Generación y análisis transcriptómico unicelular de organoides de carcinoma hepatocelular tras el tratamiento con medicamentos

Summary

Este protocolo describe un método simplificado para generar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamientos farmacológicos y realizar secuenciación de ARN unicelular antes y después del tratamiento para caracterizar los cambios transcripcionales asociados al tratamiento.

Abstract

El carcinoma hepatocelular es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial y se caracteriza por una marcada heterogeneidad intratumoral, que contribuye a respuestas variables al tratamiento, recurrencia tumoral y progresión de la enfermedad. Por tanto, es esencial comprender más profundamente cómo cambian las células tumorales a nivel transcripcional antes y después del tratamiento farmacológico para mejorar las estrategias terapéuticas. Sin embargo, los flujos de trabajo experimentales prácticos que conectan el tratamiento farmacológico basado en organoides con el perfilado transcriptómico de células individuales a continuación siguen siendo limitados. En este estudio, se desarrolla un flujo de trabajo estandarizado para generar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamientos farmacológicos definidos y realizar secuenciación de ARN unicelular en muestras recogidas antes y después del tratamiento. El protocolo incluye la reactivación y expansión de organoides, evaluación de calidad previa al tratamiento, exposición a fármacos, preparación de organoides para disociación unicelular, construcción de bibliotecas y análisis comparativo básico de datos transcriptómicos unicelulares. Se proporcionan precauciones técnicas críticas para mejorar la reproducibilidad y la calidad de la muestra. Este flujo de trabajo permite la caracterización paralela de la composición celular y los cambios transcripcionales asociados al tratamiento farmacológico en organoides de carcinoma hepatocelular. El protocolo es robusto, escalable y adaptable a diferentes sistemas organoides, proporcionando una plataforma práctica para investigar los cambios en la expresión génica asociada al tratamiento a resolución de una sola célula.

Introduction

El carcinoma hepatocelular (CCH) es el cáncer de hígado primario más común en adultos y una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en todo^{el mundo 1,2,3}. Su bajo resultado clínico se debe a una heterogeneidad intratumoral significativa, lo que conduce a resistencia al tratamiento y^{recurrencia 4}. Un estudio reciente indica que la diversidad del desarrollo y la plasticidad del estado celular, impulsadas por programas transcripcionales clave como el eje FOXM1/CEBPB, contribuyen a la resistencia te....

Protocol

Los estudios con tejidos humanos fueron revisados y aprobados por los Comités de Revisión Ética de la Investigación de la Universidad Médica de Guangzhou (nº de aprobación). GYZL-2024-KY31). Todos los procedimientos que involucraron especímenes humanos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para la investigación en humanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes para el uso de sus muestras clínicas en la investigación médica. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

Este flujo de trabajo incluye la....

Results

La Figura 1 describe la generación y caracterización de organoides del carcinoma hepatocelular (HCC). En la Figura 1A, se utilizaron tejidos tumorales derivados del paciente para establecer cultivos organoides para análisis histológicos y estudios de tratamiento. La Figura 1B muestra imágenes de campo claro de organoides en los días 1 y 6 tras la recuperación, demostrando supervivencia y expansión b.......

Discussion

Para garantizar la reproducibilidad, la eficiencia y un análisis transcriptómico de célula única de alta calidad, varios pasos técnicos en este flujo de trabajo requieren un control cuidadoso. La consistencia durante la reactivación y expansión de organoides HCC derivados del paciente es esencial, ya que las variaciones en la densidad de siembra, la composición de la matriz de membrana basal y el momento del cultivo pueden influir en la morfología, el crecimiento y las respuestas posteri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrina I humana	Merck	G9145
Microtubos de 1,5 mL	Merck	AXYMCT150LC
1X Buffer de Lisis de los Glóbulos Rojos	Thermo Fisher Scientific	00-4333-57
Vials criogénicos de hilo interno de 2,0 ml	Nest	607001
A8301 (inhibidor de TGFb)	Tocris Bioscience	2939
Anticuerpo policlonal AFP	Proteintech	14550-1-AP
Anticuerpo antialbúmina [ALB/2144]	ABCAM	ab236492
Anticuerpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grado ChIP	ABCAM	ab181604
Anticuerpo anti-prealbúmina [EPR3219]	ABCAM	ab92469
Anticuerpo anti-SOX9 [EPR14335-78]	ABCAM	ab185966
Suplemento de B27 (503), sin vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Solución de recuperación celular, 100 mL	Corning	354253	Reactivo utilizado para disolver la matriz de membrana basal y recuperar organoides antes de volver a plantar o procesar aguas abajo
CellTiter-Glo®   Ensayo de Viabilidad de Células 3D	Promega	G9681
CHIR99021	Merck	SML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca y Kit de cuentas de gel v3.1	Genómica 10x	CG000227
Colador de células de Corning, 40 y mu; m, Blue, S, IND, 1/50	Corning	431750
Placas de acoplamiento múltiple de varios pozos transparentes de 24 pozos transparentes de fondo plano, ultra-bajo, envueltas individualmente, estériles	Corning	3473
Cultrex Reducción del Factor de Crecimiento BME, PathClear tipo 2 (BME)	Merck	3533-005-02	Matriz extracelular utilizada para apoyar el cultivo de organoides tridimensionales y la formación de cúpulas
DMSO	Merck	C6164	Disolvente utilizado para preparar soluciones para el material de medicamentos y el control de vehículos
Eagle Medium modificado de Dulbecco/F-12 de Ham	Thermo Fisher Scientific	12634028	DMEM/F-12 avanzado
E7080 (Lenvatinib)	Selleck	S1164	Inhibidor de tirosina quinasa utilizado para el tratamiento de organoides y perturbaciones terapéuticas
Valor del suero bovino fetal FBS	Gibco	A5256701
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Kit de tinción de hematoxilina y eosina	Beyotime	C0105S
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Microscopio motorizado de fluorescencia Leica DM6 B	Leica	N/A
Suplemento N2 (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetilcisteína	Merck	A0737-5MG
Nicotinamida	Merck	N0636
Tubos centrífugos cónicos estériles de polipropileno Nunc 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339651
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Solución salina tamponada con fosfato	GENOM BIO	GNM20012	Tampón utilizado para lavar organoides y preparar muestras para el procesamiento posterior
EGF humano recombinante	Peprotech	AF-100-15
FGF10 humano recombinante	Peprotech	100-26
HGF humano recombinante	Peprotech	100-39
Noggin humano recombinante	Peprotech	120-10C
Inhibidor de la rho quinasa Y-27632 dihidrocloruro	Merck	Y0503	Inhibidor de ROCK utilizado para mejorar la supervivencia de los organoides tras el descongelamiento o el paso
Medio condicionado por R-spodin1	(Broutier et al.)	N/A	Secreción de líneas celulares
Trypan Blue Stain, filtrado por membrana al 0,4% Preparado en solución salina al 0,85%	Gibco	15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), sin fenol rojo	Thermo Fisher Scientific	12604013	Sustituto de la tripsina
Medio acondicionado Wnt-3a	(Broutier et al.)	N/A	Secreción de líneas celulares