Validación de la integración y expresión aleatoria de transgenes en parásitos de Eimeria

Resumen

Aquí presentamos un método estandarizado para validar la integración y expresión de genes extraños en parásitos transgénicos de Eimeria . Al integrar análisis genómicos y a nivel de proteína, este flujo de trabajo confirma la inserción y expresión estable de los genes. Este enfoque facilita el desarrollo de Eimeria transgénica para la investigación y aplicaciones de vacunas.

Resumen

La validación de los parásitos transgénicos Eimeria es esencial para confirmar la integración genómica estable y la expresión de genes exógenos. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo para verificar la inserción de transgenes y la expresión de proteínas en Eimeria tenella. El procedimiento comienza con la extracción de ADN genómico de ooquistos esporulados, seguida de la amplificación por PCR para verificar preliminarmente la presencia del fragmento objetivo. Para confirmar aún más la integración genómica, se realiza una resecuenciación del genoma completo para identificar los sitios de inserción y evaluar la estabilidad del constructo integrado en el genoma del parásito. La expresión proteica se examina posteriormente mediante Western blot de lisatos preparados a partir de esporozoítos purificados, lo que permite la detección de la proteína recombinante objetivo. Además, la localización intracelular se visualiza mediante un ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA) utilizando células huésped infectadas. En conjunto, estos ensayos proporcionan un marco robusto y reproducible para validar las líneas transgénicas de Eimeria . Este flujo de trabajo permite una confirmación fiable de la integración genómica y la expresión proteica, apoyando así aplicaciones posteriores en manipulación genética, genómica funcional y desarrollo de vacunas dirigidas a parásitos Eimeria .

Introducción

La coccidiosis, causada por especies de Eimeria, representa una de las enfermedades parasitarias más significativas económicamente en aves de corral, lo que provoca una reducción del aumento de peso, una mala conversión de piensos y pérdidas financieras globales estimadas en miles de millones de dólares cada^año. La manipulación genética de los parásitos Eimeria se ha convertido en una herramienta poderosa tanto para la investigación fundamental como para el desarrollo de^{vacunas 4,5,6}. La transfección estable permite la integración y expresión de genes exógenos, como reporteros fluorescentes o antígenos protectores, permitiendo la visualización en tiempo real del desarrollo de parásitos y la evaluación dirigida de candidatos a^{vacunas 7,8,9}.

Una publicación anterior de Duan et al. proporcionó un protocolo estandarizado para la nucleofección y propagación in vivo de Eimeria transgénica, estableciendo un método eficiente para generar y enriquecer líneas parásitas^{recombinantes 10}. Sin embargo, actualmente no existe un flujo de trabajo unificado para confirmar la integración genómica estable y la expresión funcional de los transgenes. Esta validación es fundamental para garantizar la autenticidad, estabilidad y reproducibilidad de las líneas transgénicas utilizadas en estudios biológicos posteriores o aplicaciones de vacunas.

Este artículo presenta un protocolo completo y paso a paso para validar la integración y expresión de transgenes en Eimeria tenella, utilizando una línea transgénica de E. tenella que expresa el antígeno VP2 (Et-VP2) virus de la enfermedad bursal infecciosa (IBDV) como modelo¹¹. El plásmido de expresión p5′AMic2linkerVP2m3′A, que transporta el gen VP2 y un reportero mCherry, fue transfectado en esporozoítos silvestres de E. tenella (Et-WT). Los ooquistos fluorescentes rojos fueron aislados mediante selección celular activada por fluorescencia (FACS) y pasados en serie en pollos libres de coccidia. Este flujo de trabajo demuestra procedimientos para la extracción genómica de ADN, análisis preliminar de integración basado en PCR, resecuenciación del genoma completo para identificar sitios de inserción, Western blot para verificar la expresión proteica y ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA) para visualizar la localización intracelular de la proteína recombinante. En conjunto, estos métodos proporcionan un marco reproducible y completo para confirmar la autenticidad de las líneas transgénicas de Eimeria , permitiendo su uso fiable en la investigación genómica funcional y el desarrollo de vacunas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales que involucraban gallinas fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Agrícola de China (número de aprobación: CAU20160628-2). Todos los procedimientos de manejo y experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de China y cumplieron con los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica que Involucra a Animales. En este estudio se utilizaron pollos White Leghorn de machos específicos de siete días libres de patógenos (SPF). Las aves se mantuvieron bajo condiciones estándar de cría, con acceso libre a alimento y agua durante todo el periodo experimental. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extracción de ADN genómico de ooquistos esporulados de especies de Eimeria.

1. Transfiere 1 mL de una suspensión de ooquiste (≥1 × 10⁷/mL) a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Añade un volumen igual de perlas de vidrio de 1 mm correspondientes a la pelota de oocistes. Altera los ooquistos usando un homogeneizador tisular batiendo vigorosamente la perla a 60 Hz durante 5 minutos hasta que las paredes del oocist estén completamente rotas y el contenido se libere.
2. Recoge la mezcla (excluyendo las perlas de vidrio) en un tubo nuevo y centrifuga a 12.000 x g durante 1 minuto. Descarta el sobrenadante, añade 500 μL de tampón CTAB y 40 μL de proteinasa K, e incuba la mezcla a 60 °C durante 30 minutos.
3. Añade 500 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), vórtice durante 10 s y centrifuga a 12.000 x g durante 5 minutos. Transfiere la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
   NOTA: Tapa y descarta bien el tubo que contiene la capa orgánica para evitar la contaminación del medio ambiente. (Opcional) Si la contaminación proteica sigue alta, repite el paso 1.3 1–2 veces más.
4. Añade 500 μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), vórtice durante 10 s y centrifuga a 12.000 x g durante 5 minutos. Transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo y añade un volumen igual de isopropanol. Mezclar por inversión hasta que aparezcan precipitaciones de ADN.
   NOTA: La precipitación a −20 °C durante ≥1 hora o durante la noche mejora el rendimiento.
5. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos para pelletar ADN. Lava el pellet con etanol al 70%, centrifuga a 12.000 x g durante 5 minutos y desecha el sobrenadante. Elimina cuidadosamente el líquido residual con una bomba de vacío y seca el pellet al aire a temperatura ambiente o a 37 °C.
6. Disuelva el pellet de ADN seco en un tampón_{ddH 2O}o TE que contenga RNasa. Incubar a 37 °C durante ≥1 hora o a 4 °C durante la noche para eliminar el ARN residual. Almacenar el ADN purificado a −20 °C.
   NOTA: Para una preservación a largo plazo, los pellets de ADN sin disuelto pueden almacenarse directamente a −20 °C o −80 °C. Evaluar la integridad y concentración del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa antes de las aplicaciones posteriores.

2. Verificación por PCR de la presencia del constructo Et-VP2 en el genoma del parásito

1. Pares de cebadores de diseño (Tabla 1) para verificar la integración genómica del constructo Et-VP2.
   NOTA: Las secuencias de cebadores fueron diseñadas usando Primer-BLAST, con parámetros típicos de 18–24 pb de longitud de cebador, una temperatura de fusión de aproximadamente 55–60 °C y una formación mínima de estructura secundaria. La especificidad de cada par de cebadores se comprobó más a fondo frente al genoma de Eimeria tenella para evitar la amplificación inespecífica.
2. Preparar una mezcla de reacción de 50 μL que contenga 25 μL de 2× mezcla maestra Taq, 21 μL de ddH₂O, 1 μL de cebadores directos y inversos, y 2 μL de plantilla de ADN.
3. Realizar amplificación utilizando las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 minuto; seguida de una última extensión a 72 °C durante 10 minutos.
   NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos estén bien mezclados antes de hacer el ciclo térmico. Utiliza plantillas de ADN recién preparadas para lograr una eficiencia óptima de amplificación.

3. Resecuenciación de la línea de parásitos transgénicos (Et-VP2)

1. Envío de ejemplos y construcción de bibliotecas
   1. Envía una suspensión de ooquiste de 1 mL (≥1 × 10⁷/mL) a un proveedor comercial de servicios de secuenciación para un análisis de resecuenciación de próxima generación.
   2. Tras la evaluación de la calidad del ADN genómico, fragmentar el ADN mediante una alteración mecánica mediante ultrasonidos. Purificar el ADN fragmentado, realizar reparaciones en los extremos, añadir una base de adenina (A) a los extremos de 3′ y ligar adaptadores de secuenciación.
   3. Selecciona fragmentos de ADN del tamaño deseado mediante electroforesis en gel de agarosa y realiza amplificación por PCR para construir la biblioteca de secuenciación.
   4. Someter la biblioteca construida a inspección de calidad. Realizar secuenciación de extremos emparejados en la plataforma Illumina NovaSeq usando una longitud de lectura de 150 pb. Mantener una profundidad de secuenciación del 100× para garantizar la precisión de los datos, generando al menos 6 GB de datos en bruto con una puntuación mínima de calidad de Q20 >90%.
      NOTA: Manipular todos los reactivos y muestras de ADN utilizando técnicas asépticas para evitar la contaminación. Verifica que los parámetros de secuenciación cumplan con las métricas de profundidad y calidad requeridas antes de proceder al análisis de datos.
2. Análisis de datos
   1. Filtra los datos de secuenciación en bruto usando el software Fastp (v0.23.2) según el siguiente^{criterio 12}:
      1. Quita las secuencias de adaptadores.
      2. Establece el umbral de baja calidad a Q20 y elimina las lecturas en las que las bases de baja calidad representan más del 30% de la longitud total de lectura.
      3. Elimina lecturas más cortas que 50 pb.
   2. Alinear las lecturas controladas de calidad al genoma de referencia de E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) usando el software Bowtie2 (v2.4.5)¹³. La aleatoriedad de los datos de secuenciación de nueva generación se evalúa en función de la profundidad de cobertura y la uniformidad.
   3. Asegúrese de que las lecturas de secuenciación estén alineadas con la secuencia vectorial transgénica. Eliminar las lecturas que no mapean la región del T-ADN para obtener lecturas quiméricas, en las que un extremo corresponde al T-ADN y el otro al genoma de referencia de E. tenela .
   4. Basándose en las secuencias de las lecturas quiméricas, realiza el alineamiento usando ToxoDB (versión 64) para determinar la ubicación específica de posibles sitios de inserción de T-ADN. Analizar la profundidad de secuenciación a través de regiones homólogas entre el vector y el genoma de Eimeria (es decir, las regiones reguladoras 5′ y 3′) utilizando el software Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Identificar posibles sitios de integración del plásmido transgénico dentro del genoma de E. tenella y verificarlos mediante PCR utilizando el sistema de reacción descrito en el paso 2.1.
      NOTA: Asegurar el uso coherente de versiones del software y ajustes de parámetros durante todo el análisis para mantener la precisión y reproducibilidad de los datos.

4. Plaque occidental de proteínas transgénicas de Eimeria

1. Recoge una suspensión PBS que contenga al menos 5 ×^{10 6} esporozoítos en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifuga a 2500 x g durante 5 minutos. Resuspende el pellet en un tampón lisis RIPA de 100 μL e incuba en hielo durante 1 hora. Añade 20 μL de buffer de carga proteica de 6× y calienta la mezcla a 100 °C durante 10 minutos.
2. Prepara los geles SDS-PAGE usando una placa de vidrio de 1,5 mm. Ajusta la concentración de acrilamida según el peso molecular de la proteína objetivo. Durante la polimerización, superpone el gel separador con agua destilada para asegurar una superficie uniforme antes de añadir el gel apilante.
3. Centrifuga el lisado a 10.000 x g durante 5 minutos y carga 40 μL de sobrenadante en cada carril de muestra. Carga 10 μL de marcador de proteína en un carril separado y llena los carriles restantes con 40 μL de 1× búfer de carga como control.
4. Realizar electroforesis en 1× tampón de funcionamiento a 70 V durante 20 minutos, seguido de 120 V durante 60–90 minutos, hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
5. Extirpa el gel según el tamaño esperado de proteína. Preactiva una membrana PVDF en metanol durante 1 minuto y monta el sándwich de transferencia en el siguiente orden: esponja, papel filtrante, gel (lado del cátodo), membrana PVDF, papel filtro, esponja. Elimina cualquier burbuja de aire y transfiere proteínas a 70 V durante 3 horas en el tampón de transferencia.
6. Lava la membrana tres veces con PBST (5 minutos cada una) y bloquea con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 °C. Lava la membrana dos veces con PBST para eliminar la solución residual bloqueadora.
7. Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos en un amortiguador de anticuerpos: anti-Flag policlonal de ratón (1:2000) y anti-GAPDH monoclonal de ratón (1:2000). Incuba durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con suaves agitaciones. Recoge la solución de anticuerpos y lava la membrana cinco veces con PBST (5 min cada una).
8. Incubar la membrana con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (1:2000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Lava la membrana cinco veces con PBST (5 minutos cada una).
9. Prepara un sustrato ECL mezclando volúmenes iguales de solución A y B. Aplica el sustrato de forma uniforme a la membrana y detecta señales proteicas mediante un sistema de imagen quimioluminiscencia.
   NOTA: Realiza todos los pasos que involucran muestras de proteína sobre hielo, salvo que se especifique lo contrario. Manipula sustratos de metanol y ECL en una campana extractora mientras llevas guantes y gafas de protección.

5. Ensayo intracelular indirecto de inmunofluorescencia (IFA) de Eimeria transgénica

1. Purificación de esporozoítos mediante columna de cromatografía
   1. Conecta la columna de cromatografía a una bomba peristáltica y ajusta el caudal a 50–60 Hz. Lava la columna con agua destilada y solución de glicina.
   2. Añadir suspensión de celulosa DE-52 a la columna mientras se añade continuamente solución de glicina hasta que la cama de celulosa alcance aproximadamente 1 cm de altura.
   3. Carga los esporozoítos purificados por el método Percoll sobre la columna. Mantener un caudal de 30–40 Hz usando solución de glicina y recoger el flujo en un tubo centrífuga de 50 mL.
   4. Monitoriza el eluato colocando gotas sobre una lámina de vidrio para observación microscópica. Cuando no se detecten esporozoítos, detén la bomba. Centrifuga la fracción recogida a 2.500 x g durante 5 minutos, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en PBS.
      NOTA: Realiza todos los pasos en condiciones estériles para evitar la contaminación microbiana. Eliminar los residuos de glicina y Percoll según las normativas de bioseguridad institucional.
2. Infección por esporozoíto de células HFF
   1. Semillar 1 × 10^{10 6} esporozoítos en placas de 24 pozos que contienen monocapas de células HFF. Añadir penicilina-estreptomicina a una concentración final de 1× (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina), mezclar suavemente e incubar a 37 °C durante 4–6 horas para permitir la invasión. Retira el medio, lava una vez con 1 mL de PBS y desecha el sobrenadante.
   2. Retira cuidadosamente las cubiertas de vidrio de los pozos usando pinzas estériles y transfiere a una placa nueva de 24 pozos. Fija las muestras en 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos, lava una vez con 1 mL de PBS y descarta el sobrenadante.
   3. Permeabiliza las células con 1 mL de 0,25% de Triton X-100 durante 30 minutos. Lava una vez con 1 mL de PBS y descarta el sobrenadante.
   4. Bloquea las muestras con 1 mL de BSA al 3% durante 30 minutos. Lava una vez con 1 mL de PBS y descarta el sobrenadante.
   5. Diluir el anticuerpo monoclonal anti-Flag del ratón (1:200) en un 3% de BSA. Coloca gotas del anticuerpo diluido sobre una película de sellado e invierte las cubiertas (lado celular hacia abajo) sobre las gotas. Incubar las cubiertas en una cámara humidificada a 37 °C durante 1 hora. Lávate tres veces con 1 mL de PBS (5 min cada uno).
   6. Diluir IgG anti-ratón conjugado con FITC (1:200) y Hoechst 33258 (1:100) en 3% de BSA. Coloca gotas de la mezcla de tinte sobre una película de sellado y invierte las cubiertas sobre las gotas. Incuba en una cámara humidificada a 37 °C durante 1 hora, luego lava cinco veces con 1 mL de PBS (5 min cada una).
   7. Monta los holbós colocando un medio de montaje antifade de 5 μL sobre una corredera de vidrio. Invierte la cubierta (con la celda hacia abajo) sobre la caída, evitando burbujas de aire, y sella los bordes. Guarda las láminas montadas en una cámara humidificada a 4 °C hasta la obtención de imágenes.
      NOTA: Manipula paraformaldehído y Triton X-100 en una campana extractora química mientras llevas guantes y protección ocular. Las formulaciones de reactivos utilizadas en este procedimiento se enumeran en la Tabla 2.

Resultados

El análisis genómico por PCR confirmó la presencia del fragmento objetivo en los parásitos transgénicos, mientras que no se detectaron bandas correspondientes en el control tipo salvaje (Figura 1A). La resecuenciación del genoma completo demostró además que el plásmido linealizado se integró de forma estable en el genoma del parásito, y el sitio de integración predicho fue validado mediante amplificación por PCR a lo largo de la región de unión (

Discusión

Este protocolo establece un flujo de trabajo integral para validar la integración genómica, la expresión proteica y la localización intracelular de genes exógenos en E. tenella transgénico. En lugar de basarse en un solo ensayo, el enfoque combina evidencia genómica y a nivel proteico, asegurando que la inserción de transgenes esté tanto confirmada estructuralmente como expresada funcionalmente.

Varios pasos críticos en este protocolo influyen fuertem...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Antifade Mounting Medium	MCE	HYK1042	Medio de montaje fluorescente para prevenir el blanqueamiento por foto
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Búfer de bloqueo y búfer de dilución de anticuerpos para IFA; bloquear a temperatura ambiente durante 30 min
Cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)	Sigma	C0549	Reactivo para eliminar fenol residual durante la extracción de ADN genómico
Pollos libres de Coccidia	Boehringer-Ingelheim	SPF	Utilizado para el paso in vivo y la amplificación de cepas transgénicas; aprobado por el Comité de Ética (número de aprobación: CAU20160628-2)
CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio)	Merck KGaA	H5882	Componente del búfer de extracción de ADN genómico; formulación: 3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA, ajustado a un volumen final de 150 mL con ddH2O
Celulosa DE-52	Solarbio	C8350	Medio de cromatografía de intercambio iónico para la purificación de esporozoítos; tratado secuencialmente con NaOH, HCl y agua destilada, luego equilibrado con solución de glicina
Sustriato ECL (Solución A + Solución B)	thermofisher	32106	Reactivo de detección quimioluminiscente; mezcle volúmenes iguales de Solución A y B antes de usar
IgG Anti-Ratón Conjugado con FITC	Sigma	AP124F	Anticuerpo secundario fluorescente para IFA, razón de dilución 1:200
Perlas de vidrio	Sigma	Z250473-1PAK
Solución de glicina	Sigma	67419	Búfer de equilibración y elución para columnas de cromatografía; formulación: 0.75 g de glicina + 7.9 g de NaCl disueltos en 500 mL de agua destilada, pH ajustado a 7.4-7.6, esterilizado en autoclave
Hoechst 33258	Sigma	94403	Reactivo de tinción nuclear, razón de dilución 1:100; utilizado para la localización IFA
IgG Anti-Ratón Conjugado con HRP	Sigma	12-349	Anticuerpo secundario para Western blotting, razón de dilución 1:2000
Plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)		Plataforma de secuenciación de próxima generación; secuenciación de extremos emparejados (longitud de lectura de 150 pb), profundidad de secuenciación 100×, generando ≥6 GB de datos brutos (Q20>90%)
Centrífuga de baja velocidad	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Anticuerpo monoclonal anti-Flag de ratón	Sigma	F1804	Anticuerpo primario, razón de dilución 1:200; utilizado para la detección IFA de la proteína de fusión marcada con Flag
Anticuerpo monoclonal anti-GAPDH de ratón	Sigma	G8795	Anticuerpo primario, razón de dilución 1:2000; utilizado como control de carga para Western blotting
Leche descremada (5%)	Beyotime	P0216	Búfer de bloqueo para Western blotting; bloquear a temperatura ambiente durante 1 h o 4°C durante la noche
Paraformaldehído (4%)	Merck KGaA	30525	Solución de fijación celular; fijar a temperatura ambiente durante 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicilina-Estreptomicina (100×)	Yeasen	60162ES76	Antibiótico para cultivo celular; inhibe la contaminación microbiana
Percoll (stock gradiente DG)	GE Healthcare	17-0891-09
Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reactivo para la eliminación de proteínas durante la extracción de ADN genómico
Búfer de carga de proteínas (6×)	Beyotime	P0015F	Búfer de carga para electroforesis de proteínas; formulación: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glicerol, 6 M urea; mezclar con 50 μL 2 M DTT y 50 μL 5% azul de bromofenol antes de usar
Proteinasa K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg disueltos en 10 mL de ddH2O, utilizados para la digestión de proteínas durante la extracción de ADN genómico
Membrana PVDF	thermofisher	88518	Membrana de transferencia de proteínas; activada con metanol durante 1 min antes de usar
Búfer de lisis RIPA	Yeasen	20101	Búfer de lisis para la extracción de proteínas de esporozoítos
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg disueltos en 2.5 mL de 0.01 mol/L NaAc, calentados a 100°C durante 10-15 min, pH ajustado a 7.4 con 1 mol/L Tris-HCl; utilizado para la eliminación de ARN de muestras de ADN
Reactivos para gel de SDS-PAGE (Acrilamida, Bis-acrilamida, Tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Reactivos para la preparación de geles de SDS-PAGE; la concentración de acrilamida se ajusta según el peso molecular de la proteína objetivo
Hidratato de taurodeoxicolato sódico	Sigma	T0875
solución)
Taq Master Mix (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	Premezcla de amplificación PCR que contiene Taq polimerasa, dNTPs, etc.
Tritón X-100 (0.25%)	Merck KGaA	9036	Solución de permeabilización celular; incubar a temperatura ambiente durante 30 min
Tripsina	Solarbio	T8150
Mezclador Vortex	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Baño de agua termostatado	Grant Instruments (Cambridge)	GD120,GM0815010