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Elucidación de la base material de la fórmula de Yiqi Qingjie contra nefropatía por IgA utilizando UHPLC-Q-Orbitrap HRMS integrado con farmacología de redes

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DOI:

10.3791/70541

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19 de mayo de 2026

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el uso de cromatografía líquida de ultra-alto rendimiento combinada con espectrometría de masas híbrida cuadrupolo-Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), combinada con farmacología de redes y acoplamiento molecular, para predecir y validar la base material de la fórmula Yiqi Qingjie (YQQJ) para el tratamiento de la nefropatía por IgA (IgAN).

Resumen

Este estudio emplea el UHPLC-Q-Orbitrap HRMS para caracterizar los componentes extraíbles por agua y absorbidos por sangre del YQQJ. Se aplican además la farmacología de redes y el acoplamiento molecular para predecir y verificar la base material subyacente a los efectos terapéuticos de la YQQJ frente a la IgAN. El extracto acuoso y las muestras de suero de YQQJ se analizaron utilizando UHPLC-Q-Orbitrap HRMS para caracterizar los componentes químicos e identificar compuestos absorbidos por la sangre. La identificación de compuestos se realizó basándose en bases de datos de referencia, literatura publicada y una evaluación exhaustiva del tiempo de retención, la precisión de masa de iones precursores, los patrones de fragmentación MS/MS y la distribución isotópica. Los objetivos potenciales de los compuestos prototipo absorbidos por sangre se predijeron utilizando bases de datos de predicción de objetivos, mientras que los objetivos relacionados con IgAN se recogieron de plataformas integradas de bioinformática. Los objetivos principales se filtraron mediante análisis de redes PPI. Se construyó una red de "compuesto–objetivo–vía–enfermedad" para identificar los constituyentes clave, y se realizó acoplamiento molecular para evaluar las interacciones entre compuestos centrales y objetivos. Se identificaron un total de 185 compuestos en el extracto acuoso de YQQJ. Entre ellos, 28 compuestos entraron en el torrente sanguíneo en sus formas prototipo. IBP identificó 42 objetivos principales asociados con los efectos terapéuticos del YQQJ en la IgAN. Los análisis de enriquecimiento KEGG y GO mostraron implicación en la proliferación celular, inflamación y apoptosis, y enriquecimiento en varias vías clave como PI3K-Akt, MACK y JAK-STAT. El análisis de acoplamiento molecular predijo interacciones de unión favorables entre seis objetivos críticos (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB y PIK3CA) y tres compuestos principales absorbidos por la sangre—ácido Deacetilasperulosídico, ácido geniposidídico y Dioscina—con energías de unión consistentemente bajas, lo que sugiere posibles interacciones. Este análisis integrado revela que la YQQJ ejerce efectos terapéuticos contra la IgAN a través de múltiples componentes y múltiples objetivos. Se sugieren que el ácido deacetilasperulossídico y el ácido geniposidídico y la Dioscina son constituyentes activos clave que contribuyen a estos efectos.

Introducción

La nefropatía por IgA (IgAN) es una de las glomerulonefritis primarias más comunes en todo el mundo. Sus manifestaciones clínicas son altamente heterogéneas, típicamente presentadas como hematuria microscópica o macroscópica, a menudo acompañada de distintos grados de proteinuria, hipertensión y insuficiencia renal. Estudios anteriores sugerían que hasta un 40% de los pacientes progresan a insuficiencia renal en un plazo de 20 años desde el diagnóstico1; Sin embargo, la evidencia más reciente indica un pronóstico notablemente peor, con la mayoría de los pacientes desarrollando insuficiencia renal en un plazo de 10–15 años, y solo una pequeña proporción manteniendo la función renal de por vida sin progresión 2,3,4. Aunque las terapias dirigidas han logrado recientemente avances clínicos en el manejo de la IgAN, su alto coste y su aparición relativamente lenta de la eficacia siguen siendo grandes desafíos, y el equilibrio beneficio-riesgo clínico sigue siendo objeto de debate 5,6.

La medicina tradicional china (MTC) demuestra ventajas distintivas en el tratamiento de enfermedades complejas. Se caracteriza por una eficacia terapéutica estable, una incidencia relativamente baja de reacciones adversas y efectos sinérgicosmulti-objetivo. A diferencia de los agentes farmacológicos de un solo objetivo, las fórmulas de MTC suelen contener múltiples componentes bioactivos que pueden modular simultáneamente diversas vías biológicas. Este modo de acción multicomponente y multi-objetivo proporciona una posible ventaja terapéutica en el tratamiento de enfermedades complejas como laIgAN 8. En la teoría de la MTC, la IgAN no tiene un nombre específico de la enfermedad, pero generalmente se clasifica como "hematuria", "edema", "dolor de espalda", "viento renal" y "enfermedad consumptiva". La mayoría de los estudiosos consideran que su patogénesis central implica la deficiencia de Qi pulmonar, lo que conduce a una pérdida de control sobre el Qi defensivo y, a su vez, a la invasión del viento, la humedad, el calor y las toxinas, dañando finalmente los riñones. Aunque el riñón es el órgano principal afectado, el corazón, el hígado, el bazo y los pulmones también puedenverse afectados. Basándose en este conocimiento, numerosas investigaciones se han centrado en identificar medicinas y fórmulas herbales con propiedades tonificantes de Qi, consolidación exterior, limpieza de calor, desintoxicación y eliminación de humedad para el tratamiento clínico de la IgAN10,11.

La Fórmula Yiqi Qingjie (YQQJ) es una prescripción empírica eficaz utilizada en el Departamento de Nefrología de nuestro hospital para el tratamiento de la IgAN. La fórmula comprende siete hierbas, entre ellas Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) y Plantago asiatica L. (Cheqiancao). La YQQJ ejerce funciones terapéuticas de tonificar el Qi, consolidar el exterior, eliminar el calor, desintoxicar, activar la circulación sanguínea y promover ladiuresis 12. Los estudios clínicos han demostrado que la YQQJ reduce significativamente la proteinuria y la hematuria en pacientes con IgAN, mejora la función renal y alivia los síntomas inmunológicos relacionados con la mucosa, al tiempo que muestra un perfil de seguridad favorable12,13.

Aunque esta fórmula ha demostrado una eficacia clínica favorable, la base farmacológicamente activa del material sigue siendo difícil de esclarecer porque las fórmulas de MTC contienen numerosos componentes químicos. El perfilado químico basado únicamente en análisis cromatográfico o espectrométrico de masas puede revelar la composición química general de una fórmula; sin embargo, no puede determinar qué compuestos se absorben en la circulación sistémica y contribuyen directamente a los efectosterapéuticos 14. Además, los estudios convencionales de farmacología en redes se basan en gran medida en predicciones basadas en bases de datos y suelen analizar compuestos candidatos utilizando parámetros como la biodisponibilidad oral y la semejanza del fármaco. Este enfoque puede pasar por alto compuestos que realmente ejercen actividad farmacológica invivo 15.

Para abordar estas limitaciones, estudios recientes adoptan cada vez más estrategias analíticas integrativas que combinan cromatografía líquida de ultra alto rendimiento junto con espectrometría de masas híbrida cuadrupole-Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) en la farmacología sérica y la farmacología de sistemas en la investigación deMTC 16,17. La farmacoquímica sérica identifica compuestos que entran en la circulación sistémica tras la administración, proporcionando así evidencia farmacocinéticamente relevante para el cribado de posibles constituyentesbioactivos 18. Mientras tanto, el UHPLC-Q-Orbitrap HRMS permite la detección y caracterización estructural altamente precisa de los constituyentes químicos dentro de matrices herbalescomplejas 19.

En comparación con enfoques que se basan únicamente en perfilado químico o predicción teórica de objetivos, el flujo de trabajo integrativo aplicado en este estudio —que comprende la identificación de componentes basada en UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, el cribado farmacofísico sérico, el análisis de farmacología de redes y la validación de acoplamiento molecular— ofrece varias ventajas metodológicas. El UHPLC-Q-Orbitrap HRMS permite una identificación completa y precisa de componentes químicos complejos. La farmacoquímica sérica restringe los compuestos candidatos a aquellos que realmente son absorbidos en la circulación sistémica, mejorando así la plausibilidad biológica de los análisis posteriores en red. El análisis de farmacología de redes basado en compuestos absorbidos confirmados experimentalmente permite la exploración a nivel de sistema de mecanismos multi-objetivo y refleja mejor las características farmacológicas holísticas de las fórmulas de la MTC. El acoplamiento molecular proporciona además una validación computacional preliminar de las interacciones predechas entre compuesto y objetivo y apoya la priorización racional de moléculas candidatas para su posterior verificación experimental. En conjunto, este flujo de trabajo integrador proporciona una estrategia fiable, eficiente y fisiológicamente relevante para esclarecer la base material y los mecanismos de fórmulas herbales complejas como el YQQJ.

Este flujo de trabajo es especialmente adecuado para investigar la base farmacológicamente activa de los materiales y los mecanismos de fórmulas herbales complejas cuando se pueden obtener datos de absorción in vivo a partir de estudios farmacocinéticos en animales o humanos. Es especialmente aplicable a fórmulas con eficacia clínica establecida pero con componentes activos poco claros. No obstante, hay que reconocer varias limitaciones. En primer lugar, la precisión de la predicción de objetivos depende de la calidad y completitud de las bases de datos públicas. En segundo lugar, el flujo de trabajo se centra en compuestos prototipo detectados en circulación y no tiene en cuenta los metabolitos bioactivos generados in vivo. Tercero, las predicciones derivadas de análisis de farmacología de redes requieren una validación experimental adicional. A pesar de estas limitaciones, el flujo de trabajo proporciona un enfoque eficiente y fiable para la generación de hipótesis y la priorización de objetivos en estudios mecanicistas de fórmulas de MTC.

Por ello, este estudio utiliza el HRMS de UHPLC-Q-Orbitrap para caracterizar sistemáticamente tanto los componentes acuosos del extracto como los compuestos circulantes de YQQJ, estableciendo así una base de datos relativamente completa de posibles constituyentes activos. A partir de este conjunto de datos, el análisis de farmacología en redes, combinado con la validación por acoplamiento molecular, predice los componentes farmacológicamente activos potenciales de YQQJ para el tratamiento de IgAN y proporciona una base para investigaciones mecanicistas posteriores.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales que involucran animales cumplieron con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitidas por el Comité de Bienestar Animal de China. Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Centro Experimental Animal del Hospital Guang'anmen.

1. Administración de Animales y Medicamentos

  1. Utiliza doce ratas machos de Sprague–Dawley (SD) de 6 semanas que pesen entre 200 y 230 g.
  2. Alojar a todos los animales en el Centro de Animales Experimentales.
    NOTA: Mantenga la temperatura de la vivienda entre 20 y 26 °C y la humedad relativa entre 40 y 70 %. Usa un ciclo de 12 horas y 12 horas de luz y oscuridad para simular ritmos circadianos naturales.
  3. Aclimatar a los animales durante 7 días en condiciones estándar con acceso libre a comida y agua antes del experimento. Dividir aleatoriamente las ratas en dos grupos (n = 6 por grupo): un grupo de control y un grupo tratado con fármacos.
  4. Consulte la dosis equivalente convertida por la superficie corporal entre humanos yanimales 20. Administrar extracto concentrado de YQQJ mediante gavage oral a 24,68 mL/(kg·día) al grupo tratado con fármaco. Administrar simultáneamente un volumen igual de agua destilada al grupo de control para asegurar un tratamiento síncrono.
  5. Continúa con la administración durante 1 día. Divide la dosis diaria total en tres administraciones iguales (por ejemplo, a las 08:00, 13:00 y 18:00) para asegurar la dosis completa en un día.
    NOTA: Animales rápidos durante 12 horas antes del último ataque, con acceso libre al agua.
  6. Recoge muestras de sangre a las 2 y 8 horas después de la administración final. Anestesiar a las ratas mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg). Recoge sangre de la aorta abdominal.
  7. Deja las muestras de sangre erguidas a temperatura ambiente durante 1 hora, luego centrifuga a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C. Comprueba que el sobrenadante (suero) esté limpio y libre de hemólisis. Transfiere el suero sobrenadante y guárdalo a –80 °C para un análisis posterior.

2. Preparación de soluciones

  1. Preparación de soluciones de prueba
    1. Recoge todas las hierbas crudas de YQQJ según la fórmula. Añade 4 volúmenes de agua purificada en la olla de decocción y déjala en remojo durante 20 minutos.
      NOTA: Se añadió agua purificada a las hierbas en una proporción de 4:1 (v/w).
    2. Lleva la mezcla a ebullición y continúa la decocción durante 30 minutos a fuego bajo. Filtra a través de una gasa y recoge el filtrado. Repite la decocción de los residuos con 4 volúmenes de agua durante otros 30 minutos y filtra de nuevo.
    3. Combina los dos filtrados. Concentrar la solución combinada usando un evaporador rotativo ajustado a una temperatura de baño maria de 60 °C hasta alcanzar una concentración de 3 g/mL (p/v, equivalente a materiales medicinales crudos).
    4. Verifica que el extracto concentrado sea un líquido oscuro y viscoso, sin precipitación visible. Guárdalos a 4 °C para usarlos después.
  2. Preparación de soluciones de referencia
    1. Pesa con precisión los siguientes compuestos de referencia: Ácido deacetilasperulosídico, Ácido geniposídico, Ácido logánico, Moronisídea, Ácido clorogénico, Swerosídeo, Ácido plantagoguanidínico, Rhein-8-O-β-D-glucopiranósido, Genistina, Apigenina-7-glucósido, Diosmetina-7-O-β-D-glucopiranósido, Calicosina, Protodioscina, Genisteína, Diosmetina, Pseudoprotodiocina, Formononetina, 3-Hidroxi-9,10-dimetoxipterpán, Aloeemodina, Rin, Dioscina.
    2. Disuelve cada compuesto en metanol, haz un vórtice de la mezcla durante 1 minuto y luego sonica a temperatura ambiente durante 10 minutos para asegurar la disolución completa.
    3. Diluir cada solución con metanol para alcanzar una concentración final de 10 μg/mL para cada estándar.

3. Preparación de muestras

  1. Preparación de muestras de extracto de YQQJ
    1. Pipetear 100 μL del extracto acuoso YQQJ en un tubo centrífuga de 1,5 mL. Añade 300 μL de metanol y vórtice durante 1 minuto. Centrifugar a 1800 × g, 4 °C durante 10 minutos. Asegúrate de que el sobrenadante resultante esté limpio y libre de partículas suspendidas.
    2. Toma 100 μL del sobrenadante y mézclalo con agua ultrapura de 100 μL para lograr una dilución 1:1. Vórtice suavemente y transfiere a un vial de automuestreador para su análisis.
  2. Preparación de muestras de suero que contienen fármacos
    1. Pipete 100 μL de suero en un tubo centrífuga de 1,5 mL. Añade 300 μL de metanol y haz un vórtice durante 10 minutos para asegurar la precipitación de proteínas. Centrifugar a 1800 × g ., 4 °C durante 10 minutos.
    2. Recoge 270 μL del sobrenadante y transfiere a un tubo limpio. Evapora el sobrenadante hasta que se resequa usando un concentrador centrífugo de vacío ajustado a 120 × g., 37 °C durante 4 horas hasta que se forme un residuo sólido visible.
    3. Reconstituir el residuo con 90 μL de solución acuosa de metanol al 50%. Usar el vórtice durante 1 minuto para disolver completamente el residuo, luego centrifugar de nuevo a 1800 × g., 4 °C durante 10 minutos.
    4. Recoger 80 μL del supernadante transparente final y transfiererlo a un vial de automuestreador para su análisis.

4. Condiciones analíticas

  1. Condiciones cromatográficas
    1. Realizar la separación cromatográfica utilizando un sistema UHPLC equipado con una columna cromatográfica.
    2. Utiliza una fase móvil binaria (Fase A: agua con 0,1% de ácido fórmico; Fase B: acetonitrilo). Aplicar un programa de elución de gradiente como se muestra en la Tabla 1, a un caudal de 0,3 mL/min. Ajusta la temperatura de la columna a 40 °C y el volumen de inyección a 6,0 μL.
      NOTA: Las especificaciones de la columna son 2,1 mm × 100 mm, con dimensión de partícula de 1,8 μm.
  2. Condiciones de la EM
    1. Analizar muestras utilizando un espectrómetro de masas cuádruplo-orbitrap equipado con una sonda de ionización electrospray calentada (HESI).
    2. Establece los parámetros de la siguiente manera: voltaje de ionización: 3,7 kV (modo positivo) / 3,5 kV (modo negativo); temperatura capilar: 320 °C; Presión de gas en la vaina: 30 psi; Presión de gas auxiliar: 10 psi; temperatura de desolvación: 300 °C; gas de funda y el gas auxiliar: nitrógeno; gas de colisión: nitrógeno, 1,5 mTorr.
    3. Adquirir datos en modo escaneo completo/dd-MS 2 . Establece los parámetros completos de escaneo de la siguiente manera: resolución 70000, control automático de ganancia objetivo 1×106, tiempo máximo de aislamiento 50 ms y rango de escaneo m/z 100 – 1500.
    4. Recoger los datos de dd-MS2 con los parámetros de resolución 17500, objetivo de control automático de ganancia 1×105, tiempo máximo de aislamiento 50 ms, seleccionar los n (n≤10) iones parentales más intensos para la fragmentación junto con un mecanismo dinámico de exclusión, ventana de aislamiento de m/z 2, energía de colisión 10 V, 30 V, 60 V y umbral de intensidad 1×105.

5. Procesamiento de datos de MS

  1. Procesa los datos de MS adquiridos utilizando software especializado de procesamiento de datos. Navega al módulo Importar Datos y sube los archivos de datos en bruto.
  2. Ejecuta el módulo de Pico de Picking y realiza la deconvolución de picos para agrupar iones aducidos y generar características compuestas.
  3. Busca en bases de datos de compuestos de referencia, bases de datos de predicción de objetivos y literatura publicada relevante para identificar candidatos.
  4. Identificar compuestos utilizando dos estrategias complementarias de identificación basadas en datos de alta resolución de EM.
    1. Identificación basada en la coincidencia de estándares de referencia. Confirma los compuestos comparándolos con estándares de referencia auténticos. Aceptar identificaciones solo cuando se cumplan todos los siguientes criterios:
      1. Precisión de masa: El error de masa tanto de los iones precursores como de los fragmentos debe estar dentro de ±5 ppm.
      2. Similitud espectral: La puntuación de similitud coseno entre el espectro experimental MS/MS y el espectro MS/MS del estándar de referencia debe ser ≥ 0,85.
      3. Distribución isotópica: La puntuación de coincidencia de patrones isotópicos debe ser ≥ 90%.
      4. Comportamiento cromatográfico: La desviación de tiempo de retención entre el compuesto detectado y el estándar de referencia debe ser < 0,2 min.
        NOTA: Los compuestos que cumplen todos los criterios anteriores se anotan como MSI Nivel 1, lo que representa una identificación estructural confirmada.
    2. Identificación basada en datos de alta resolución de la EM y predicción espectral in silico. Para compuestos sin estándares de referencia disponibles, realizar una identificación putativa basada en mediciones de masa precisas y predicción espectral computacional. Aceptar anotaciones solo cuando se cumplan los siguientes criterios:
      1. Precisión de masa: El error de masa de los iones precursores debe estar dentro de ±5 ppm, y el error de masa de los iones fragmentos debe estar dentro de ±10 ppm.
      2. Similitud espectral: Compare el espectro experimental MS/MS con el espectro teórico MS/MS generado a partir de la estructura compuesta SMILES usando el algoritmo Progenesis QI. Acepta coincidencias con una puntuación de similitud coseno ≥ 0,60.
      3. Distribución isotópica: La puntuación de coincidencia de patrones isotópicos debe ser ≥ 90%.
      4. Predicción cromatográfica del comportamiento: La desviación entre el tiempo de retención experimental y el tiempo de retención predicho por aprendizaje automático debe ser < 1,0 min.
        NOTA: El modelo de predicción del tiempo de retención fue entrenado utilizando datos cromatográficos experimentales de más de 2000 compuestos de referencia analizados bajo las mismas condiciones cromatográficas. Los compuestos que cumplen estos criterios se anotan como MSI Nivel 2, representando compuestos supuestamente identificados con alta confianza estructural.

6. Farmacología de redes

  1. Identificación de componentes absorbidos por sangre y dianas relacionadas con IgAN
    1. Importar los componentes identificados de YQQJ absorbidos por sangre prototipo a las bases de datos de predicción de objetivos. Selecciona "Homo sapiens" como especie objetivo y obtén sus posibles objetivos. Registra estos como el conjunto objetivo de compuestos absorbidos por sangre en YQQJ.
    2. Utiliza la palabra clave "Nefropatía por IgA" para obtener objetivos de enfermedades relacionadas con IgAN de las plataformas integradas de bioinformática. Consolida resultados de múltiples fuentes para minimizar el sesgo.
      NOTA: Utiliza una base de datos de proteínas para convertir todos los objetivos recuperados al formato de Símbolo Genético para mayor coherencia.
  2. Construcción de la red de interacción proteína-proteína (PPI) e identificación de dianas principales
    1. Fusiona el conjunto objetivo de compuestos absorbidos por sangre YQQJ con el conjunto objetivo de la enfermedad IgAN y extrae su intersección.
    2. Sube los objetivos que se intersectan a la plataformaPPI 21. Configura los ajustes: pon el organismo como Homo sapiens, la puntuación de confianza en 0,90, y descarta todos los nodos desconectados.
    3. Importa los datos del PPI al softwarede visualización 22. Lanza el plugin de análisis topológico. Calcular la centralidad de grados (DC)23, la centralidad de intermedio (BC)24 y la centralidad de cercanía (CC)25.
    4. Filtrar los objetivos terapéuticos principales de YQQJ frente a IgAN filtrando nodos con valores de parámetros topológicos (DC, BC y CC) que excedan la mediana.
  3. Construcción y análisis de la red integrada "YQQJ–componentes absorbidos–objetivos–vías–enfermedad"
    1. Prepara el archivo de atributos del nodo: crea una hoja de cálculo con dos columnas. Etiqueta la primera columna Nombre del nodo y el segundo tipo de nodo. Asigna una de las cinco categorías (Fórmula, Componente Absorbido por Sangre, Objetivo de Intersección, Vía o Enfermedad) a cada nodo.
    2. Prepara el archivo de interacción de red (edge): Crea una hoja de cálculo que defina las conexiones entre nodos (por ejemplo, Componente Absorbido por Sangre a Objetivo de Intersección). Asegúrate de que todos los nombres de nodos coincidan con los del archivo de atributos del nodo para evitar errores de mapeo.
    3. Importar y construir la red: Lanzar el software de visualización de la red. Navega a File > Import > Network para cargar el archivo edge. En la ventana de vista previa, mapea las columnas como Nodo Fuente y Nodo Destino y haz clic en Aceptar para generar el gráfico inicial.
    4. Mapear atributos de nodo y establecer estilos visuales: Importar el archivo de atributos del nodo a través de Archivo > importar > Tabla. Abre el panel de Estilo y asigna la columna de Tipo de Nodo a propiedades visuales específicas, incluyendo la forma del nodo, el color de relleno y el tamaño.
    5. Ejecutar análisis topológico: Navegar a Herramientas > Analizar Red para realizar cálculos topológicos. Filtrar e identificar compuestos activos principales y objetivos terapéuticos clave en función de los valores de grado.
      NOTA: Utilice los mismos parámetros topológicos descritos en el paso 6.2 para asegurar la consistencia en la identificación de nodos centrales.
    6. Exportar la imagen de red: Finalizar el diseño de la red. Navega a Archivo > Exportar > Red a Imagen para guardar la visualización optimizada.
  4. Enriquecimiento GO y análisis de vías KEGG
    1. Envía la lista genética: Abre la plataforma web de anotación funcional. Navega al área del Paso 1: Enviar Lista de Genes y sube la lista de genes objetivo central previamentefiltrada 26.
    2. Seleccionar especies: En los menús desplegables del Paso 2: Introducir como especie y Paso 3: Análisis como especie, seleccione H. sapiens. (humano) para asegurar que el análisis se realice dentro del contexto biológico correcto.
    3. Configurar análisis personalizado: Seleccione el modo Análisis Personalizado . En la categoría de Enriquecimiento , consulte las siguientes bases de datos: Ontología Génica (GO) Función Molecular (MF), Proceso Biológico GO (BP), Componente Celular GO (CC) y Vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG).
    4. Establezca umbrales de significación: Establece el corte del valor P a < 0,01, el enriquecimiento mínimo a ≥ 1,5 y la superposición mínima a ≥ 3. Mantén todos los demás parámetros en sus ajustes predeterminados.
    5. Ejecuta el análisis: Haz clic en el botón de Análisis de Enriquecimiento para entregar la tarea y espera a que se complete el cálculo.
    6. Recuperar y exportar resultados: Accede a la página del informe de análisis generado. Haz clic en el botón de descargar para exportar los datos detallados de enriquecimiento en formato de hoja de cálculo, junto con los correspondientes gráficos de barras y mapas de calor.

7. Verificación de acoplamiento molecular

  1. Descargue las estructuras de proteínas 3D de alta resolución (< 2,50 Å) de los objetivos centrales y las estructuras químicas 2D de los componentes absorbidos por sangre del núcleo de las bases de datos de biologíaestructural 27.
  2. Lanza el software de acoplamiento molecular e importa las estructuras descargadas.
  3. Ejecuta los siguientes pasos de preprocesamiento de forma secuencial: Navegar para Editar > Eliminar agua para eliminar moléculas de agua; selecciona Editar > Eliminar heteroátomos para descartar residuos no estándar.
  4. Ve a Editar > hidrógenos > Añadir > Solo polares para añadir átomos de hidrógeno polar. Guarda las estructuras procesadas en formato PDBQT mediante archivo > Guardar > escribir PDBQT.
  5. Define el sitio de acoplamiento usando la herramienta Grid > Grid Box . Las dimensiones de las cajas de la cuadrícula se ajustaban adaptativamente (20–100 Å) para asegurar una cobertura completa de las regiones de unión previstas.
  6. Inicializar los parámetros de acoplamiento: Seleccionar el receptor mediante Acoplamiento > Macromolécula > establecer Nombre de Archivo Rígido y abrir el ligando mediante Acoplamiento > Ligando > Abierto. Los parámetros de acoplamiento se establecieron de la siguiente manera: exhaustividad = 32, rango de energía = 3 kcal/mol, y se mantuvieron hasta 10 modos de enlace. Para proteínas con ligandos cocristalizados, la caja de la rejilla de acoplamiento estaba centrada en el centroide del ligando con una extensión de 8,0 Å, mientras que para proteínas sin ligandos cocristalizados, se predijeron bolsas de unión usando DoGSiteScorer con aproximadamente un 90% de cobertura.
  7. Elige el Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA) como estrategia de búsqueda. Ejecuta la simulación mediante acoplamiento > ejecuta el acoplamiento automático.
  8. Evalúa la afinidad de unión basándose en la energía de enlace calculada (puntuación de acoplamiento)28.
    NOTA: Una menor energía de unión indica una mayor bioactividad prevista y una mayor estabilidad estructural del complejo proteína-ligando. Se utiliza típicamente un umbral de ≤ -5,0 kcal/mol para identificar una estabilidad favorable en la unión.

Resultados

Análisis de los constituyentes en el extracto acuoso YQQJ
El análisis de componentes del extracto acuoso YQQJ se realizó bajo las condiciones establecidas en el PROTOCOLO 4. El UHPLC-Q-Orbitrap HRMS se empleó tanto en modos de escaneo completo de iones positivos como negativos para perfilar el extracto acuoso de YQQJ, y el cromatograma de iones de pico de base (BPI) obtenido se muestra en la Figura 1. Sobre esta base, una base de datos de constituyentes químicos auto-establecida combinada con la caracterización espectral de MS/MS permitió la identificación exitosa de 185 compuestos del extracto acuoso, con información detallada resumida en la Tabla Suplementaria 1. Los patrones representativos de coincidencia espectral y fragmentación MS/MS utilizados para la identificación de compuestos se ilustran en la Figura Suplementaria 1. El análisis estadístico de categorías de compuestos reveló que los flavonoides y terpenoides eran los constituyentes predominantes en YQQJ, representando 94 compuestos, la proporción más abundante.

Componentes absorbidos por sangre de YQQJ
Para aclarar las sustancias bioactivas directas in vivo, se analizaron muestras de suero recogidas tras la administración de YQQJ. Se incluyó el cromatograma de la BPI del suero en blanco (Figura 2) para comparación, con el fin de distinguir compuestos derivados de fármacos de componentes endógenos del suero. Según el IBP del suero que contiene fármacos (Figura 3), se identificaron un total de 28 componentes prototipo absorbidos en el torrente sanguíneo, incluyendo principalmente flavonoides, terpenoides y esteroides. Cromatógramas iónicos (EICs) extraídos de compuestos representativos en el extracto de YQQJ, suero en blanco y suero que contiene fármacos confirmaron aún más la presencia de componentes derivados del fármaco en la circulación (Figura suplementaria 2). Entre ellos, 10 compuestos se originaron en Spatholobus suberectus Dunn, 7 en Dioscorea nipponica Makino, 7 en Astragalus membranaceus, 6 en Hedyotis diffusa Willd., 6 en Lonicera japonica Thunb., 4 en Plantago asiatica L. y 4 en Rheum palmatum.L., tal como se resume en la Tabla Suplementaria 1.

Predicción del objetivo de componentes absorbidos por sangre de YQQJ relacionados con IgAN
Un total de 28 constituyentes prototipo identificados que entraron en el torrente sanguíneo fueron introducidos en bases de datos de predicción de objetivos, lo que proporcionó 459 posibles objetivos. Mientras tanto, se recuperaron 2779 objetivos relacionados con IgAN de plataformas integradas de bioinformática. El análisis de intersección identificó 247 objetivos superpuestos entre YQQJ e IgAN (Figura 4).

Construcción y análisis de la red PPI
Los 247 objetivos que se intersectaban se cargaban en la plataforma PPI, y el software de visualización se utilizaba para filtrar objetivos centrales basándose en tres parámetros topológicos: DC, BC y CC. Un total de 42 objetivos fueron finalmente identificados como nodos núcleo. El flujo de trabajo utilizado para seleccionar estos objetivos centrales se resume en la Figura Suplementaria 3. En la red PPI, el tamaño y el color del nodo variaban según los valores de los parámetros (Figura 5), entre los que se situaban TP53, SRC, AKT1, ESR1 y STAT3 entre los cinco principales objetivos centrales.

"Fórmula–componentes absorbidos por sangre–dianas centrales–vías–enfermedad" red de YQQJ
Para revelar sistemáticamente los mecanismos multicomponente y multi-objetivo de YQQJ frente a IgAN, se construyó una red de interacción "Fórmula–Componentes Absorbidos por Sangre–Objetivos Centrales–Vías–Enfermedad" utilizando software de visualización. La red constaba de 96 nodos y 459 aristas, donde cada arista representaba una relación o interacción entre dos nodos (Figura 6).

Análisis de enriquecimiento GO y KEGG
El análisis de enriquecimiento GO de los 42 objetivos centrales reveló 1162 términos BP, 52 términos CC y 92 términos MF. La Figura 7 muestra los 10 términos GO más significativamente enriquecidos en las categorías BP, CC y MF. El análisis de enriquecimiento KEGG identificó además 182 vías asociadas a estos objetivos centrales. La Figura 8 ilustra las 20 vías más enriquecidas significativamente relacionadas estrechamente con la patogénesis de la IgAN. En estos gráficos, los colores rojo más intensos indican una mayor significación estadística, mientras que burbujas de mayor tamaño o longitudes de barra más largas representan un mayor número de blancos enriquecidos dentro de cada vía.

Evaluación del acoplamiento molecular
En este estudio, basado en el análisis previo de dianas clave y vías relacionadas con YQQJ en el tratamiento de IgAN 29,30,31,32, se seleccionaron seis dianas principales, incluyendo CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) y PIK3CA (PDB ID: 5FI4), como proteínas receptoras para el acoplamiento molecular. Correspondientes a la patogénesis central de la MTC de IgAN, definida como "viento patógeno, humedad-calor y toxinas invadiendo el riñón", se seleccionaron componentes activos representativos con propiedades de limpieza de calor, eliminación de humedad y desintoxicación como ligandos, a saber, ácido Deacetilasperulossídico y ácido geniposidídico de Hedyotis diffusa Willd., y Dioscina de Dioscorea nipponica. Makino. Los resultados del acoplamiento se muestran en la Figura 9. Entre todas las combinaciones ligando-receptor, Dioscina mostró energías de unión notablemente más bajas con todos los objetivos seleccionados, lo que sugiere una mayor afinidad de unión predicha. Excepto por las interacciones entre JUN y el ácido Deacetilasperulossídico/ácido geniposidíco, los otros pares de acoplamiento también demostraron actividades de unión favorables. Las conformaciones representativas de acoplamiento 3D se visualizan en la Figura 10.

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Figura 1: Cromatógramas de Iones Pico Base del extracto acuoso YQQJ. (A) Cromatografía BPI en modo iónico positivo. (B) Cromatógrama BPI en modo iónico negativo. Los cromatogramas muestran el perfil químico global del extracto acuoso YQQJ bajo las condiciones establecidas de HRMS UHPLC-Q-Orbitrap. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Cromatógramas de iones de pico base del suero en blanco. (A) Cromatografía BPI en modo iónico positivo. (B) Cromatógrama BPI en modo iónico negativo. Los cromatogramas representan el perfil de fondo sérico endógeno utilizado como control para la comparación con suero que contiene fármacos para distinguir componentes derivados de fármacos de los componentes endógenos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Cromatógramas de Iones Pico de Base de suero que contiene YQQJ. (A) Cromatografía BPI en modo iónico positivo. (B) Cromatógrama BPI en modo iónico negativo. Los cromatogramas representan el perfil de los componentes absorbidos por sangre detectados en el suero tras la administración de YQQJ. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Diagrama de Venn de objetivos superpuestos entre YQQJ e IgAN. El diagrama muestra el número de dianas predichas para YQQJ, dianas relacionadas con IgAN y su intersección, destacando las dianas compartidas potencialmente implicadas en efectos terapéuticos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Red de interacción proteína-proteína (PPI) de objetivos centrales. Los nodos representan blancos proteicos y los bordes representan interacciones entre objetivos. El tamaño del nodo y la intensidad del color corresponden a valores de grado, siendo los nodos más grandes y oscuros indicar una mayor conectividad dentro de la red. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Red integrada de componentes, objetivos, vías y enfermedades del YQQJ. La red ilustra las relaciones entre la fórmula, los componentes absorbidos por la sangre, los objetivos centrales, las vías y el IgAN. El triángulo representa la enfermedad; el círculo representa las vías; El nodo en forma de V representa la fórmula YQQJ; el diamante representa hierbas; hexágono representa los componentes; Octagon representa los prototipos de componentes absorbidos por sangre; el rectángulo representa los objetivos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7: Análisis de enriquecimiento GO de objetivos centrales. El gráfico de barras muestra los 10 términos más enriquecidos de Ontología Génica en las categorías BP, CC y MF. El eje x representa los términos GO, y el eje y muestra −log10(valor p), indicando la importancia del enriquecimiento. Abreviaturas: BP = Proceso biológico; CC = componente celular; MF = Función molecular. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 8: Análisis de enriquecimiento de vías KEGG de objetivos centrales. El gráfico de burbujas muestra las 20 principales vías enriquecidas de KEGG. El tamaño del punto indica el número de genes enriquecidos, y el gradiente de color indica −log10 (valor p), con colores más rojos indicando una mayor significación estadística. El eje x muestra la proporción génica y el eje y lista términos de la vía. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 9: Mapa térmico de energía de unión molecular por acoplamiento. El mapa de calor presenta energías de unión (kcal/mol) entre los objetivos centrales y los compuestos clave absorbidos por la sangre. Valores de energía de enlace más bajos indican una afinidad de unión predicha más fuerte. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 10: Conformaciones representativas de acoplamiento molecular. (A) Conformación de unión del ácido Deacetilasperulossídico con CASP3. (B) Conformación de unión de Dioscina con STAT3. (C) Conformación de unión del ácido geniposídico con PIK3CA. Las imágenes muestran las interacciones predichas ligando-proteína y las orientaciones de unión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Identificación estructural de compuestos representativos mediante MS/MS de alta resolución. (A) Comparación espectral cabeza-cola del ácido deacetilasperulosídico entre el espectro experimental (arriba, rojo) y el espectro de la base de datos de referencia (abajo, azul). (B) Espectro de fragmentación MS/MS de alta resolución del ácido Deacetilasperulosídico. (C) Comparación espectral de cabeza a cola del ácido geniposídico con la base de datos de referencia. (D) Espectro experimental de fragmentación MS/MS del ácido geniposídico. (E) Comparación espectral cabeza-cola de Dioscina con la base de datos de referencia. (F) Espectro de fragmentación MS/MS de alta resolución de Dioscina. Estos paneles ilustran la coincidencia espectral utilizada para la identificación de compuestos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Cromatógramas iónicos (EIC) extraídos de compuestos representativos entre muestras. (A) EIC del ácido deacetilasperulossídico. (B) EIC del ácido geniposídico. (C) EIC de Dioscin. Para cada pane, la traza superior representa el extracto acuoso YQQJ (ZY), la traza central representa el suero control en blanco (KBX) y la traza inferior representa muestras de suero que contienen componentes absorbidos por sangre tras la administración de YQQJ (GYX). La comparación destaca la presencia de compuestos derivados de fármacos en el suero. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Flujo de trabajo para el cribado de objetivos principales. El diagrama ilustra el proceso de identificación de objetivos por etapas, incluyendo la predicción de objetivos compuestos, la recogida de objetivos relacionados con IgAN, el análisis de intersecciones, la construcción de redes PPI y el cribado de objetivos centrales basados en parámetros topológicos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tiempo (min)Fase móvil
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabla 1: Programa de elución por gradiente UHPLC. La tabla presenta la composición de fase móvil y las condiciones de gradiente utilizadas para la separación cromatográfica, incluyendo puntos de tiempo y las proporciones correspondientes de disolventes acuosos (Fase A) y orgánicos (Fase B).

Tabla suplementaria 1: Constituyentes químicos identificados del extracto acuoso YQQJ. La tabla enumera compuestos identificados por el UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, incluyendo componentes absortos por sangre prototipo (A1–A28), junto con su clasificación y origen herbal. Abreviaturas: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Reumato palmado L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiática L.; JYH = Lonicera japonica. Gracias. Las clases compuestas incluyen A = alcaloides; Ald = aldehídos; F = Flavonoides; N = nucleósidos; O = Otros; OA = Ácidos orgánicos; P = Fenoles; PA = Ácidos fenólicos; Phe = Fenilpropanoides; Q = Quiñones; S = Sacáridos; Ste = Esteroides; T = Terpenoides; Tan = Taninos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En el presente estudio, se empleó una estrategia integrada que combina "identificación UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – análisis farmacoquímico sérico – predicción de farmacología de redes – validación de acoplamiento molecular" para dilucidar sistemáticamente la base material potencial y los mecanismos de YQQJ en el tratamiento de IgAN. A diferencia de investigaciones anteriores que se basaban principalmente en la EM para analizar los componentes químicos de las fórmulas herbales y luego predecían mecanismos usando solo la farmacología deredes 16, la farmacología sérica sigue un flujo de trabajo de "componentes herbales complejos – componentes absorbidos por la sangre – sustancias activas directas in vivo – base de material farmacodinámico". Al identificar los componentes que entran en la circulación sistémica tras la administración, este enfoque es ampliamente considerado una estrategia eficaz para identificar la base material farmacodinámica de las fórmulas de la MTC.

En este estudio, el análisis UHPLC-Q-Orbitrap HRMS identificó inicialmente 185 constituyentes en YQQJ, de los cuales 28 fueron confirmados como compuestos prototipo absorbidos por sangre, proporcionando así una base química fiable para estudios mecanicistas posteriores. La precisión de esta identificación dependía de la coincidencia exhaustiva del tiempo de retención, la masa exacta y la información de fragmentación MS/MS 14. Basándose en la estrategia farmacoquímica sérica, estos compuestos prototipo absorbidos por sangre se utilizaron como punto de partida para la construcción de una red, lo que aumentó la relevancia entre los componentes herbales y la eficacia real invivo 33. Al integrar objetivos de intersección compuesto y enfermedad con el cribado basado en IBP de los nodos centrales, seguido de análisis de enriquecimiento GO y KEGG, seidentificaron 15 vías clave de señalización asociadas a IgAN. Los resultados del acoplamiento molecular sugirieron que los principales componentes absorbidos por sangre derivaban de Hedyotis diffusa Willd. y Dioscorea nipponica Makino.puede interactuar con objetivos centrales basándose en afinidades de unión predichas en lugar de actividad funcional confirmada experimentalmente. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que el ácido Deacetilasperulossídico, el ácido geniposidídico y la Dioscina pueden ser los posibles constituyentes farmacodinámicos clave de YQQJ, a la espera de una validación experimental adicional.

Desde un punto de vista técnico, el pretratamiento de la muestra era crucial. Debido a la complejidad del suero y a la presencia de proteínas endógenas (por ejemplo, hormonas y enzimas), la interferencia en la detección de componentes absorbidos por la sangre es inevitable. En este estudio, se aplicó precipitación de metanol para enriquecer analitos y reducir la interferencia de fondo, asegurando tanto la sensibilidad como la precisión del análisis de laEM 34. En cuanto a los momentos de muestreo de sangre, diferentes componentes en las fórmulas herbales pueden mostrar patrones de absorción y transformación in vivo distintos, lo que puede influir en su detectabilidad en el suero. Por lo tanto, basándose en ensayos preliminares, se recogieron muestras de suero a las 2 y 8 horas de la administración final para maximizar la cobertura de los componentes circulantes.

Se consideraron que varios pasos procedimentales son especialmente críticos para la implementación exitosa de este flujo de trabajo. La identificación precisa de compuestos depende en gran medida de la evaluación combinada del tiempo de retención, la precisión masiva de alta resolución y los iones de fragmentos MS/MS diagnósticos. Además, los tiempos adecuados para la toma de suero son esenciales para capturar los componentes absorbidos por la sangre que pueden aparecer en la circulación en diferentes etapas tras la administración. Por tanto, es necesaria una optimización cuidadosa del pretratamiento de la muestra y de las condiciones de separación cromatográfica para garantizar la detección fiable de compuestos prototipo en matrices biológicas complejas.

Pueden surgir posibles desafíos analíticos durante la preparación de la muestra y el análisis de la EM. Por ejemplo, una precipitación incompleta de proteínas puede provocar efectos de matriz que suprimen la eficiencia de ionización, mientras que un ruido de fondo excesivo puede reducir la sensibilidad a la detección. Estos problemas pueden mitigarse optimizando las proporciones de disolventes durante la precipitación de proteínas, mejorando las condiciones de separación cromatográfica y ajustando los parámetros de adquisición de la EM. Durante el procesamiento de datos, pueden producirse anotaciones de compuestos falsos positivos cuando se basa únicamente en la coincidencia de bases de datos; por ello, se recomienda la verificación manual de los patrones de fragmentación y el comportamiento de retención de MS/MS para mejorar la fiabilidad de la identificación.

En este trabajo se incorporaron varias consideraciones metodológicas. Primero, en lugar de aplicar criterios convencionales como la biodisponibilidad oral y la semejanza del fármaco, solo se emplearon componentes absorbidos en sangre verificados experimentalmente para la predicción de objetivos. Este enfoque evitó la posible omisión de compuestos activos debido a umbrales de filtrado preestablecidos y eliminó constituyentes irrelevantes que no están biodisponibles in vivo, fortaleciendo así la relevancia fisiológica de la predicciónde la red 16. En segundo lugar, la selección de ligandos activos para acoplamiento se centró específicamente en componentes principales originados en hierbas con funciones de "disipar la humedad del viento y eliminar la toxina térmica" (Hedyotis diffusa Willd. y Dioscorea nipponica Makino), estableciendo un puente mecanicista entre el concepto patológico de la MTC de "toxina de viento-humedad-calor invadiendo el riñón" y las características patológicas modernas de IgAN. Esto proporciona evidencia preliminar que respalda la teoría de la MTC sobre la correlación fórmula–patrón. En tercer lugar, teniendo en cuenta las posibles diferencias en tamaño y calidad de datos entre bases de datos, se integraron múltiples plataformas para ampliar la cobertura objetivo y reducir el sesgo introducido por cualquier base de datosúnica 35.

En comparación con las estrategias convencionales que aplican directamente la farmacología de redes a todos los constituyentes químicos detectados, el flujo de trabajo actual enfatiza la priorización de compuestos guiada por la evidencia basada en componentes absorbidos por sangre detectados experimentalmente. Este proceso de filtrado por etapas reduce el número de compuestos candidatos que entran en el análisis computacional y mejora la interpretabilidad de las redes de interacción compuesto–objetivo. Además, a diferencia de los estudios orientados a la metabolómica que capturan principalmente perturbaciones metabólicas endógenas, la estrategia actual se centra en compuestos prototipo exógenos derivados de medicinas herbales, permitiendo así una atribución más directa de la actividad farmacológica a componentes herbales específicos.

Desde una perspectiva metodológica práctica, este flujo de trabajo ofrece varias ventajas para investigar formulaciones herbales complejas. La integración del HRMS con la farmacoquímica sérica permite la identificación fiable de los constituyentes biodisponibles, mientras que la posterior combinación de farmacología en red y acoplamiento molecular establece un marco analítico jerárquico que vincula la evidencia química con la predicción mecanicista. Además, restringir la construcción de la red a compuestos verificados experimentalmente reduce la complejidad de la red y facilita una identificación más clara de las interacciones núcleo entre compuesto y objetivo.

Este estudio también tiene limitaciones. En primer lugar, la farmacología de redes y el acoplamiento molecular son enfoques computacionales predictivos. Una fuerte afinidad de unión no se traduce necesariamente en regulación biológica in vivo, ya que el acoplamiento molecular no tiene en cuenta la dinámica de proteínas, el contexto celular ni la señalización posterior. Además, el actual protocolo de acoplamiento no incluía validación de reacoplamiento utilizando ligandos cocristalizados ni comparaciones con inhibidores conocidos, lo que podría limitar la evaluación de la precisión del acoplamiento. Futuros estudios que incorporen validación basada en RMSD, simulaciones de dinámica molecular y ensayos experimentales reforzarán aún más la fiabilidad de estas predicciones. Actualmente, nuestro grupo ha completado la validación mecanicista que demuestra que Dioscina actúa a través de la vía JAK2/STAT3, lo que refuerza en cierta medida la credibilidad de la predicción y proporciona apoyo experimental parcial para los objetivos clave identificados en este estudio, aunque otras interacciones componente-objetivo aún requierenconfirmación 36. En segundo lugar, las influencias de la compatibilidad proporcional y las relaciones de dosificación entre hierbas no se incorporaron en el análisis actual. Futuros trabajos podrían introducir modelos de red ponderados dosis-efecto para reflejar mejor las prácticas clínicas deprescripción 37.

En conclusión, el flujo de trabajo actual—identificación de componentes absorbidos por sangre mediante esclerosis múltiple de alta resolución, análisis centrado en dianas y vías basadas en farmacología en red, y validación de acoplamiento molecular—permite un estrechamiento eficiente de la base del material activo y de los objetivos de acción a partir de una compleja fórmula herbal. Esto proporciona una dirección experimental clara para la verificación biológica posterior y acelera las investigaciones mecanicistas de fórmulas de MTC. En el futuro, integrar la metabolómica espacial, modelos organoides y tecnologías multiómicas podría permitir la validación dinámica y tridimensional de los hallazgos actuales en sistemas que recapitulen más fielmente condiciones fisiológicas y patológicas, proporcionando así evidencia más sólida para esclarecer la base científica de las fórmulas de la MTC.

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención nº 81973675), el Proyecto de Promoción de Hospitales Médicos Chinos de Alto Nivel (Subvención nº HLCMHPP2023039), y la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Subvención nº 7252259).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AutoDock 4.2.6El Instituto de Investigación de Escrituras-
Columna cromatográficaWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Centrífuga refrigerada de alta velocidadTecnología del Laboratorio HettichMikro 220R
Plataformas integradas de bioinformáticaWeizmann  Instituto  of  Ciencia-Base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/)
Plataformas integradas de bioinformáticaThe  Johns  Hopkins  Universidad  Colegio  of  Medicina-Base de datos OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitriloThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MetanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L AguaThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL Ácido fórmicoThermo Fisher ScientificA117-50
Software de procesamiento de datos de espectrometría de masasWaters Corp.-Software Progenesis QI 3.0
Software de acoplamiento molecularLaboratorio OlsonAutoDock 4.2.6
Plataforma PPIEmpresa de bases de datos STRING-La plataforma online STRING (https://string-db.org)
Base de datos de proteínasInstituto Europeo de Bioinformática; el Instituto Suizo de Bioinformática; Fuente de Información sobre Proteínas-Plataforma UniProt (https://www.uniprot.org/)
Espectrómetro de masas orbitrap cuadrupolarThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Bases de datos de compuestos de referenciaTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
Evaporador rotatorioShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Bases de datos de biología estructural.Laboratorio Nacional de Brookhaven-La base de datos RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
Bases de datos de biología estructural.Centro Nacional de Información Biotecnológica-La base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Bases de datos de predicción de objetivosInstituto Suizo de Bioinformática SIB-Base de datos SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
Bases de datos de predicción de objetivosShanghái y Shanghái; Instituto  of  Materia  Medica-Base de datos TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Plugin de análisis topológico--Centiscape 2.2 plugin; Analizador de red
Sistema UHPLCVanquish Flex-
Cromatógrafo líquido de ultra alto rendimientoThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Extractor ultrasónicoKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Concentrador centrífugo al vacíoNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Software de visualización--Cytoscape 3.10.4
Plataforma de anotación funcional basada en la web.Broad  Instituto-La plataforma online Metascape (https://metascape.org)

Referencias

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

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