condiciones de dosis subletales o infecciosas, analiza los resultados sintomáticos del huésped (por ejemplo, fenotipos leves o graves o colonización fúngica) en lugar de supervivencia.
  8. Comparar las respuestas del huésped entre grupos de dosis para determinar el rango de dosis infeccioso o letal adecuado para los experimentos posteriores.

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Resultados

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Se presenta un protocolo actualizado para infectar planarias con C. albicans (Figura 1) y cuantificar sistemáticamente los resultados del huésped (Figura 2). Este flujo de trabajo refinado apoya una evaluación robusta de múltiples parámetros de infección, incluyendo morbilidad (gravedad sintomática de la enfermedad), supervivencia (letalidad), carga fúngica (UFC) y dinámica espaciotemporal de la colonización de patógeno...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Variar la dosis infecciosa de C. albicans silvestre produce diferencias reproducibles y dependientes de la dosis en la morbilidad en S. mediterranea, lo que subraya la sensibilidad del modelo para la evaluación cuantitativa de la virulencia fúngica. Este protocolo describe estrategias para establecer dosis de base infecciosas y letales dentro de colonias planarias mantenidas en laboratorio y presenta criterios para confirmar una infección sistémica exitosa mediante remo...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. es cofundador de BioSynesis, Inc., una empresa que desarrolla diagnósticos y terapias para infecciones por biofilm. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a todos los miembros de los laboratorios Nobile, Oviedo y Hernday por sus profundas discusiones sobre el modelo de infección por S. mediterranea-C. albicans y agradecen a Edelweiss Pfister por su gestión de laboratorio y el mantenimiento de planarias. Este trabajo fue apoyado por los premios de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) R35GM156045 y R35GM124594 a C.J.N., y R35GM158501 y R01GM132753 a la N.J.O. Este trabajo también contó con el apoyo de la familia Kamangar en forma de una cátedra dotada para C.J.N. N.M.S. fue apoyado por las becas del Centro de Excelencia en Investigación en Ciencia y Tecnología (CREST) del Centro de Máquinas Celulares y Biomoleculares (CCBM) de la National Science Foundation (NSF) bajo los premios NSF-HRD-1547848 y NSF-EES-2112675.

Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la interpretación de los mismos, la redacción del manuscrito ni la decisión de publicar los resultados. N.M.S. reconoce el uso de ChatGPT para la ayuda en la edición del manuscrito (comprobando ortografía, gramática, formato y estructura de las frases).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL  VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Claro, caja de 500 piezas
Vials de 20 mL de centelleónFisher Scientific12-100-006Botes de cristal transparente para inmunotinciones
Planchas de poliestireno no tratado de 24 pozosFisher Scientific08-772-51Inmunotinción
Tubos microcentrífugas de 5,0 mL  Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EAClaro, caja de 200 piezas
Placas de poliestireno no tratadas de 6 pozosFisher Scientific08-772-49Ensayos de infección
AgarVWR89405-066Grado bacteriológico para medio YPD
Aplicadores de varillasThermo Fisher/Puritan22-029-491C. albicans cultivo
BioRenderBioRender Inc.N/ASoftware de diseño de figuras utilizado para generar ilustraciones esquemáticas
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GAgua planaria/1x Montjuï Sales C
Candida albicans anticuerpos policlonales anti-Rabbit, IgGThermo FisherPA1-27158Inmunotinción
Tubos centrífugasVWR89039-664C. albicans cosecha
Tubos de cultivo: vidrio borosilicato 18x150mmVWR47729-583C. albicans cultivo
CuvettesFisher Scientific14-955-127Para medir la densidad óptica de cultivos
Dextrosa (D-glucosa)Fisher ScientificD16-3Medio YPD
GlicerolFisher ScientificG33-4Grado de biología molecular para suplementar para almacenamiento criogénico de C. albicans 
Herramienta de gráficos y visualización de datosGraphPad/PrismSoftware estadístico y herramienta de visualización. Versión 10.6.1.
Herramienta de gráficosRSoftware estadístico. Versión 4.4.3.
IncubadoraEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R para cultivo < >C. albicans cultivo
Cloruro de magnesio (MgCl2)SigmaM8266-100GPara agua planaria y nbsp; (1x Montjuï c salts)
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GPara agua planaria y nbsp; (1x Montjuï c salts)
Portaobjetos de microscopioVWR16004-368
Microscopio multizoomNikonNikon AZ100 
N-acetil-L-cisteínaSigma AldrichA7250-50GReactivo mucolítico y sacrificial  Fijación
Paramaldehído, solución al 16%, grado de biología molecularCiencias de la Microscopía Electrónica15710Reactivo fijador
Motor inalámbrico de mortero de pelletsFisher Scientific12-141-361Homogeneización planaria
Peptone, grado bacteriológicoHIMEDIA/VWR89129-480Medio YPD
MorterosFisher Scientific12-141-368Pellet desechable sin RNasa para homogeneización planaria
Placas de Petri, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poliuretano (alcohol vinílico)Sigma-AldrichP-8136 Para Gelvatol
Cloruro de potasio (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GMedio planario/agua  (1x Montjuï c salts)
Anticuerpo secundario anti-conejo, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Inmunotinción
SN250Centro de Inventario de Genética FúngicaWildtype C. albicans sline (https://www.fgsc.net/)
Azida de sodioFisher ScientificS227-100Para Gelvatol
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGMedio planario/agua  (1x Montjuï c salts)
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GMedio planario/agua  (1x Montjuï c salts)
EspectrofotómetroAgilent26354Microplaca BioTek Epoch 2 para medir la densidad óptica
Incubadora estáticaFisher Scientific15-015-2634C. albicans cultivo
Pipetas de transferenciaFisher Scientific13-711-9CMPipettes graduadas estériles desechables para transferir planarias
Tris BaseSigma-Aldrich252859Para Gelvatol
Extracto de levaduraThermo Fisher212750Medio YPD

Referencias

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