Artículo de método

Un método eficiente y rápido HPLC-QQQ-MS para la cuantificación de alcaloides tropanos en plantas medicinales

DOI:

10.3791/70510

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12 de junio de 2026

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1College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

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Este estudio desarrolló una cromatografía líquida de alta potencia junto con el método de espectrometría de masas triple cuadrupolar (HPLC-QQQ-MS) para identificar y cuantificar alcaloides tropanos (hiosciamina, anisodamina, escopolamina) en Anisodus tanguticus. El método resultó rápido, preciso y fiable para el análisis de alto rendimiento de plantas medicinales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anisodus tanguticus es una planta medicinal tibetana. Los alcaloides tropanos (TAs), como la hiosciamina, la anisodamina y la escopolamina, presentan importantes actividades farmacológicas analgésicas y sedantes, lo que convierte a esta especie en una valiosa fuente natural para extraer estos compuestos bioactivos. Sin embargo, la composición química de A. tanguticus es muy compleja. Incluye un gran número de compuestos sin estructuras elucidadas, lo que hace que la identificación sistemática y caracterización estructural de sus constituyentes activos sea especialmente importante. Aunque la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se ha utilizado ampliamente para la separación de extractos de esta planta, muchos componentes desconocidos siguen siendo difíciles de identificar con precisión, incluso con la comparación de bases espectrales.

Este estudio estableció un método analítico basado en cromatografía líquida de alto rendimiento combinada con espectrometría de masas triple cuadrupolar (HPLC-QQQ-MS) para la determinación de alcaloides tropanos en A. tanguticus. El método abarca una serie de procedimientos sistemáticos, que incluyen la preparación estandarizada de la muestra, la configuración de parámetros por espectrometría de masas, la pre-equilibración de LC, el establecimiento del método, la adquisición de datos de MS, el escaneo por espectrometría de masas multietapa (MSⁿ) y la interpretación manual de datos. Utilizando esta estrategia, identificamos con éxito tres alcaloides representativos de tropanos en A. tanguticus: hiosciamina, anisodamina y escopolamina. Además, valida la precisión del método establecido HPLC-QQQ-MS, confirmando que el método es rápido, sensible, factible y preciso para la determinación cuantitativa de alcaloides tropanos (TAs) en A. tanguticus. El enfoque establecido demuestra buena versatilidad y fiabilidad, y es adecuado para la identificación y cuantificación de alto rendimiento de alcaloides tropanos en A. tanguticus y otras plantas medicinales.

Introducción

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La eficacia terapéutica de la medicina tradicional china (MTC) depende en gran medida de sus metabolitos secundarios, como alcaloides, flavonoides, terpenoides y otros componentes activos 1,2,3. En consecuencia, el análisis cualitativo y cuantitativo preciso y sensible de metabolitos objetivo específicos en estas mezclas complejas es un paso clave para garantizar la calidad de la MTC, esclarecer la base material de su eficacia y avanzar en la investigaciónmoderna 3. Sin embargo, la diversidad y complejidad de los componentes de la MTC, junto con las concentraciones extremadamente bajas de muchos ingredientes activos clave, presentan desafíos considerables para lograr una detección eficiente y precisa.

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher representa una fuente botánica importante de alcaloides tropanos (TAs)4, conocidos por su rico contenido de compuestos tipo tropano farmacológicamenteactivos5. Los alcaloides característicos clave incluyen anisodamina, escopolamina e hiosciamina, que comparten un núcleo de tropanos comunes pero presentan sustituciones de grupos funcionales distintas (Figura 1), lo que conduce a perfiles farmacológicosdivergentes 6,7,8. Aunque sus similitudes estructurales complican la resolución cromatográfica, también ofrecen un modelo valioso para investigaciones comparativas de fitoquímicos y metabólicos. Estudios recientes han investigado la composición química y las variaciones geográficas de A. tanguticus utilizando enfoques de metabolómica y farmacología deredes 9,10. Los enfoques analíticos actuales para los metabolitos de A. tanguticus se basan predominantemente en la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)11. No obstante, los niveles de alcaloides tropanos en A. tanguticus en la fase de plántulas pueden ser tan bajos como un 0,01% (una parte por cada diez mil), y los métodos convencionales de HPLC suelen estar limitados por una resolución limitada, sensibilidad y capacidad analítica. Estas limitaciones dificultan la separación completa de los anólogos alcaloides estructuralmente análogos y dificultan la detección de constituyentes traza, comprometiendo así la precisión analítica y limitando el soporte para aplicaciones de investigación más avanzadas. En los últimos años, los avances en HPLC junto con la espectrometría de masas en tándem han proporcionado herramientas poderosas para abordar estos cuellos de botella analíticos. La cromatografía líquida de alto rendimiento - espectrometría de masas triple cuadrupolar (HPLC-QQQ-MS), en particular, ofrece una resolución cromatográfica notablemente mejorada, eficiencia de separación y una sensibilidad excepcional 12,13,14. Esta tecnología ha surgido como una plataforma de vanguardia para la investigación de metabolitos secundarios en la MTC, permitiendo la calificación y cuantificación eficiente y precisa de analitos traza objetivo dentro de intrincadas matricesbiológicas 11,15,16,17. Como tal, proporciona una base técnica sólida para un perfilado químico integral y una evaluación de la calidad de plantas medicinales como A. tanguticus. En este estudio, abordamos los desafíos persistentes en la detección de alcaloides tropanos en A. tanguticus, con énfasis en la identificación y cuantificación precisa de los componentes a nivel de traza. Optimizando sistemáticamente las condiciones cromatográficas y espectrométricas de masas, desarrollamos y validamos un método novedoso HPLC-QQQ-MS para la determinación simultánea de múltiples alcaloides principales de tropanos. El enfoque optimizado mejora significativamente la sensibilidad, selectividad y robustez metodológica, superando así limitaciones comunes asociadas a los ensayos convencionales basados en espectrometría de masas —como la sensibilidad insuficiente, los efectos matriciales y la interferencia de coelución— que a menudo se encuentran durante el análisis de compuestos alcaloides traza.

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Protocolo

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1. Preparación de muestras

  1. Preparación de soluciones estándar
    1. Pesa con precisión 10,0 mg de cada uno de los estándares de referencia de hiosciamina, hidrobromuro de anisodamina y hidrobromuro de escopolamina utilizando una balanza analítica de una décima milésima parte, y colócalos en matrazos volumétricos separados de 10 mL, respectivamente.
    2. Añadir metanol de grado cromatográfico a la línea marcada y disolver completamente los estándares mediante tratamiento ultrasónico para preparar soluciones estándar únicas con una concentración de 1,0 mg/mL.
    3. Transfiere las soluciones de origen a botellas de reactivo marrón y guárdalas a 4 °C en la oscuridad.
      NOTA: Los alcaloides utilizados son altamente tóxicos. Toma precauciones de seguridad al manipular las muestras estándar. Todas las soluciones se preparaban frescas antes del análisis y se almacenaban a 4 °C en la oscuridad para evitar su degradación.
  2. Preparación de soluciones de trabajo mixtas
    1. Pipetear 100 μL de cada solución estándar mencionada en un matraz volumétrico de 10 mL, y diluir hasta la línea marcada con metanol de grado cromatográfico para preparar una solución intermedia estándar mixta de 10 μg/mL.
    2. Según los requisitos de rango lineal, se diluye aún más la solución intermedia paso a paso con metanol para obtener una serie de soluciones de trabajo mixtas.
    3. Tomemos 50 μL, 200 μL y 500 μL, respectivamente. Obtén concentraciones de 0,5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL y 10 μg/mL. Prepárate fresco antes de usar.
    4. Transfiere 100 μL de la solución intermedia de 10 μg/mL en un matraz volumétrico de 1 mL para preparar una solución diluida de 1 μg/mL.
    5. Luego, transfiere 100 μL de la solución de 1 μg/mL a otro matraz volumétrico de 1 mL y diluída hasta el volumen con metanol.
  3. Pretratamiento de la muestra
    1. Realiza la liofilización de materiales frescos de Sophora flavescens y posteriormente pulveriza hasta obtener un polvo homogéneo usando un molinillo de alta velocidad.
    2. Tamizar la polvo mediante un tamiz estándar de prueba de 0,25 mm. Pesa con precisión 20 mg de este polvo, transfiere a un matraz volumétrico de 100 mL y añade metanol de grado cromatográfico casi a la línea marcada.
    3. Realiza extracción ultrasónica a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la extracción, saca el matraz volumétrico, déjalo enfriar a 25 °C a temperatura ambiente, repone el metanol de grado cromatográfico hasta la línea marcada de 100 mL y mezcla en vórtice durante 2 minutos.
    4. Pipetear 1 mL del extracto anterior en un matraz volumétrico de 100 mL y diluir hasta la línea marcada con metanol (dilución de 100 veces). Tras agitar bien, actúa como solución madre para la inyección de HPLC (Figura 2).
      NOTA: Al operar la máquina de moler de alta velocidad, es esencial llevar gafas protectoras y una mascarilla antipolvo; Controla la cantidad y duración del molienda para evitar el sobrecalentamiento.
  4. Filtración y almacenamiento de muestras
    1. Prepara una jeringuilla desechable sin aguja de 1 mL (especializada en cromatografía, no adsortiva) y una membrana microporosa en fase orgánica de 0,22 μm.
    2. Aspira 1,2 mL de la solución madre para la inyección y presiona lentamente para la filtración.
    3. Recoge el filtrado posterior en un frasco de muestra de 2 mL con un inserto interior y sella herméticamente con una tapa.
      NOTA: La frecuencia del limpiador ultrasónico está fijada en 40 kHz. Evitar aflojar la tapa del matraz volumétrico durante la extracción para evitar la volatilización del disolvente. Ajustar el factor de dilución según la respuesta máxima de la muestra en el preexperimento para asegurar que el área de pico objetivo se sitúa dentro del rango lineal de la curva estándar. Todas las muestras deben almacenarse inmediatamente en un frigorífico a 4 °C.

2. Prerun de HPLC, establecimiento de métodos y adquisición de MS

  1. Preparación de fases móviles
    1. Preparar la fase móvil A: Mide 1000 mL de agua ultrapura, añade 1,0 mL de ácido fórmico de grado cromatográfico (fracción volumétrica: 0,1% v/v) y mezcla uniformemente con un agitador magnético durante 10 minutos.
    2. Preparar la fase B móvil: Utilizar metanol de grado cromatográfico directamente sin tratamiento adicional.
    3. Vierte las fases móviles A y B en dispositivos de desgasificación ultrasónica, respectivamente, y realiza desgasificación ultrasónica a 40 kHz durante 15 minutos.
    4. Transfiere inmediatamente las fases móviles desgasificadas a botellas de disolvente tras el desgasificación, sellarlas y conectarlas a las correspondientes líneas de disolvente A y B del sistema HPLC.
      NOTA: Todos los disolventes son de grado cromatográfico y deben filtrarse a través de una membrana microporosa en fase orgánica de 0,45 μm antes de su uso. Controla la presión del sistema regularmente. Si la fluctuación de presión supera el ±±5%, comprueba si hay posibles obstrucciones en la columna o burbujas de aire en la tubería.
  2. Establecimiento de condiciones de HPLC
    1. Utiliza una columna de C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 2,7 μm) para la separación cromatográfica. Equilibrar la columna con metanol:agua = 80:20 (v/v) durante 30 minutos antes de su uso, con un caudal de 0,3 mL/min durante el equilibrio. Ajusta la temperatura del horno de columna a 30 °C y empieza a precalentar con 10 minutos de antelación.
    2. Optimizar un programa de elución de gradiente de la siguiente manera: 0–10,0 min, 5% a 10% B; 10,0–15,0 min, 10% a 35% B; 15,0–20,0 min, 35% a 60% B; 20,0–25,0 min, 60% a 95% B. Ajusta el caudal a 0,60 mL/min, el volumen de inyección a 2 μL y la longitud de onda de detección a 210 nm.
  3. Condiciones espectrométricas de masas
    1. Realizar detección por espectrometría de masas (MS) utilizando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (QQQ) equipado con una fuente de ionización por electrospray (ESI) que opera en modo de ionización positiva (ESI+).
    2. Establecer los parámetros de operación de la siguiente manera: presión del nebulizador: 15 psi; voltaje capilar: 4000 V; temperatura del gas: 300 °C; y caudal de gas: 11 L/min.
    3. Optimiza sistemáticamente los parámetros MS/MS para cada analito.
      1. Primero, identificar iones precursores infundiendo directamente soluciones estándar individuales en modo SCAN MS2 .
      2. Optimiza el voltaje del fragmentador para cada ion precursor hasta la intensidad máxima de la señal usando el modo SIM MS2.
      3. Posteriormente, emplea el modo de escaneo iónico producto para determinar los iones producto característicos. Optimiza sistemáticamente la Energía de Colisión (CE) para el ion precursor para maximizar la intensidad de la señal producto-ión.
      4. Selecciona el ion producto más intenso para cuantificación y utiliza el segundo ion más intenso para la confirmación cualitativa.
        NOTA: Identificar iones precursores mediante infusión directa de soluciones estándar individuales en modo SCAN MS2. Asegúrate de que la concentración estándar de solución sea adecuada para evitar la saturación de la señal. Calibra el instrumento regularmente para evitar desviación de parámetros.
  4. Validación del método
    1. Especificidad
      1. Inyectar disolvente en blanco (metanol), mezclar la solución de trabajo estándar y extraer la muestra por separado, y comparar los cromatogramas.
      2. Asegúrese de que se cumplan los siguientes requisitos: No hay picos interferentes en el disolvente en blanco; el tiempo de retención de los componentes objetivo en la muestra es consistente con el del estándar (desviación ≤ ±±0,1 min); La relación de área máxima del ion cuantificador respecto al ion calificador se ajusta a la del estándar (desviación ≤ ±±10%).
    2. Linealidad
      1. Inyectar la serie de soluciones mixtas preparadas en el paso 1.1 (0,1, 0,5, 2, 5, 10 μg/mL) secuencialmente bajo las condiciones HPLC-MS mencionadas, con 3 inyecciones por concentración.
      2. Grafica la curva estándar con la concentración (x, μg/mL) de cada componente como la abscisa y el área pico media (y) del ion cuantificador como la ordenada. Realizar un análisis de regresión lineal, requiriendo un coeficiente de correlación (R2) ≥ 0,995.
    3. Precisión y exactitud
      1. Precisión intradía (repetibilidad): Analizar 6 réplicas de muestras de control de calidad (QC) en tres niveles de concentración (2 μg/mL, 5 μg/mL y 10 μg/mL) en un día, y calcular la desviación estándar relativa (RSD%).
      2. Precisión interdía (precisión intermedia): Preparar de forma independiente muestras de control de calidad del mismo lote de materia prima vegetal seca y analízalas por diferentes operadores durante tres días consecutivos. y calcular el porcentaje de RSD. Asegúrate de un RSD% ≤ 10% para ambos.
      3. Evalúa la precisión usando una prueba de recuperación por picos y expresa como tasa de recuperación (%). Asegurarse de que la tasa media de recuperación de bajas, medias y altas concentraciones oscile entre el 85% y el 115%, con un RSD% ≤ 5%.
        NOTA: El rango lineal debe cubrir el rango esperado de concentración de los componentes objetivo en muestras reales (incluyendo niveles bajos, medios y altos) para reflejar la aplicabilidad práctica. Todos los experimentos de validación se realizaron en triplicado y los resultados se expresaron como el valor medio.

3. Adquisición de datos

  1. Realizar la adquisición de datos en modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM). Consulte la Tabla 1 para los parámetros optimizados del MRM —incluyendo iones precursores, transiciones de iones producto, voltaje del fragmentador y energía de colisión (CE)— para cada analito.
  2. Calcular el tiempo de permanencia para asegurar un número adecuado de puntos de datos en cada pico cromatográfico para cada transición, manteniendo un tiempo de ciclo adecuado.

4. Análisis de datos

  1. Inicia el software de análisis cualitativo, haz clic en Archivo > Importar datos e importa todos los archivos de datos recogidos (formato .d).
  2. Extracción de cromatogramas iónicos extraídos (EICs): En el módulo de Cuantificación , selecciona Transición MRM, introduce los pares iónicos iónico-producto precursor de cada componente y extrae los EICs correspondientes.
  3. Validación e integración de picos: Comprueba la simetría de picos y la consistencia del tiempo de retención (desviación ≤ ±±0,1 min respecto al estándar) de los picos objetivo en cada EIC.
  4. El software realiza la integración automática por defecto; Si existen derivaciones de línea base o picos interferentes, ajustar manualmente los parámetros de integración (puntos de inicio y final de integración) para asegurar una integración precisa.
  5. Calcular la concentración de cada componente en muestras desconocidas usando la curva estándar. Haz clic en Reporte > Generar informe, selecciona el formato de Excel para exportar el informe. El informe incluye el nombre del compuesto, el tiempo de retención, la zona de pico, la concentración, el RSD%, etc.

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Resultados

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Separación cromatográfica e identificación de TA HPLC-QQQ-MS
Un cromatograma típico de MRM obtenido a partir del análisis de una mezcla estándar y un extracto de raíz de A. tanguticus se presenta en las Figuras 3 y 4. Bajo las condiciones optimizadas del HPLC, los tres alcaloides de tropano objetivo: hiosciamina, anisodamina y escopolamina, se separaron con éxito en menos de 20 minutos, demostrando l...

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Discusión

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Con el creciente interés en los metabolitos secundarios de las plantas, las técnicas analíticas para la detección de alcaloides han recibido una atención significativa. Aunque se ha establecido un sistema cromatográfico fundamental para analizar alcaloides (TA) de tropanos, avances recientes, como la adopción de la electroforesis capilar (CE), el mejoramiento del rendimiento instrumental en GC–MS y HPLC–MS, y la identificación de compuestos estructurales novedosos...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan (Nº 2024MS562) y el Programa de Talento Xinglin de la Universidad de Chengdu de la MTC (Nº MPRC2022035). Realmente agradecimos el apoyo del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agilent MassHunter softwareAgilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18 columnAgilent Technologies880975-902C18 reversed-phase column, 4.6 × 250 mm, 5 μm
Anisodamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd101-31-5HPLC>98%
Formic AcidSigma-Aldrich5.33002
freeze dryerEYELA, Tokyo, JapanFDU-2110
High-speed universal grinderTaisite Instrument Co., Ltd., Tianjin, China6010210100FW-100,24,000 rpm, 100 g capacity, 80 mesh
HyoscyamineChengdu glip Biotechnology Co., Ltd55449-49-5HPLC>98%
MethanolThermo Fisher Scientific022909.K2
Microporous Membrane 0.22μmMilliporeSLGV033RB
Milli-Q Direct 8 water systemMilliporeSigma, Burlington, MA, USAZRQSVP0JP
Scopolamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd114-49-8HPLC>98%

Referencias

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