Extracción de ADN en columna de rendimiento medio usando racks de 24 pozos

Resumen

Este protocolo describe un método rentable para acelerar la extracción de ADN plasmid. Utilizando racks personalizados impresos en 3D compatibles con rotores estándar de placas de cubo oscilante, los investigadores pueden procesar hasta 48 columnas de giro con condensadores o hasta 116 columnas de giro sin condensadores simultáneamente, reduciendo significativamente el tiempo de manipulación en comparación con los métodos manuales de microcentrífuga.

Resumen

La extracción de columnas de spin con membrana sílica es el estándar para la purificación de ADN de alta calidad, pero requiere mucho trabajo y es difícil de escalar manualmente más allá de lotes pequeños. Los robots automatizados de manejo de líquidos existentes suelen seguir siendo demasiado caros para laboratorios pequeños y medianos. Este artículo presenta un enfoque simplificado y semiautomatizado utilizando racks diseñados a medida e impresos en 3D que se adaptan a rotores estándar de placas de centrifugación.

El sistema sugerido permite el procesamiento paralelo de hasta 116 columnas comerciales estándar de spin. El diseño de rack permite una configuración "anidada", permitiendo la clarificación simultánea de lisados (mediante columnas de filtración) y la unión al ADN (mediante columnas de sílice) en un solo paso de centrifugación. Además, el diseño incorpora un depósito compartido de residuos, eliminando la necesidad de eliminar el flujo de los tubos individuales durante los pasos de lavado.

Este método logra un rendimiento y pureza de ADN comparable a los protocolos manuales estándar, pero reduce el tiempo total de procesamiento en aproximadamente un 50–70% para lotes de muestra mayores a 24 (60–90 minutos en lugar de 120–180 minutos). El tiempo total necesario para los pasos que incluyen filtración por lisato, lavados y eliminación de residuos se reduce en 5–10 minutos, independientemente del número de muestras procesadas. Este enfoque de hardware de código abierto conecta la brecha entre los minipreps manuales y la automatización costosa.

Introducción

El aislamiento de ácidos nucleicos mediante matrices de sílice fue elucidado por primera vez en 1979 por Vogelstein y Gillespie, quienes establecieron el principio fundamental de adsorbir fragmentos de ADN en polvo de vidrio en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas, específicamente yoduro^{de sodio 1}. Este avance ofreció una alternativa más segura y eficiente a los métodos tóxicos de extracción de fenol-cloroformo y a los laboriosos métodos de ultracentrifugación con gradiente de cloruro de cesio que dominaron la época. Posteriormente, Boom y sus coautores optimizaron significativamente esta metodología introduciendo tiocianato de guanidinio (GuSCN) como el principal agente^{caotrópico 2}. Esta innovación fue fundamental, ya que GuSCN actúa simultáneamente como un potente desnaturalizante proteico para la lisis celular y como un fuerte inhibidor de RNasas y DNasas, preservando así la integridad de los ácidos nucleicos durante las fases iniciales de extracción.

Desde sus inicios, esta tecnología de extracción en fase sólida—ampliamente conocida como el "método Boom"—ha sido objeto de un refinamiento extenso. Se ha adaptado para aislar ácidos nucleicos de matrices biológicas cada vez más complejas, que van desde el plásmido^{bacteriano 3} y el ADN genómico⁴ hasta el mitocondrial^{eucariota 5} y el ADN genómico de alto peso molecular. Además, la tecnología se ha adaptado a aplicaciones clínicas y forenses, incluyendo el aislamiento de ADN circulante libre de células del plasma⁶, la extracción de ADN vegetal recalcitrante y ARN rico en^{polifenoles 7}, y la purificación de ácidos nucleicos^{virales 8}. También están disponibles muchos kits comerciales que utilizan columnas de spin.

El mecanismo fisicoquímico que subyace a este proceso se basa en la alteración de la estructura del agua por iones caotrópicos. En presencia de alta fuerza iónica y pH bajo, se eliminan las capas de hidratación que rodean tanto la columna vertebral de fosfato de ácido nucleico como la superficie de sílice (deshidratación). Esto facilita la formación de puentes catiónicos —normalmente mediados por cationes Na⁺ o caotrópicos— entre los grupos silanol cargados negativamente en la superficie de sílice y los grupos fosfato del ácido nucleico. La selectividad respecto al tipo de ácido nucleico (ADN vs. ARN) y la longitud del fragmento se logra mediante la modulación precisa de la química del tampón. Por ejemplo, concentraciones específicas de sales y niveles de pH pueden favorecer la unión de cadenas genómicas largas frente a oligonucleótidos cortos, o diferenciar entre ARN y ADN. Además, las iteraciones modernas de esta tecnología suelen emplear superficies de sílice modificadas para mejorar las isotermas de adsorción diferencial de especies específicas de ácidos nucleicos.

El flujo de trabajo canónico para la purificación de ácidos nucleicos a base de sílice se desarrolla a través de cuatro fases distintas: (1) Lisis, donde el material biológico de partida se homogeneiza y las estructuras celulares se desintegran, a menudo utilizando condiciones alcalinas o detergentes (SDS/Triton); (2) Aclaración, donde se eliminan los restos celulares, proteínas precipitadas y polisacáridos para evitar el atasco de la columna; (3) Unión, donde el sobrenadante se ajusta con sales caotrópicas y etanol para promover la adsorción a la membrana sílice; y (4) Lavado, donde los ácidos nucleicos unidos a la membrana se enjuagan con tampones a base de alcohol para eliminar sales residuales e inhibidores antes de la elución en un tampón de baja fuerza iónica.

Aunque la química de este proceso es robusta, el manejo mecánico de columnas de spin individuales sigue siendo un cuello de botella importante para flujos de trabajo de rendimiento medio (24–100 muestras), creando una brecha entre el procesamiento manual y los costosos sistemas automatizados de manipulación de líquidos. Los enfoques existentes para simplificar la extracción manual de ácidos nucleicos en columna incluyen colectores de vacío y estaciones de trabajo robóticas para la purificación^automatizada 9,10,11,12.

Los colectores de vacío suelen estar disponibles en configuración de acceso aleatorio equipados con adaptadores de enchufe de 20 a 24 Luer para columnas centrífugas, o en un diseño pensado para su uso con placas de 96 pozos. Los colectores de vacío configurados para 20–24 muestras aceleran el paso de lavado de columnas durante la purificación del ADN en comparación con la centrifugación, ya que eliminan la necesidad de retirar columnas del rotor. Aunque este método es conveniente, la contaminación cruzada puede producirse porque la punta de drenaje de la columna contacta con la abertura Luer del colector de vacío. Si el ADN de una columna entra en la abertura de Luer, puede transferirse a otra columna de muestra durante el uso posterior de la variedad. Para evitar la contaminación, los fabricantes recomiendan accesorios^{adicionales 10,13}; sin embargo, estos complican el montaje del montaje de extracción y a menudo se omiten.

Los colectores de vacío diseñados para el formato de 96 pozos presentan una construcción diferente y no están destinados a columnas de microcentrífugas, sino a placas compatibles de extracción de ADN de 96 pozos, en las que los pozos contienen una membrana de sílice. En este caso, la extracción de ADN se realiza utilizando kits de aislamiento de ADN preenvasados de formato 96^{pozos 14}. Estos kits ofrecen un alto rendimiento pero tienen una aplicabilidad limitada, ya que procesar menos de 96 muestras suele ser poco práctico.

Las estaciones de trabajo robóticas automatizadas para la extracción de ácidos nucleicos son, sin duda, el método más conveniente para la purificación del ADN, ya que requieren una participación mínima del operador, ahorrando así tiempo al investigador y minimizando factores estocásticos como la contaminación. Desafortunadamente, la mayoría de las estaciones de extracción carecen de universalidad y funcionan exclusivamente con kits dedicados. Estas estaciones de trabajo se utilizan principalmente en laboratorios de diagnóstico, pero no son rentables para la mayoría de los laboratorios académicos pequeños y medianos.

Por tanto, existe una laguna en la práctica de laboratorio para métodos de extracción de ADN de rendimiento medio capaces de procesar entre 12 y 96 muestras en menos de 1 hora. Presentamos un rack de 24 pozos que permite aislar manualmente hasta 48 muestras usando columnas de spin tapadas y hasta 116 muestras usando columnas de spin sin límite. Se utiliza una centrífuga con rotor de placa de cubo oscilante y una microcentrífuga de ángulo fijo como equipo adicional. El procedimiento para la purificación del ADN plasmidico se presenta como ejemplo de uso de racks de 24 pozos, ya que el aislamiento del ADN plasmidico incluye un paso de clarificación para eliminar restos de células lisadas, lo que dificulta la automatización del proceso. No obstante, estos estantes pueden emplearse prácticamente para cualquier método de extracción de ácidos nucleicos en columna.

Protocolo

1. Preparación de equipos impresos en 3D

1. Imprime el rack usando una impresora 3D de filamento fundido con una boquilla de 0,4 mm. Usa filamento genérico de PLA, PETG o ABS con 100% de relleno. Configura la altura de la capa a 0,1 mm y activa el suavizado de la superficie. Ajusta la configuración de impresión para garantizar la estanqueidad y la estabilidad mecánica.
   NOTA: Los archivos STL para componentes de rack se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. Sigue los parámetros de impresión especificados para el Depósito Base. Prueba el depósito antes de usarlo llenándolo con etanol al 70% y centrifugándolo durante duraciones crecientes (1, 2, 5, 10 y 30 minutos) para confirmar la ausencia de fugas o daños estructurales.
2. Pega los componentes del Depósito Base para formar una unidad sellada.

2. Cultivo bacteriano y lisis

1. Inocular los transformantes de E. coli en 3–5 mL de medio LB que contenga los antibióticos adecuados. Incubar durante la noche (12–16 h) a 37 °C con agitación.
2. Cosechar las células por centrifugación a 2.000 × g durante 10 minutos. Descarta el sobrenadante.
   NOTA: Los pellets celulares pueden almacenarse a −20 °C antes de su procesamiento.
3. Añade 250 μL de buffer de resuspensión (buffer P1 con RNasa A) al perímetro. Resuspende completamente mediante vórtices o pipeteo.
4. Añade 250 μL de buffer de lisis (Buffer P2). Mezcla invirtiendo suavemente el tubo 4–6 veces.
   NOTA: Evitar mezclas vigorosas para evitar el corte del ADN genómico.
5. Añadir 350 μL de buffer de neutralización (Buffer N3). Mezcla inmediatamente a fondo por inversión.
   NOTA: Debe formarse un precipitado blanco, indicando una neutralización exitosa.

3. Montaje de la unidad de filtración

1. Coloca columnas de unión de ADN en la capa de soporte de columna del rack.
2. Colocar las tapas de las columnas en ranuras designadas para asegurarlas durante la centrifugación.
3. Coloca las columnas de clarificación/filtro en la capa de columna de filtros directamente encima de las columnas de enlace.
   NOTA: Si no hay columnas de filtro disponibles, centrifugar el lisado en microtubos y transferir el sobrenadante a las columnas de unión.

4. Eliminación del lisado y unión al ADN

1. Transfiere el lisato neutralizado del Paso 2.5 a las columnas de filtración.
2. Coloca el portaequipajes montado en un rotor de placa de cubo oscilante.
   PRECAUCIÓN: Asegura un equilibrio adecuado utilizando una cremallera de contrapeso de masa igual e idéntica configuración.
3. Centrifugar a 2.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Quita la cremallera de la centrífuga.
5. Quita y descarta la capa de columna del filtro.

5. Lavar

1. Desecha el flujo del depósito en un contenedor de residuos. Remonta el soporte con columnas de encuadernación.
2. Añadir entre 500 y 700 μL de buffer de lavado a cada columna de unión usando una pipeta multicanal.
3. Centrifugar a 2.000 × g durante 1 minuto.
4. Descarta el flujo de agua del embalse.
5. Repite el lavado añadiendo buffer de lavado a cada columna y centrifugando a 2.000 × g durante 1 minuto.
   NOTA: Las columnas pueden almacenarse a temperatura ambiente o a 4 °C tras el lavado.

6. Secado y elusión

1. Retira las columnas de unión del rack y transfiere a tubos de recogida de 2 mL.
2. Centrifuga a >10.000 × g durante 1 minuto para secar la membrana.
3. Transferir columnas a tubos limpios de 1,5 mL.
4. Añade 50 μL de tampón de elución o agua directamente a la membrana. Incuba durante 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Centrifugar a >10.000 × g durante 1 minuto para eluir ADN.

7. Opcional: co-precipitación con dióxido de titanio

1. Mezcla el tampón de lisis con polvo de dióxido de titanio en una proporción volumen-masa de 2:1.
2. Añade 250 μL de la suspensión de dióxido de titanio al lisato. Mezcla por inversión.
3. Añade 350 μL de tampón de neutralización y mezcla bien.
4. Centrifugar a 2.000 × g durante 1 minuto.
5. Recoge el sobrenadante sin alterar el precipitado.
6. Transfiere el sobrenadante a la columna de encuadernación.

Resultados

Variaciones en la cremallera
Hemos desarrollado cuatro versiones de racks adecuadas para una amplia gama de modelos de centrifugadoras, permitiendo el uso de recursos disponibles en diferentes entornos de laboratorio y adaptándose a las preferencias de los usuarios. Todos los racks tienen un formato de 24 pozos pero, dependiendo de la versión, incluyen posiciones adicionales para las columnas. Las dimensiones detalladas y la compatibilidad se proporcionan en el Archivo Suplementario 2. Una imagen de alta resolución del rack ensamblado se proporciona en la Figura Suplementaria S1.

La versión básica en rack (Figura 1) es la configuración más productiva. Consta de cuatro partes y tiene unas dimensiones de 88 × 130 × 77 mm. Permite el uso simultáneo de hasta 48 columnas cuando se usan columnas con mayúsculas o hasta 116 columnas cuando se usan columnas sin mayúsculas. Los componentes de la cremallera están diseñados para facilitar su uso y minimizar los efectos no deseados durante la centrifugación. Las columnas de centrifugado se colocan en la capa de columna, que tiene ranuras para insertar las tapas; Estas mismas ranuras también pueden acomodar columnas sin tapas. La capa de columna se asienta sobre el embalse. La abertura de drenaje de las columnas está situada sobre el recorte del embalse, lo que ayuda a reducir las salpicaduras entre columnas adyacentes. El líquido drena por una abertura en la parte inferior del corte hacia el depósito. La capacidad del depósito es de aproximadamente 100 mL, con dos pasos de lavado con una alta carga en columnas. La capa de columna de filtro puede colocarse sobre la capa de columna cuando sea necesario, con las columnas de filtro situadas arriba y en contacto con las columnas de enlace. La tapa sella la capa que contiene el filtro o las columnas de enlazamiento, limitando el flujo de aire durante la rotación de la centrífuga. La versión básica de cremallera es compatible con rotores de cubeta A-2-DWP (por ejemplo, Eppendorf 5804), rotor 1770 (por ejemplo, HETTICH Rotina 380) o sistemas equivalentes.

La versión mini rack (Figura 2) es adecuada para una amplia gama de rotores de cubo de centrifugadora. Consta de tres partes y tiene dimensiones mínimas de 82,5 × 128 × 58 mm (con la capa de columna de filtros). Permite el uso de hasta 48 columnas con mayúsculas o hasta 90 columnas sin mayúsculas. La geometría de esta versión es similar a la de la cremallera básica, pero las filas exteriores de posiciones de las columnas se eliminan y se sustituyen por ranuras para las tapas de columna. La capacidad del depósito varía según la versión impresa. El depósito más pequeño (20 mL) alberga un paso de lavado para aproximadamente 30 columnas; los embalses más grandes permiten un mayor rendimiento. La capa de columna de filtro tiene bordes redondeados para permitir el movimiento de la cubeta del rotor en centrifugadoras más pequeñas. La versión mini rack es compatible con rotores de cubeta UC-124 (por ejemplo, Accumax iFuge UC02) o sistemas equivalentes. Cuando se utiliza sin la capa de columna de filtro, el rack es compatible con rotores de cubeta A-2-MTP (por ejemplo, Eppendorf 5430) o sus equivalentes.

La versión sin depósito (sin cubrir) (Figura 3) es adecuada para usuarios con experiencia limitada en impresión 3D, ya que el depósito se sustituye por un recipiente externo como una caja de punta de pipeta. Esta versión consta de tres partes y mide 79 × 115 × 61,5 mm. Permite el uso de hasta 48 columnas con mayúsculas o hasta 78 columnas sin mayúsculas. La geometría es similar a la de las versiones anteriores, pero carece de un depósito integrado. En su lugar, se utiliza un recipiente adecuado para la recogida de residuos. Las capas de columna y filtro tienen menos posiciones de asiento, y la capa de filtro incluye asientos cónicos para evitar interferencias con el movimiento del rotor. La base está diseñada para caber dentro de contenedores estándar y puede estabilizarse mediante separadores laterales. La compatibilidad depende del contenedor seleccionado, pero incluye rotores de cubeta A-2-DWP (por ejemplo, Eppendorf 5804), rotor 1770 (por ejemplo, HETTICH Rotina 380) y rotores de cubeta UC-124 (por ejemplo, Accumax iFuge UC02).

La versión de rack de condensadores (Figura 4) es la configuración más sencilla y se utiliza junto con placas de 24 pozos profundos de 5 mL o 10 mL. Consta de un solo componente con dimensiones de 73 × 109 × 4 mm y permite el uso de hasta 48 columnas. Esta versión es compatible con cualquier rotor de centrífuga que soporte el formato de placa correspondiente.

Rendimiento y pureza
La extracción de ADN se realizó en cultivos de E. coli utilizando tanto el protocolo manual estándar de microcentrífuga como el método basado en rack. El análisis espectrofotométrico mostró que la calidad del ADN extraído usando los racks era comparable a la obtenida con el método estándar. Las relaciones típicas A260/A280 oscilaban entre 1,8 y 1,9 para ambas aproximaciones. El rendimiento total de plásmidos (μg) no mostró diferencias significativas entre el método convencional y la extracción mediante configuraciones de rack (Figura 5); los datos en bruto se proporcionan en el Archivo Suplementario 2. También se preservó la conformación plasmid, con distribuciones similares de formas relajadas, lineales y superenrolladas (Figura 6).

Análisis de contaminación cruzada
Para evaluar la posible contaminación cruzada, se realizó un experimento con tablero de ajedrez. Las columnas se cargaban alternativamente con una solución de bromuro de etidio de alta concentración (simulando ADN de alto título) y agua. Tras la centrifugación a 2.000 × g, la distribución del tinte se confinó al área de desagüe directamente bajo las columnas cargadas, y no se detectó señal visible en pozos adyacentes ni en las puntas de las columnas vecinas (Figura 7). Estas observaciones indican que el diseño de cremallera reduce la probabilidad de salpicaduras y transferencia de columnas cruzadas bajo las condiciones probadas.

Para evaluar más a fondo la contaminación, se realizó una PCR en tiempo real utilizando un amplicón como agente contaminante (véase Archivo Suplementario 2). La amplificación solo se detectó en eluados de columnas a las que se había añadido el amplicón (Figura 8). Bajo las condiciones probadas, no se detectó contaminación cruzada; sin embargo, el rendimiento puede variar según el flujo de trabajo y el tipo de muestra.

Figura 1: Versión básica del esquema de ensamblaje de rack. Vista CAD explotada que muestra la (A) tapa, (B) la capa de columna del filtro, (c) la capa de soporte de columna y (D) el depósito de base. El rack consta de cuatro partes con dimensiones de 88 × 130 × 77 mm y permite el uso simultáneo de hasta 48 columnas con tapas o hasta 116 columnas sin tapas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Versión mini del esquema de ensamblaje de rack. Vista CAD explotada mostrando la (A) capa de columna del filtro, (b) capa de soporte de columna y (c) depósito base. Esta versión es geométricamente similar a la versión básica, pero las dos filas laterales de asientos de columna se eliminan y se sustituyen por ranuras para las tapas de columna. Consta de tres partes, tiene dimensiones mínimas de 82,5 × 128 × 58 mm (con la capa de columna de filtros), y permite el uso de hasta 48 columnas con mayúsculas o hasta 90 columnas sin tapas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Versión sin depósito (descubierta) del esquema de ensamblaje de rack. Vista CAD explotada que muestra la capa de columna de filtro (B), (B) capa de soporte de columna, (C) base y (D) caja de punta de pipeta. Esta versión sustituye el depósito integrado por un recipiente externo como una caja de punta de pipeta. Consta de tres partes, tiene dimensiones de 79 × 115 × 61,5 mm, y permite el uso de hasta 48 columnas con tapas o hasta 78 columnas sin tapas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Versión de tapón de racks de 24 pozos. Vista superior (izquierda) y vista inferior (derecha). Esta es la versión de rack más sencilla, utilizada junto con placas de 24 pozos profundos de 5 mL o 10 mL. Consta de una sola pieza con unas dimensiones de 73 × 109 × 4 mm y permite el uso de hasta 48 columnas, con o sin tapas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Comparación del rendimiento y pureza del ADN. Análisis espectrofotométrico del rendimiento de plásmidos (μg/mL). No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el rendimiento total de los plásmidos entre el método convencional y la extracción utilizando las configuraciones de rack. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Comparación de la calidad del ADN. Las formas de ADN se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las formas relajadas, linealizadas y superenrolladas del ADN son similares entre la extracción manual estándar y la extracción en estante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Evaluación de contaminación cruzada. Vista del depósito de residuos tras la centrifugación, mostrando piscinas de residuos discretas sin solapamiento. Las columnas se cargaron con una solución de bromuro de etidio de alta concentración (simulando ADN de alto título) y agua. No se observó tinte en pozos de "agua" adyacentes ni en las puntas de columnas vecinas tras la centrifugación, lo que indica una reducción de salpicaduras y transferencia transversal bajo las condiciones probadas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Análisis de contaminación cruzada mediante PCR cuantitativa. Las curvas de amplificación para las muestras que contienen el agente contaminante se muestran en rojo, mientras que las que contienen solo agua se muestran en verde. La amplificación solo se detectó en muestras que contenían el agente contaminante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Archivos de modelos 3D para diseños de rack. Este conjunto de archivos contiene archivos STL para todas las configuraciones de rack, incluyendo la versión básica de rack, la versión mini rack (con múltiples variantes de altura de depósito), la versión sin depósito y la versión de rack de condensadores. Se proporcionan componentes individuales (por ejemplo, depósito base, capa de soporte de columna, capa de columna de filtro y tapa) para impresión 3D. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Datos y métodos de apoyo. Este conjunto de archivos contiene la tabla de compatibilidad de centrifugadoras, procedimientos detallados de prueba de contaminación cruzada, conjuntos de datos de rendimiento de ADN en bruto y archivos de salida de instrumentos PCR asociados con el análisis de contaminación. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: Versión básica en rack (completamente montada). Imagen de alta resolución de la configuración básica del rack completamente ensamblada, que ilustra la estructura general y la disposición de los componentes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo aborda la "brecha de rendimiento" en muchos laboratorios de biología molecular. Aunque las placas filtrantes de 96 pozos son más rápidas, pueden presentar menores capacidades de unión o concentraciones finales reducidas en comparación con las columnas de spin^{individuales 14}. Adaptando columnas de spin estándar a un formato de rotor de placa, este método combina el alto rendimiento de las columnas con la velocidad de los flujos de trabajo basados en placas.

Los racks son más ventajosos cuando se procesan más de 12 muestras. La principal innovación del protocolo es el uso de racks de 24 pozos, que simplifican y aceleran la extracción de ácidos nucleicos en columna empleando un yacimiento compartido para la eliminación de soluciones de sobrenadante y de lavado. Al usar los racks, el tiempo necesario para realizar estos pasos para 14–116 muestras es comparable al necesario para 2–12 muestras. Además, el esfuerzo del operador se reduce, ya que se minimizan los pasos repetitivos como retirar tubos individuales, transferir columnas, descartar soluciones de lavado y abrir tapas. Dado que los componentes originales del kit (soluciones y columnas de spin) permanecen sin cambios, se espera una calidad de ADN comparable y se respalda con los resultados presentados.

La impresión 3D de los racks de 24 pocillos es factible con equipamiento estándar, pero puede requerir experiencia para las versiones básica y mini. Las versiones sin depósito y con estante de condensadores son más sencillas y pueden producirse con una experiencia de impresión mínima. Una consideración clave en el modelado de deposición fusionada es la formación de microhuecos entre capas, que pueden comprometer la estanqueidad bajo centrifugación. Las pruebas indicaron que el relleno del 100%, un grosor de pared del depósito de 7 mm y una altura de capa de 0,1 mm proporcionan suficiente estanqueidad. Calentar la cama de impresión y aplicar alisado superficial mejoró aún más el rendimiento de sellado. En cambio, los métodos de sellado post-impresión que usaban resinas epoxi o disolventes orgánicos no resultaron efectivos, ya que la deformación durante la centrifugación provocaba grietas y fugas. Un grosor insuficiente de la pared también puede provocar fallo estructural y pérdida de estanqueidad, lo que puede provocar un desequilibrio de las centrifugadoras. Por lo tanto, se recomienda realizar pruebas previas al uso de componentes impresos.

Las cuatro versiones en rack son adecuadas para una amplia gama de centrifugadoras con rotores de cubo, permitiendo a los usuarios seleccionar la configuración que mejor se adapte a sus requisitos de equipo y rendimiento. La versión básica en rack ofrece el mayor rendimiento, pero requiere centrífugas más grandes y una mejor calidad de impresión. La versión mini reduce los requisitos de tamaño de la centrífuga pero también disminuye el rendimiento. La versión sin depósito simplifica la fabricación y es compatible con recipientes comúnmente disponibles como las cajas de punta de pipeta, aunque la compatibilidad depende de la geometría del recipiente. La versión tapador-rack es la configuración más sencilla, pero no puede usarse con columnas de filtro.

Las columnas de filtro que no se unen a los ácidos nucleicos pueden ser menos fáciles de encontrar que las columnas de unión estándar⁹. En su ausencia, pueden ser necesarios pasos adicionales de aclaración, aumentando el tiempo total de procesamiento. Alternativamente, se pueden utilizar puntas de filtro de pipeta (1000 μL) o el protocolo de dióxido de titanio.

Los bastidores de extracción funcionan como un complemento mecánico a los flujos de trabajo estándar de extracción de^{ADN 9} y no alteran la composición del tampón ni la química de la columna (excepto en la variante de dióxido de titanio). Por tanto, no se espera un impacto sustancial en la calidad del ADN, lo cual es consistente con la electroforesis en gel de agarosa y produce comparaciones que muestren formas y cantidades de plásmidos similares en comparación con el método estándar.

Aunque el uso de un depósito de residuos compartido introduce un riesgo potencial de contaminación cruzada, esto no se observó en las condiciones probadas. Una característica clave del diseño es la geometría de "chimenea" de las salidas de la columna, que mantiene la separación entre las puntas de la columna y la superficie del líquido residual. Para preservar esta separación, el depósito no debe estar sobrellenado, y se recomienda vaciar tras cada paso completo.

Una limitación del método es la velocidad máxima de los rotores de cubeta giratoria (normalmente 2.000 × g). Aunque es suficiente para los pasos de unión y lavado, esta velocidad no es adecuada para un secado completo de membrana. Por lo tanto, se requiere un paso final de centrifugación a alta velocidad en una microcentrífuga de ángulo fijo. A pesar de este paso adicional, el ahorro total de tiempo sigue siendo considerable para lotes que superen las 24 muestras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	Se recomienda PETG o PLA
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Rotor de ángulo fijo
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Rotor de plato de canasta oscilante
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Parte de Filter Columns
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Parte de Filter Columns
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065