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Artículo de método

Generación y análisis transcriptómico unicelular de organoides de carcinoma hepatocelular tras el tratamiento con medicamentos

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DOI:

10.3791/70511

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26 de mayo de 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método simplificado para generar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamientos farmacológicos y realizar secuenciación de ARN unicelular antes y después del tratamiento para caracterizar los cambios transcripcionales asociados al tratamiento.

Resumen

El carcinoma hepatocelular es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial y se caracteriza por una marcada heterogeneidad intratumoral, que contribuye a respuestas variables al tratamiento, recurrencia tumoral y progresión de la enfermedad. Por tanto, es esencial comprender más profundamente cómo cambian las células tumorales a nivel transcripcional antes y después del tratamiento farmacológico para mejorar las estrategias terapéuticas. Sin embargo, los flujos de trabajo experimentales prácticos que conectan el tratamiento farmacológico basado en organoides con el perfilado transcriptómico de células individuales a continuación siguen siendo limitados. En este estudio, se desarrolla un flujo de trabajo estandarizado para generar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamientos farmacológicos definidos y realizar secuenciación de ARN unicelular en muestras recogidas antes y después del tratamiento. El protocolo incluye la reactivación y expansión de organoides, evaluación de calidad previa al tratamiento, exposición a fármacos, preparación de organoides para disociación unicelular, construcción de bibliotecas y análisis comparativo básico de datos transcriptómicos unicelulares. Se proporcionan precauciones técnicas críticas para mejorar la reproducibilidad y la calidad de la muestra. Este flujo de trabajo permite la caracterización paralela de la composición celular y los cambios transcripcionales asociados al tratamiento farmacológico en organoides de carcinoma hepatocelular. El protocolo es robusto, escalable y adaptable a diferentes sistemas organoides, proporcionando una plataforma práctica para investigar los cambios en la expresión génica asociada al tratamiento a resolución de una sola célula.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CCH) es el cáncer de hígado primario más común en adultos y una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en todoel mundo 1,2,3. Su bajo resultado clínico se debe a una heterogeneidad intratumoral significativa, lo que conduce a resistencia al tratamiento yrecurrencia 4. Un estudio reciente indica que la diversidad del desarrollo y la plasticidad del estado celular, impulsadas por programas transcripcionales clave como el eje FOXM1/CEBPB, contribuyen a la resistencia terapéutica enHCC 5. Estos hallazgos ponen de manifiesto la necesidad de comprender cómo se adaptan y transitan las poblaciones de células tumorales entre estados bajo presión sostenida del tratamiento. Sin embargo, la mayoría de los modelos preclínicos no capturan adecuadamente la naturaleza dinámica y continua de estas transiciones de estado asociadas al tratamiento, limitando la investigación mecanicista de la adaptación tumoral y el fracaso terapéutico.

Los organoides derivados del paciente (PDOs) proporcionan una plataforma útil para este propósito porque preservan alteraciones genómicas importantes y la heterogeneidad celular del tumororiginal 6. Los organoides del CHC pueden mantenerse en cultivo a largo plazo mientras conservan características clave deltejido 7, lo que los hace especialmente adecuados para estudios de respuesta al tratamiento. Además, estudios basados en organoides han demostrado la viabilidad de utilizar organoides de cáncer de hígado para pruebas de fármacos y para captar diferencias interpacientes e intratumorales en la sensibilidad terapéutica, apoyando su valor como modelos preclínicos para la investigacióntratamiento-respuesta 8,9. Sin embargo, la mayoría de los estudios con fármacos basados en organoides siguen basándose principalmente en mediciones de viabilidad de los puntos finales o se centran principalmente en respuestas fenotípicas masivas, proporcionando así información limitada sobre respuestas celulares heterogéneas y cambios transcripcionales asociados al tratamiento. Paralelamente, el rápido desarrollo de estrategias terapéuticas basadas en ARN para el HCC subraya aún más la necesidad de sistemas preclínicos capaces de predecir y diseccionar mecánicamente con precisión las respuestas terapéuticas a resoluciónunicelular 10.

La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permite la caracterización de alta resolución de la composición celular y los estados transcripcionales dentro de los modelosorganoides 11. Cuando se aplica a organoides recogidos antes y después del tratamiento, el scRNA-seq puede revelar cambios en la expresión génica, cambios en poblaciones celulares y respuestas heterogéneas que no se capturan mediante ensayos masivos. Por tanto, este enfoque representa una estrategia práctica y poderosa para investigar la remodelación transcripcional asociada al tratamiento en organoides de HCC. Sin embargo, sigue faltando un flujo de trabajo práctico y reproducible que integre el cultivo de organoides de HCC, el tratamiento farmacológico y la secuenciación de ARN unicelular antes y después del tratamiento. Este flujo de trabajo es más eficaz cuando se mantiene la integridad organoide durante la exposición a fármacos y se recuperan suficientes células viables para el perfilado posterior de células individuales. Como ocurre con otros enfoques basados en organoides, las limitaciones importantes incluyen la representación incompleta de los componentes estromales, vasculares e inmunitarios del microambiente tumoral, así como un posible sesgo de selección durante el cultivo in vitro prolongado.

Se describe un flujo de trabajo experimental integrado para generar organoides de HCC, aplicar tratamientos farmacológicos definidos y procesar muestras de organoides para la secuenciación de ARN unicelular antes y después del tratamiento. Este flujo de trabajo abarca la recuperación y expansión de organoides, evaluación de calidad previa al tratamiento, exposición controlada a fármacos y secuenciación posterior de ARN unicelular de muestras emparejadas. El enfoque proporciona un marco práctico para comparar, a resolución de una sola célula, los cambios asociados al tratamiento en la composición celular y los programas de expresión génica en organoides de HCC.

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Protocolo

Los estudios con tejidos humanos fueron revisados y aprobados por los Comités de Revisión Ética de la Investigación de la Universidad Médica de Guangzhou (nº de aprobación). GYZL-2024-KY31). Todos los procedimientos que involucraron especímenes humanos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para la investigación en humanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes para el uso de sus muestras clínicas en la investigación médica. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

Este flujo de trabajo incluye la recuperación y expansión de organoides de carcinoma hepatocelular criopreservado, con adaptaciones menores para perturbaciones terapéuticas posteriores y secuenciación de ARN unicelular. El objetivo es generar cultivos organoides de calidad y consistencia suficientes para los experimentos posteriores de tratamientofarmacológico 12.

1. Establecimiento y expansión de organoides derivados de pacientes con HCC

  1. Descongelación y recuperación de organoides criopreservados
    1. Preparación antes de descongelar
      1. Calienta previamente un baño María a 37 °C. Preequilibra una placa de 24 pozos en una incubadora a 37 °C durante al menos 1 hora antes de la placa.
      2. Prepara con antelación un medio de cultivo organoide completo y mantén el extracto de membrana basal (BME) sobre hielo hasta su uso. La composición del medio completo de cultivo de organoides se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.
    2. Descongelación de organoides
      1. Retira los crioviales que contienen organoides HCC congelados del almacenamiento de nitrógeno líquido y colócalos inmediatamente en un baño maria a 37 °C.
      2. Agita suavemente el frasco y deja de descongelarlo cuando solo quede un pequeño cristal de hielo.
    3. Eliminación del crioprotector
      1. Pipeta suavemente la suspensión descongelada una vez para volver a suspender el contenido.
      2. Transfiere la suspensión a un tubo cónico de 15 mL que contiene entre 3 y 5 mL de medio de cultivo organoide completo.
      3. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante sin alterar el pellet.
  2. Incrustación y replacaje de organoides
    1. Preparación de la mezcla de recuperación
      1. Suspende el pellet de organoides en un medio completo de cultivo organoide. La composición del medio completo de cultivo de organoides se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.
      2. Mezcla suavemente con un volumen igual de BME bien frío para obtener la mezcla de emplatado.
        NOTA: Mantenga la mezcla sobre hielo para evitar una polimerización prematura.
    2. Placas de cúpulas organoides
      1. Dispensar 50 μL de la mezcla organoide-matriz en cada pozo de una placa precalentada de 24 pozos.
      2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos para permitir la solidificación de la matriz.
      3. Añadir 500 μL de medio completo de cultivo organoide suplementado con 20 μM Y-27632 a cada pozo a lo largo de la pared del pozo.
        NOTA: Limita el uso de Y-27632 a los primeros 2–3 días después del descongelamiento o el paso. Asegúrate de que cada cúpula permanezca compacta y fija al fondo del pozo, sin expandirse hacia fuera.
  3. Cultura organoide y expansión
    1. Condiciones del cultivo de recuperación
      1. Mantener los organoides a 37 °C con un 5% deCO2.
      2. Utiliza un medio que contenga 20 μM Y-27632 durante los primeros 2–3 días tras el descongelamiento.
    2. Reemplazo de medio
      1. Cambia el sustrato de cultivo cada 3–4 días con aspiración suave.
      2. Añade un medio fresco a lo largo de la pared de cada pozo para evitar alterar las cúpulas de la matriz.
      3. Mantener el mismo calendario de reemplazo de medios en todos los pozos dentro del mismo experimento.
    3. Monitorización del crecimiento
      1. Monitoriza la recuperación y expansión de los organoides usando un microscopio de campo claro con ajustes de imagen consistentes.
      2. Grabar imágenes representativas en momentos de tiempo definidos durante la recuperación y expansión.
      3. Confirmar la recuperación exitosa cuando la mayoría de las estructuras permanecen intactas, los organoides presentan morfología redonda a ovalada con bordes suaves, se observa un aumento progresivo a lo largo del tiempo y hay escombros mínimos o estructuras colapsadas.
      4. Excluir pozos que contengan menos de 10 organoides intactos del análisis cuantitativo aguas abajo.
    4. Criterios de aprobación y expansión
      1. Se observan organoides de paso tras una expansión estable.
      2. Confirmar la expansión estable mediante aumentos reproducibles en el tamaño del organoide o el área total con morfología preservada.
      3. Utiliza criterios consistentes de intervalo de imagen, aumento e inclusión entre experimentos.
      4. Generar curvas de crecimiento representativas basadas en el área del organoide o en los conteos para confirmar la estabilidad.
    5. Criterios para experimentos posteriores
      1. Utilizan líneas organoides que exhiben un crecimiento tridimensional estable, que no presenten contaminación ni colapso extenso, y que proporcionen un rendimiento suficiente para condiciones experimentales paralelas.
      2. Mantener los cultivos durante al menos 7–10 días después del descongelamiento o hasta que la recuperación y un ciclo de expansión completen.
      3. Solo avanzar líneas organoides que muestran morfología consistente entre pozos replicados.

2. Preparación de organoides para perturbaciones terapéuticas

  1. Evaluación de calidad previa al tratamiento
    1. Evaluación basada en morfología
      1. Confirma que los organoides son redondos a ovalados en morfología.
      2. Confirma que los organoides muestran bordes suaves y bien definidos.
      3. Confirma que hay restos celulares mínimos dentro de la cúpula.
      4. Excluye cultivos con fragmentación extensa, lúmenes oscurecidos, colapso generalizado o contaminación evidente.
    2. Evaluación del estado de expansión
      1. Utiliza solo cultivos organoides que hayan completado la recuperación y entrado en una expansión estable.
      2. Confirma el aumento progresivo a lo largo del tiempo.
      3. Confirma la morfología consistente entre pozos replicados.
  2. Replacado de organoides para tratamiento farmacológico
    1. Recuperación de organoides a partir de la matriz
      1. Disolver las cúpulas organoides sobre hielo usando 1 mL de solución de recuperación de células heladas por pozo durante 15–20 minutos.
      2. Pipetea suavemente cada 5 minutos durante la incubación.
      3. Centrifugar la suspensión recuperada a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      4. Resuspende el pellet en medio de cultivo organoide completo.
    2. Estandarización antes de volver a plantar
      1. Estandariza la carga organoide inicial entre pozos antes del tratamiento farmacológico.
      2. Determinar el número celular viable tras la disociación parcial cuando sea posible.
      3. Normaliza las muestras al mismo número de celdas de entrada por pozo.
      4. Placan aproximadamente entre 1.000 y 5.000 celdas viables por pozo en un formato de 24 pozos.
      5. Si no se realiza el recuento celular directo, normaliza asegurando un número comparable de organoides morfológicamente intactos por pozo y una distribución de tamaño similar entre grupos.
      6. Registrar el número inicial de organoides y la morfología de referencia para cada uno mucho antes del tratamiento.
      7. Utiliza criterios de inclusión y estrategia de chapado idénticos en todos los pozos dentro del mismo experimento.
    3. Replacaje para tratamiento farmacológico
      1. Mezclar organoides recuperados con matriz de membrana basal helada a una concentración final del 30%–50%.
      2. Dispensar cúpulas de 50 μL en cada pozo de una placa de 24 pozos.
      3. Incubar a 37 °C durante 30 minutos para permitir la polimerización.
      4. Añade 500 μL de cultivo organoide completo por pozo a lo largo de la pared del pozo.
        NOTA: Asegúrese de que cada cúpula permanezca compacta y fija al fondo del pozo, sin extenderse hacia fuera. Utiliza el mismo volumen de cúpula y concentración de matriz en todos los pozos dentro del mismo experimento.
  3. Recuperación antes del tratamiento farmacológico
    1. Recuperación tras el re-chapado
      1. Permitir que los organoides se recuperen durante la noche bajo condiciones estándar de cultivo.
      2. Inicia el tratamiento solo después de que la morfología intacta se restablezca dentro de las cúpulas replacadas.
    2. Criterios de entrada para el tratamiento de drogas
      1. Inicia el tratamiento farmacológico solo cuando los organoides permanezcan intactos tras el replacaje, no haya colapso generalizado ni residuos excesivos, y la carga organoide sea comparable entre pozos.
      2. Registrar imágenes de campo claro de referencia para todos los grupos experimentales antes del tratamiento.
      3. Mantener la misma carga organoide inicial, tiempo de recuperación tras la reposición y tiempo de inicio del tratamiento en todos los pozos de control y tratados.
  4. Consideraciones de seguridad
    1. Realizar todos los procedimientos que involucren organoides de origen humano utilizando el equipo de protección individual adecuado y prácticas de bioseguridad.
    2. Maneja cuidadosamente los reactivos enzimáticos de disociación para evitar la exposición de la piel o los ojos.
    3. Eliminar los residuos biológicos líquidos y sólidos conforme a las normativas de bioseguridad institucional.

3. Tratamiento farmacológico de organoides de HCC

  1. Preparación y tratamiento de medicamentos
    1. Preparación de fármacos
      1. Prepara la solución de stock de lenvatinib en DMSO según las instrucciones del fabricante.
      2. Diluir la solución principal en un medio de cultivo precalentado inmediatamente antes de usarla hasta alcanzar la concentración de trabajo predefinida.
      3. Mantener la misma concentración final de DMSO en todos los pozos (≤ 0,1%).
      4. Prepara suficiente volumen para asegurar el mismo volumen de tratamiento final en cada pozo.
    2. Tratamiento de drogas
      1. Añade un medio que contiene lenvatinib (20 μM) a lo largo de la pared de cada pozo para evitar alterar las cúpulas matriciales.
      2. Incluye un control del vehículo con la misma concentración final de DMSO.
      3. Incubar organoides bajo condiciones estándar de cultivo durante el periodo de tratamiento predefinido.
      4. Sustituir el medio que contenga fármacos cada 48–72 horas para duraciones de tratamiento superiores a 72 horas.
      5. Utiliza el mismo esquema de reemplazo de medio en todos los pozos dentro del experimento.
      6. Graba imágenes basales en campo claro antes del tratamiento.
      7. Adquirir imágenes a intervalos fijos durante el tratamiento utilizando los mismos ajustes de microscopio, aumento y posiciones de campo.
  2. Evaluación de la respuesta al tratamiento
    1. Evaluación basada en morfología
      1. Evalúa la respuesta al tratamiento utilizando las siguientes lecturas basadas en imágenes: curva de crecimiento del área organoide, diámetro medio del organoide y recuento de organoides supervivientes.
      2. Utiliza los mismos ajustes de exposición, ampliación y umbrales de análisis para todas las imágenes.
      3. Mide la curva de crecimiento del área organoide calculando el área total de organoides por pozo o campo en cada momento y normalizando hasta la línea base.
      4. Mide el diámetro medio del organoide determinando el diámetro de organoides intactos individuales y calculando el valor medio por pozo.
      5. Determinar el recuento de organoides supervivientes contando organoides intactos identificables morfológicamente y excluyendo escombros y fragmentos colapsados.
    2. Medición opcional de la viabilidad
      1. Realizar un ensayo tridimensional de viabilidad de luminiscencia en el punto final del tratamiento si se requiere una evaluación adicional de viabilidad masiva.
      2. Sigue las instrucciones del fabricante para la ejecución del ensayo.
  3. Análisis de datos
    1. Grafica las curvas de crecimiento del área organoide a lo largo del tiempo.
    2. Comparar el diámetro medio de organoides entre grupos tratados con vehículos y tratados con lenvatinib.
    3. Compara los recuentos de organoides supervivientes entre grupos de tratamiento.
    4. Aplicar programas idénticos de adquisición de imágenes, criterios de inclusión de organoides y parámetros de análisis en todos los grupos para garantizar la reproducibilidad.

4. Preparación de organoides para la secuenciación de ARN unicelular

  1. Selección y recuperación de organoides
    1. Evaluación previa a la disociación
      1. Pozos organoides seleccionados que presentan una morfología tridimensional intacta sin un colapso generalizado, contienen suficiente material para la captura de células individuales aguas abajo y no presentan contaminación evidente.
      2. Recoger organoides en puntos experimentales coincidentes entre muestras de control y tratadas.
      3. Mantener la misma densidad de placa, calendario de tratamiento y condiciones de reemplazo de medios idénticos entre las muestras.
      4. Graba imágenes en campo claro de cada una seleccionada mucho antes de la disociación utilizando los mismos ajustes de microscopio, aumento y criterios de selección de campo.
    2. Eliminación de la matriz
      1. Aspira completamente el medio de cultivo de cada pozo.
      2. Lava cada pozo dos veces con PBS bien frío para eliminar el medio residual y los restos.
      3. Añade 1 mL de solución de recuperación de celdas heladas a cada pozo.
      4. Incuba sobre hielo durante 20–30 minutos.
      5. Pipetear suavemente cada 5–7 minutos durante la incubación para facilitar la disolución de la matriz.
      6. Transfiere material disuelto a tubos preenfriados utilizando una punta de pipeta de gran calibre o cortada para minimizar la tensión cortante.
      7. Procede a la disociación enzimática solo después de que la matriz esté en gran parte disuelta y quede un residuo de gel visible mínimo.
  2. Disociación enzimática y preparación de suspensión unicelular
    1. Disociación enzimática
      1. Centrifugar la suspensión organoide recuperada a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      2. Retira el sobrenadante con cuidado sin mover la bola.
      3. Resuspende el pellet en 1 mL de enzima de disociación celular recombinante.
      4. Incubar a 37 °C durante 5–10 minutos.
      5. Pipetea suavemente 8–10 veces cada 2–3 minutos usando una punta de gran diámetro P1000 para promover la disociación.
      6. Detener la digestión cuando la mayoría de los fragmentos organoides se han dispersado en células individuales y solo quedan pequeños racimos residuales.
      7. Evitar la digestión prolongada para evitar la reducción de la viabilidad celular, artefactos transcripcionales asociados al estrés y un aumento de la contaminación por ARN ambiental.
    2. Temple y filtración
      1. Añade 4 mL de PBS bien frío que contiene un 2% de suero fetal bovino para detener la digestión.
      2. Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 40 μm.
      3. Lava una vez con PBS para eliminar enzimas residuales, agregados y restos.
      4. Realizar lisis de glóbulos rojos si hay contaminación por eritrocitos, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Preparación de las células y control de calidad
      1. Cuenta las células usando la exclusión de azul de tripán.
      2. Determinar la viabilidad de las celdas antes de preparar la biblioteca.
      3. Usa solo muestras con viabilidad ≥ 85%.
      4. Ajusta la concentración final de la celda a 700–1.200 celdas/μL.
      5. Excluye muestras con escombros excesivos, abundantes células muertas, grandes agregados visibles o disociación incompleta.
      6. Repite la filtración antes de cargar si hay agregados presentes.
      7. Control de procesos y muestras tratadas bajo condiciones idénticas, incluyendo la enzima de disociación, tiempo de digestión, frecuencia de pipeteo, método de filtración, concentración celular y estrategia de carga.
  3. Preparación y secuenciación de bibliotecas de una sola célula
    1. Captura de célula única y preparación de bibliotecas
      1. Carga la suspensión de celda única preparada en una plataforma de captura de celda única basada en gotas según las instrucciones del fabricante.
      2. Realizar transcripción inversa, amplificación de ADNc y construcción de bibliotecas utilizando el flujo de trabajo correspondiente de célula única 3′.
    2. Parámetros de secuenciación
      1. Bibliotecas de secuencias a una profundidad de al menos 50.000 lecturas por celda.
      2. Células de carga para lograr una recuperación de aproximadamente 6.000–10.000 celdas por biblioteca.
      3. Graba la química de secuenciación, la estructura de lectura y los ajustes del instrumento.
  4. Criterios de calidad para el análisis aguas abajo
    1. Asegúrate de que la preparación final tenga alta viabilidad celular, mínimo residuo y baja carga agregada.
    2. Confirmar la idoneidad para el análisis transcriptómico de célula única aguas abajo de la heterogeneidad celular y las transiciones de estado celular.

5. Procesamiento básico y control de calidad de los datos de secuenciación de ARN de célula única

  1. Procesamiento primario
    1. Generación de la matriz de recuento
      1. Procesa los datos de secuenciación en bruto usando la tubería recomendada para la plataforma seleccionada.
      2. Genera una matriz de recuento gene por célula.
      3. Grabar la versión del software, construir el genoma de referencia y liberar la anotación de transcripciones.
    2. Evaluación inicial de la calidad a nivel de biblioteca
      1. Resume las métricas de secuenciación para cada biblioteca, incluyendo lecturas totales, número estimado de células recuperadas, genes medianos por célula, UMIs medianas por celda y saturación de secuenciación (si procede).
      2. Utiliza ajustes idénticos de genoma de referencia y anotación en todas las muestras.
  2. Control de calidad a nivel de celda
    1. Filtrado de celdas de baja calidad
      1. Evalúa para cada célula el número de genes detectados, el recuento total de UMI, la proporción de transcritos mitocondriales y la evidencia de dobletes o multipletes.
      2. Excluye células con recuentos génicos extremadamente bajos, recuentos extremadamente bajos de UMI o fracciones anormalmente altas de transcripción mitocondrial.
      3. Define umbrales de filtrado basados en la distribución del conjunto de datos.
      4. Aplica umbrales idénticos en los grupos de tratamiento emparejados.
    2. Eliminación de los probables dobletes
      1. Identificar dobletes probables utilizando un método computacional adecuado.
      2. Elimina dobletes usando un flujo de trabajo de detección compatible con la plataforma.
      3. Aplica la misma estrategia de detección de dobles en todas las muestras.
  3. Normalización, agrupamiento y anotación
    1. Normalización de datos
      1. Normalizar la matriz de recuento filtrada utilizando un flujo de trabajo estándar de RNA-seq de célula única.
      2. Aplicar procedimientos de normalización idénticos en todas las muestras.
    2. Reducción de dimensionalidad y agrupamiento
      1. Realiza reducción de dimensionalidad.
      2. Realizar agrupamientos no supervisados para identificar las principales poblaciones transcripcionales.
      3. Visualiza los estados de las células usando un método de incrustación de baja dimensión como UMAP.
    3. Identificación de genes marcadores
      1. Identificar genes marcadores mediante análisis de expresión diferencial entre grupos.
      2. Asignar interpretación biológica a los principales estados celulares epiteliales en función de la expresión de marcadores.
  4. Análisis comparativo de las condiciones de tratamiento
    1. Integración de metadatos
      1. Anota cada célula con la condición de tratamiento, la línea organoide derivada del paciente y el lote de procesamiento.
      2. Mantener una estructura de metadatos consistente en todas las muestras.
    2. Análisis de los cambios asociados al tratamiento
      1. Compara muestras control y tratadas.
      2. Identificar la remodelación transcripcional asociada al tratamiento.
      3. Identificar cambios en la composición de estado de la célula.
      4. Identificar poblaciones celulares candidatas asociadas a la adaptación terapéutica.
      5. Interpreta los resultados junto con lecturas basadas en morfología y viabilidad.
  5. Salida del análisis de datos
    1. Genera una matriz de recuento gene por célula controlada por calidad.
    2. Generar visualizaciones de baja dimensión de poblaciones transcripcionalmente distintas.
    3. Identificar genes marcadores para los principales grupos.
    4. Mantener la consistencia entre todas las muestras del genoma de referencia, el flujo de preprocesamiento, los criterios de filtrado, la estrategia de agrupamiento y los criterios de anotación.
    5. Documenta cualquier desviación específica de la muestra respecto al flujo de trabajo estándar.

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Resultados

La Figura 1 describe la generación y caracterización de organoides del carcinoma hepatocelular (HCC). En la Figura 1A, se utilizaron tejidos tumorales derivados del paciente para establecer cultivos organoides para análisis histológicos y estudios de tratamiento. La Figura 1B muestra imágenes de campo claro de organoides en los días 1 y 6 tras la recuperación, demostrando supervivencia y expansión b...

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Discusión

Para garantizar la reproducibilidad, la eficiencia y un análisis transcriptómico de célula única de alta calidad, varios pasos técnicos en este flujo de trabajo requieren un control cuidadoso. La consistencia durante la reactivación y expansión de organoides HCC derivados del paciente es esencial, ya que las variaciones en la densidad de siembra, la composición de la matriz de membrana basal y el momento del cultivo pueden influir en la morfología, el crecimiento y las respuestas posteri...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (2023A1515011416) y la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangzhou (2024A04J6575). Algunos elementos esquemáticos fueron creados usando Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) y fueron adaptados por los autores. Las ilustraciones esquemáticas se crearon usando Figdraw (https://www.figdraw.com) y fueron adaptadas por los autores.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[Leu15]-gastrina I humanaMerckG9145
Microtubos de 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
1X Buffer de Lisis de los Glóbulos RojosThermo Fisher Scientific00-4333-57
Vials criogénicos de hilo interno de 2,0 mlNest607001
A8301 (inhibidor de TGFb)Tocris Bioscience2939
Anticuerpo policlonal AFPProteintech14550-1-AP
Anticuerpo antialbúmina [ALB/2144]ABCAMab236492
Anticuerpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grado ChIPABCAMab181604
Anticuerpo anti-prealbúmina [EPR3219]ABCAMab92469
Anticuerpo anti-SOX9 [EPR14335-78]ABCAMab185966
Suplemento de B27 (503), sin vitamina AThermo Fisher Scientific12587010
Solución de recuperación celular, 100 mLCorning354253Reactivo utilizado para disolver la matriz de membrana basal y recuperar organoides antes de volver a plantar o procesar aguas abajo
CellTiter-Glo®   Ensayo de Viabilidad de Células 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca y Kit de cuentas de gel v3.1Genómica 10xCG000227
Colador de células de Corning, 40 y mu; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Placas de acoplamiento múltiple de varios pozos transparentes de 24 pozos transparentes de fondo plano, ultra-bajo, envueltas individualmente, estérilesCorning3473
Cultrex Reducción del Factor de Crecimiento BME, PathClear tipo 2 (BME)Merck3533-005-02Matriz extracelular utilizada para apoyar el cultivo de organoides tridimensionales y la formación de cúpulas
DMSOMerckC6164Disolvente utilizado para preparar soluciones para el material de medicamentos y el control de vehículos
Eagle Medium modificado de Dulbecco/F-12 de HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 avanzado
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inhibidor de tirosina quinasa utilizado para el tratamiento de organoides y perturbaciones terapéuticas
Valor del suero bovino fetal FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscopio motorizado de fluorescencia Leica DM6 BLeicaN/A
Suplemento N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetilcisteínaMerckA0737-5MG
NicotinamidaMerckN0636
Tubos centrífugos cónicos estériles de polipropileno Nunc 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Solución salina tamponada con fosfatoGENOM BIOGNM20012Tampón utilizado para lavar organoides y preparar muestras para el procesamiento posterior
EGF humano recombinantePeprotechAF-100-15
FGF10 humano recombinantePeprotech100-26
HGF humano recombinantePeprotech100-39
Noggin humano recombinantePeprotech120-10C
Inhibidor de la rho quinasa Y-27632 dihidrocloruroMerckY0503Inhibidor de ROCK utilizado para mejorar la supervivencia de los organoides tras el descongelamiento o el paso
Medio condicionado por R-spodin1(Broutier et al.)N/ASecreción de líneas celulares
Trypan Blue Stain, filtrado por membrana al 0,4% Preparado en solución salina al 0,85%Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), sin fenol rojoThermo Fisher Scientific12604013Sustituto de la tripsina
Medio acondicionado Wnt-3a(Broutier et al.)N/ASecreción de líneas celulares

Referencias

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