Aislamiento y caracterización de pequeñas vesículas extracelulares de almohadillas grasas infrapatellanas en pacientes con osteoartritis

Summary

RESUMEN: Este protocolo presenta un flujo de trabajo estandarizado para aislar y caracterizar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) de tejidos de la almohadilla grasa infrapatelara de pacientes con osteoartritis.

Abstract

Las vesículas extracelulares (EV), especialmente las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) definidas como vesículas menores de 200 nm, actúan como mediadores esenciales de la comunicación intercelular y son liberadas por casi todos los tipos celulares en diversos fluidos biológicos. La almohadilla grasa infrapatelariana (IPFP) está estrechamente asociada con el desarrollo y progresión de la osteoartritis de rodilla (OA). Sin embargo, los métodos estandarizados para aislar los sEVs directamente de los explantes de IPFP siguen siendo limitados. Presentamos un protocolo reproducible para el aislamiento y caracterización de sEVs derivados de tejidos IPFP obtenidos de pacientes con OA. El medio acondicionado recogido de cultivos de tejido IPFP se elimina secuencialmente de células y residuos mediante centrifugación a baja velocidad, seguida de ultracentrifugación para enriquecer vesículas dentro del rango de tamaño sEV. Las vesículas resultantes se caracterizan según información mínima para estudios de recomendaciones de vesículas extracelulares (MISEV2023) utilizando un conjunto de marcadores proteicos representativos en distintas categorías funcionales: CD63 como tetraspanina asociada a membrana, ALIX y TSG101 como proteínas citosólicas implicadas en la biogénesis mediada por la maquinaria del Complejo de Clasificación Endosomal Requirido para el Transporte (ESCRT), y Calnexina como proteína residente en el retículo endoplásmico para monitorizar el potencial contaminación no vesicular. Este flujo de trabajo da lugar a preparaciones de sEV bien definidas, adecuadas para aplicaciones posteriores como ensayos funcionales o perfiles proteómicos en la investigación de la osteoartritis.

Introduction

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) son un subtipo heterogéneo de vesículas extracelulares que, según la clasificación operativa propuesta por la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) en la información mínima para estudios de guías de vesículas extracelulares (MISEV2023), se definen como vesículas típicamente menores de 200 nm de diámetro¹. Los sEVs son liberados por prácticamente todos los tipos celulares en fluidos biológicos y han atraído cada vez más atención debido a su papel esencial como mediadores de la comunicación intercelular tanto en contextos fisiológicos como^{patológicos 2,3}.

La membrana de las sEVs está enriquecida con múltiples proteínas funcionales. Entre ellas, tetraspaninas como CD63 están asociadas con la organización y fusión de la membrana^{vesicular 4}. Además, las proteínas citosólicas asociadas al complejo de clasificación endosómica necesario para el transporte (ESCRT), como ALIX y TSG101, son fundamentales para la biogénesis y secreción de sEV. En consecuencia, sirven como marcadores fiables para confirmar el origen endosomal de las vesículas^{aisladas 5,6}.

Se ha reconocido que la almohadilla grasa infrapatelara (IPFP) es un tejido activo asociado a las articulaciones, estrechamente vinculado al inicio y progresión de la osteoartritis (OA^)7,8. En condiciones inflamatorias y degenerativas, se hipotetiza que los sEVs derivados de IPFP transportan mediadores inflamatorios y señales patógenas, contribuyendo así a la inflamación sinovial y a la degradación del^{cartílago 9}. Por tanto, caracterizar los sEVs liberados por tejidos IPFP de pacientes con OA puede, por tanto, proporcionar información crítica sobre las redes de comunicación intercelular asociadas a la enfermedad.

Dado el creciente interés por los sEVs como mediadores moleculares y potenciales agentes terapéuticos, es esencial establecer un enfoque de aislamiento de alto rendimiento, alta pureza y reproducible. Aunque la ultracentrifugación diferencial sigue siendo una de las estrategias de purificación más utilizadas¹⁰, los protocolos optimizados para supernadantes o biofluidos de cultivo celular pueden no ser directamente aplicables a tejidos sólidos derivados del adiposo como el IPFP. El alto contenido lipídico, la matriz extracelular densa y las condiciones digestivas enzimáticas variables pueden influir en la recuperación y pureza de las vesículas.

El cultivo de explantación tisular proporciona un enfoque fisiológicamente relevante que preserva la arquitectura celular nativa y las interacciones célula-célula, minimizando la alteración enzimática excesiva, permitiendo así la recogida de sEVs liberados bajo condiciones cercanas a las nativas. Sin embargo, actualmente falta un flujo de trabajo estandarizado específicamente diseñado para aislar los sEVs de cultivos explantados IPFP.

Aquí describimos un protocolo paso a paso para aislar y caracterizar pequeñas vesículas extracelulares a partir de cultivos de explantación de almohadillas grasas infrapatelares de pacientes con osteoartritis mediante ultracentrifugación diferencial, proporcionando un marco metodológico reproducible para estudios funcionales y traslacionales posteriores.

Protocol

El uso de tejidos IPFP de pacientes con osteoartritis en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital de la Universidad Médica de Hebei (Aprobación: nº [2024] 018). La recogida de muestras se realizó dentro del periodo aprobado y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la adquisición de tejido.

1. Preparación del medio y las soluciones

1. Prepare 500 mL de medio completo DMEM/F12 agotado en exosomas mezclando 445 mL de medio basal DMEM/F12, 50 mL de suero bovino fetal libre de exosomas (10%) y 5 mL de penicilina/estreptomicina/anfotericina B (100 U/mL, 100 μg/mL y 0,25 μg/mL, respectivamente). Esteriliza con filtro a través de un filtro de 0,22 μm.
2. Prepara el tampón de corrido western blot mezclando 950 mL de agua destilada (_{dH 2}O) con 50 mL de tampón de movimiento 20x (Tris/MOPS/SDS).
3. Prepara el buffer de transferencia western blot mezclando 800 mL de_{dH 2O}con 100 mL de buffer de transferencia 10x y 100 mL de etanol absoluto.
   NOTA: Este buffer de transferencia rápida ha sido optimizado específicamente para transferencia húmeda de alta corriente (400 mA) a temperatura ambiente. Debido a su baja generación de calor, no se requiere un baño de hielo para duraciones de transferencia inferiores a 45 minutos, lo que ha demostrado mantener una alta eficiencia de transferencia para proteínas dentro del rango de 10–250 kDa.
   PRECAUCIÓN: El etanol absoluto es inflamable. Maneja en un lugar bien ventilado y mantente alejado de fuentes de calor.
4. Prepara el tampón de lavado mezclando 50 mL de 20 cucharadas (200 mM Tris y 3 M NaCl a pH 7,5–7,6) y 2 mL Tween-20 con 950 mL de_{dH 2}O.
5. Preparar la solución de trabajo quimioluminiscente mezclando volúmenes iguales de solución de luminol/potenciador y tampón de peróxido (se necesitan aproximadamente 0,1 mL de solución de trabajo por centímetro cuadrado de membrana).
   PRECAUCIÓN: Los sustratos quimioluminiscentes pueden ser irritantes. Lleva guantes y protección ocular. Eliminar los residuos químicos según la normativa institucional local.

2. Preparación del tejido IPFP y recogida del medio acondicionado

1. Lava el tejido IPFP recién obtenido (aprox. 10 g) tres veces con 50 mL de PBS preenfriado por lavado, agitándolo suavemente manualmente en el tubo de la centrífuga para eliminar completamente la sangre residual.
2. Tritura el tejido IPFP en trozos de unos 2 mm x 2 mm x 2 mm usando tijeras estériles o un bisturí.
3. Transfiere fragmentos de tejido IPFP a frascos T175. Añade 50 mL de medio completo DMEM/F12 con exosomas. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 horas con agitación suave.
4. Recoge el medio completo DMEM/F12 (es decir, medio acondicionado) en tubos de 50 mL sobre hielo. Filtra a través de un colador de 70 μm para eliminar los restos de tejido.

3. Aislamiento de sEVs mediante ultracentrifugación diferencial

NOTA: Realiza todos los siguientes pasos a 4 °C o sobre hielo.

1. Centrifugación inicial a baja velocidad para eliminar residuos de tejido
   1. Centrifuga el medio acondicionado a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Recoge cuidadosamente el sobrenadante y transfiere a nuevos tubos centrifugadores de 50 mL.
   2. Centrifuga el sobrenadante a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Recoge el sobrenadante y transfiere a tubos nuevos, asegurándote de que el pellet no se altere.
2. Centrifugación y filtración intermedias.
   1. Centrifuga el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C.
   2. Recoge el sobrenadante y filúralo a través de un filtro de vacío de 0,22 μm para eliminar vesículas y contaminantes más grandes.
3. Primera ultracentrifugación: pelleteo de sEV.
   1. Transfiere el sobrenadante filtrado a tubos de centrífuga de policarbonato de 40 mL.
   2. Ultracentrifugar las muestras a 110.000 x g durante 70 minutos a 4 °C usando un rotor de ángulo fijo (factor k = 70). Retira cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta.
   3. Resuspende el pellet en 10 mL de PBS estéril y preenfriado. Filtrar la solución resuspendida mediante un filtro de jeringuilla de 0,22 μm para asegurar la eliminación de cualquier agregado restante.
4. Segunda ultracentrifugación: purificación de sEV
   1. Ultracentrifugar la suspensión de nuevo a 110.000 x g durante 70 minutos a 4 °C usando el rotor de ángulo fijo (factor k = 70).
   2. Descarta cuidadosamente el sobrenadante, dejando el perdigón de sEV en el fondo del tubo. Resuspende el último pellet de sEV en 200 μL de PBS estéril.
   3. Dividir la suspensión del sEV en alicuotas de 20 μL para evitar daños por ciclos repetidos de congelación y descongelación. Guarda las alicuotas a -80 °C para uso prolongado.

4. Caracterización de los sEVs mediante análisis de western blot

1. Prepara las muestras de proteína del sEV.
   1. Mezcla el pellet de sEV (del paso 3.5.2) con 80–120 μL de tampón de lisis RIPA suplementado con inhibidores de proteasa.
      NOTA: Busque una proporción de aproximadamente 1 μL de tampón RIPA por cada 0,5–1,0 μg de proteína estimada. Se recomienda una concentración final de proteína de al menos 1,0 μg/μL para asegurar una separación electroforética eficiente y una detección de señales de alta calidad durante el análisis de western blot.
      PRECAUCIÓN: El buffer RIPA contiene detergentes e irritantes. Utiliza equipo de protección personal.
   2. Haz un vórtice breve con la mezcla e incuba las muestras en hielo durante 15–30 minutos con un suave mecimiento.
      NOTA: Una mezcla exhaustiva en esta etapa es fundamental para la ruptura completa de la membrana y la liberación óptima de proteínas. Un vórtice insuficiente puede resultar en una lisis incompleta y concentraciones de proteínas inconsistentes entre réplicas.
   3. Centrifuga el lisado a 12.000–14.000 x g durante 10–15 minutos. Recoge cuidadosamente el sobrenadante.
   4. Determinar la concentración total de proteínas del lisato de sEV utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) de alta sensibilidad.
      NOTA: Se recomienda un ensayo BCA de alta sensibilidad frente al ensayo estándar para muestras de vesículas extracelulares debido a su rango de detección más bajo (0,5–20 μg/mL), lo que permite cuantificar con precisión las concentraciones típicamente bajas de proteínas obtenidas en preparaciones purificadas de sEV. Realiza el ensayo según el protocolo del kit.
2. Análisis de Western Blot.
   1. Mezcla las muestras de proteína con 5 buffers de carga de muestras SDS-PAGE.
      NOTA: Para la detección de CD63, prepare las muestras usando un buffer de carga 5x no reductor (sin β-mercaptoetanol) e incube a 70 °C durante 10 minutos. Estas condiciones preservan los epítopos conformacionales y evitan la agregación inducida por calor de esta proteína tetraspanina. Para otros marcadores, incluyendo ALIX (proteína X interactuante con ALG-2), TSG101 (gen de susceptibilidad tumoral 101) y Calnexina, prepara muestras utilizando un tampón reductor de carga 5x que contenga un 10% de β-mercaptoetanol y caliente a 95 °C durante 5 minutos para asegurar la desnaturalización completa de la proteína.
   2. Carga las muestras preparadas (normalmente 20–40 μg de proteína total) en un gel gradiente prefabricado (4%–12%).
   3. Carga el marcador de peso molecular de la proteína en el pozo asignado según las recomendaciones del fabricante.
   4. Haz pasar el gel en un buffer de funcionamiento a un voltaje constante de 100 V.
   5. Continúa la corrida durante 1–1,5 h, o hasta que el tinte de carga llegue al fondo del gel.
      NOTA: El tiempo de ejecución puede variar según el sistema de electroforesis y el porcentaje de gel.
   6. Transfiere las proteínas del gel a las membranas PVDF usando un sistema de transferencia húmeda a 400 mA durante 30 minutos.
      NOTA: La duración de la transferencia puede variar según la marca del buffer de transferencia utilizado.
   7. Bloquear las membranas en un tampón bloqueador libre de proteínas preparado en suero salino tri-buffer que contenga 0,2% Tween-20 (TBS-T) durante 30 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave. El tampón bloqueante se formula sin proteínas séricas, biotina ni proteínas fosforiladas para minimizar la unión inespecífica y la interferencia de fondo.
   8. Incubar la membrana con anticuerpos primarios específicos diluidos en un tampón de dilución de anticuerpos sin suero que contiene estabilizadores a base de proteínas y aditivos preservadores de anticuerpos a 4 °C durante la noche (12–16 h) con una agitación suave.
   9. Lava las membranas en un tampón de lavado (TBST con 0,2% Tween-20) bajo una agitación suave sobre un agitador.
   10. Incubar las membranas con los anticuerpos secundarios adecuados a temperatura ambiente durante 1 hora con una agitación suave.
   11. Lava de nuevo las membranas en el buffer de lavado bajo una agitación suave sobre un shaker.
   12. Visualiza las bandas proteicas usando sustrato quimioluminiscente.
       PRECAUCIÓN: Los sustratos quimioluminiscentes pueden irritar la piel y los ojos. Lleva guantes y gafas de seguridad adecuadas. Desechar el sustrato conforme a las directrices institucionales de residuos peligrosos.

5. Caracterización de los sEVs mediante Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA)

1. Enciende el analizador de seguimiento de nanopartículas y el módulo de bomba de jeringuillas según las instrucciones del fabricante, y deja que el sistema se equilibre al menos 30 minutos antes de la medición.
2. Descongela suavemente las muestras de EV sobre hielo y dilúyelas en solución fisiológica estéril y libre de partículas (PBS) para lograr una concentración óptima dentro del rango de medición recomendado (aproximadamente 1 x 10⁸ a 1 x^{10 9} partículas/mL).
3. Carga 1 mL de la muestra diluida en una jeringuilla estéril e inyecta lentamente la muestra en la cámara de medición, asegurando que no se introduzcan burbujas de aire.
4. Ajusta el nivel y el enfoque de la cámara para visualizar claramente partículas individuales que muestran movimiento browniano.
5. Graba tres vídeos de 60 s de duración para cada muestra bajo condiciones de flujo constante usando la bomba de jeringuilla para asegurar una distribución constante de partículas.
6. Analiza los vídeos grabados usando el software NTA con umbral de detección en 12, tamaño de desenfoque en Automático y distancia máxima de salto en Auto.
7. Genera perfiles de distribución y concentración del tamaño de las partículas utilizando la función de análisis automatizada del software.
8. Exporta los datos en bruto, los gráficos de distribución del tamaño de partículas y las mediciones de concentración para un análisis estadístico adicional.
9. Limpia la cámara de medición a fondo con agua estéril libre de partículas seguida de etanol al 70%, y vuelve a enjuagar con agua estéril sin partículas para evitar la contaminación cruzada entre muestras.

6. Caracterización de los sEVs mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

1. Utiliza rejillas de cobre de 200 mallas recubiertas con carbono. Realizar descarga luminosa en las rejillas durante 30 s utilizando un sistema de descarga luminosa, si está disponible.
2. Aplica 10 μL de la suspensión sEV (resuspendida en PBS estéril y filtrado) sobre la rejilla e incuba durante 2–5 minutos a temperatura ambiente.
3. Elimina el exceso de líquido tocando suavemente el borde de la rejilla con papel de filtro.
4. Lava la rejilla colocando secuencialmente la superficie cargada de muestra sobre tres gotas separadas de agua ultrapura.
5. Aplicar 10 μL de solución de ácido fosfotongstico al 2% (pH 7,0) sobre la rejilla e incubar durante 1–2 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El ácido fosfotungstico es un reactivo ácido corrosivo que puede causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias. Manejar conforme a las directrices de seguridad institucional mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y protección ocular. Elimina los residuos manchantes y materiales contaminados siguiendo los procedimientos aprobados para residuos químicos peligrosos.
6. Elimina el exceso de tinte con papel de filtro y deja que la rejilla se seque completamente al aire a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos.
7. Examina las rejillas usando un microscopio electrónico de transmisión operado a un voltaje acelerado de 80 kV.
8. Adquiere imágenes representativas con aumentos apropiados para evaluar la morfología de la vesícula.

Results

Se confirmó el aislamiento exitoso de pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) de tejidos de la almohadilla grasa infrapatelara humana (IPFP) mediante caracterización multimodal.

La microscopía electrónica de transmisión (MET) reveló que las vesículas aisladas presentaban la morfología característica en forma de copa con membranas bicapa lipídicas claramente definidas, consistente con las características estructurales de las sEVs (Figura 1)¹¹

Discussion

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo reproducible y práctico para aislar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) de tejidos de almohadillas grasas infrapatelares humanas (IPFP) mediante cultivo explantado seguido de ultracentrifugación diferencial. Las vesículas aisladas fueron validadas mediante métodos complementarios de caracterización, incluyendo microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y detección por Western blot de ma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos centrifugadores PET de 40 mL	Himaque (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Tereftalato de polietileno, 26 x 90 mm
70 y micro; Filtro de células m	Tecnología Lanjieke de Pekín	560049	Para la eliminación de residuos tisulares
Anticuerpo antiAlix	Shanghai Abways Biotechnology	CY7215	Marcador positivo de sEV
Anticuerpo antiCalnexina	Shanghai Abways Biotechnology	CY5839	Marcador negativo (contaminación por ER)
Anticuerpo antiCD63	Biociencias de Afinidad	DF2305	Marcador de tetraspanina
Anticuerpo anti-TSG101	Shanghai Abways Biotechnology	CY5985	Marcador positivo de sEV
Kit de ensayo de proteínas BCA	Shanghai YaMei Biotechnology	ZJ102	Para la cuantificación de proteínas
Matraz de cultivo celular (T175)	NEST Biotecnología	560229	Para el cultivo de explantación IPFP
Tubo centrífuga (50 mL)	BIOFIL	560041	Para los primeros pasos a baja velocidad
Suero fetal bovino empobrecido en exosomas	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Para cultivo de tejidos
HRP Cabra anti-Conejo IgG	Shanghai Abways Biotechnology	AB0101	Anticuerpo secundario para el albo blanco
Buffer de carga instantánea de proteínas (desnaturalizante, reductor, 5 veces)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT101	Para la desnaturalización de proteínas
Kit de ensayo de proteínas Micro BCA	Termo Científica	23235	Para la cuantificación de proteínas
Unidad de filtrado Millex-GP (0,22 y micro; m)	Tecnología Lanjieke de Pekín	560360	Estéril, para filtración de vesículas
Analizador de seguimiento de nanopartículas	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Para análisis de tamaño y concentración
Búfer de transferencia rápida sin hielo Omni-Flash	Shanghai YaMei Biotechnology	PS201S	Para transferencia de proteínas Western blot
Ácido fosfotungstico (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Para la tinción negativa TEM
Buffer de carga de proteínas (desnaturalizante, no reductor, 5 veces)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT103	Para la desnaturalización de proteínas
Buffer de bloqueo rápido libre de proteínas (5 veces)	Shanghai YaMei Biotechnology	PS108	Para bloquear las membranas
Búfer de lisis RIPA	Beijing Solarbio Ciencia y Tecnología Compañía Tecnológica, Ltd	R0010	Para la extracción de proteínas sEV
TBS (20 y más veces)	Beijing Solarbio Ciencia y Tecnología Compañía Tecnológica, Ltd	T1080	Para preparar el buffer de lavado
Microscopio Electrónico de Transmisión	Hitachi	HT7800	Para la caracterización morfológica
Buffer de electroforesis Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotechnology	PS120	Para la separación de proteínas
Preadolescente-20	Beijing Solarbio Ciencia y Tecnología Compañía Tecnológica, Ltd	T8220	Para preparar el buffer de lavado
Ultracentrífuga	Himaque (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Sistema de aislamiento de alta velocidad
Kit de detección quimioluminiscente ultrasensible	Shanghai YaMei Biotechnology	SQ201	Para la visualización de bandas de proteínas
Buffer universal de dilución de anticuerpos	Shanghai YaMei Biotechnology	PS119L	Para anticuerpos primarios/secundarios