Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular Afiliado de Hangzhou, Escuela de Medicina de la Universidad Westlake. El número de aprobación fue IIT-20230528-0108-01. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes inscritos prospectivamente antes de la recolección de sangre. Para los registros clínicos incluidos de forma retrospectiva y las muestras residuales archivadas recolectadas durante la atención rutinaria, el comité de ética eximió el consentimiento informado porque se utilizaron datos desidentificados y no se realizó ninguna intervención adicional.
Reproducibilidad, control del sesgo e integridad de los datos
Los criterios de elegibilidad, los puntos temporales de muestreo sanguíneo, las reglas de adjudicación de imágenes, las definiciones de subgrupos, los predictores candidatos, las definiciones de puntos de corte, las reglas para datos faltantes y los procedimientos de validación se especificaron previamente antes del análisis estadístico. Las muestras de sangre se recolectaron antes de la confirmación mediante imágenes con contraste y antes de cualquier tratamiento antitumoral. Las pruebas de laboratorio utilizaron identificadores de estudio anónimos, y las muestras de los cohortes de entrenamiento y validación se analizaron en orden aleatorio. El personal de laboratorio permaneció enmascarado respecto al diagnóstico final, la asignación al cohorte, la etapa según la Clínica de Barcelona para el Cáncer de Hígado (BCLC) y el estado de negatividad para AFP. El diagnóstico y la estadificación por imágenes se realizaron de forma independiente respecto al análisis de laboratorio. Dos investigadores revisaron la entrada de datos, la conversión de unidades, la asignación al cohorte, el codificado de exclusiones, el codificado de valores faltantes y los conjuntos de datos estadísticos antes del ajuste del modelo. Los cohortes de entrenamiento y validación se mantuvieron separados durante todo el proceso de selección de variables, ajuste del modelo, derivación de puntos de corte y validación.
Población y diseño del estudio
Este estudio diagnóstico con dos cohortes desarrolló y validó un modelo multivariable para la detección del carcinoma hepatocelular utilizando la protrombina anormal/proteína inducida por PIVKA-II, AFP y variables clínicas habituales. La cohorte de entrenamiento, ensamblada de forma retrospectiva, incluyó participantes evaluados entre el 1 de enero de 2021 y el 31 de diciembre de 2023. Esta cohorte se utilizó para la selección de variables, ajuste del modelo, derivación de puntos de corte y validación interna mediante bootstrap. La cohorte de validación, inscrita de forma prospectiva, incluyó participantes evaluados entre el 1 de enero de 2024 y el 31 de diciembre de 2025. Esta cohorte se utilizó únicamente para pruebas con muestras externas. No se realizó ninguna nueva selección de variables, reajuste del modelo, actualización de coeficientes, reoptimización de puntos de corte ni recalibración basada en subgrupos en la cohorte de validación. El flujo de participantes, asignación a cohortes, muestreo sanguíneo, procesamiento del plasma, análisis de biomarcadores, evaluación de imágenes y flujo de trabajo estadístico se muestran en Figura 1.
Los participantes fueron reclutados de una vía de vigilancia o diagnóstico de enfermedad hepática de alto riesgo en el Hospital Popular Afiliado de Hangzhou número uno, Escuela de Medicina, Universidad Westlake. El estado de alto riesgo se definió como infección por hepatitis B crónica, infección por hepatitis C crónica, cirrosis de cualquier etiología, o enfermedad hepática grasa con fibrosis documentada según evaluación clínica, registros de laboratorio o estudios de imagen previos. Los participantes elegibles eran adultos de 18 años o más que completaron la extracción de sangre previa a la obtención de imágenes y una tomografía computarizada multiphasica con contraste (TC) y/o una resonancia magnética dinámica con contraste (RM) dentro de los 14 días posteriores a la recolección de sangre. Los criterios de exclusión incluían tratamiento previo de carcinoma hepatocelular (CHC), incluyendo resección, ablación, terapia arterial intravascular o terapia sistémica; administración de vitamina K dentro de los 7 días anteriores a la muestra; tratamiento con antagonistas de la vitamina K u otra terapia anticoagulante que pudiera afectar la interpretación de la coagulación; colangitis aguda u obstrucción biliar en el momento de la toma de muestra; embarazo; ausencia de AFP, PIVKA-II o diagnóstico final por imágenes; y calidad inaceptable de la muestra sin una repetición válida.
La población final del estudio incluyó a 389 participantes. La cohorte de entrenamiento incluyó a 205 participantes, compuesta por 112 casos de CHC confirmados mediante imágenes y 93 controles sin CHC. La cohorte de validación incluyó a 184 participantes, compuesta por 58 casos de CHC confirmados mediante imágenes y 126 controles sin CHC. En la cohorte de entrenamiento, los 93 controles sin CHC incluyeron 30 controles sanos y 63 controles con enfermedad hepática crónica. En la cohorte de validación, los 126 controles sin CHC incluyeron 0 controles sanos y 126 controles con enfermedad hepática crónica.
El estado sintomático no se asignó únicamente a partir de antecedentes de hepatitis o cirrosis compensada. Un participante se clasificó como sintomático solo cuando el registro previo a la imagenología documentaba dolor nuevo o empeorado en el cuadrante superior derecho, pérdida de peso inexplicable, distensión abdominal, ictericia, orina oscura o descompensación clínicamente documentada no explicada por otra causa confirmada. Los participantes sin estos hallazgos se clasificaron como asintomáticos o con detección mediante vigilancia.
Adjudicación diagnóstica y estadificación
El estado final de CHC se determinó mediante tomografía computarizada multiphasica con contraste y/o resonancia magnética dinámica con contraste realizadas en la atención habitual. Se requería que la imagen incluyera al menos una fase arterial y una fase venosa portal; los hallazgos de la fase de retardo se incorporaron cuando estaban disponibles. Una lesión se clasificó como CHC cuando, en un hígado de riesgo, la imagen mostraba hiperenhancement en la fase arterial con eliminación en la fase venosa portal y/o fase de retardo, con o sin cápsula realzada. Los participantes sin características por imágenes compatibles con CHC y sin otro diagnóstico maligno se clasificaron como no CHC.
La información de imágenes fue extraída mediante un formulario preespecificado que registraba la modalidad de imagen, las fases obtenidas, la hipercaptación en la fase arterial, el lavado, la apariencia de la cápsula, el número de lesiones, el diámetro máximo de la lesión, la invasión macrovascular y la diseminación extrahígada. Dos lectores capacitados extrajeron de forma independiente las características de las imágenes a partir de los informes radiológicos finales. Las discrepancias se resolvieron por consenso utilizando los mismos criterios predefinidos. Si estaban disponibles tanto la TC como la RM, se utilizó la modalidad con la caracterización multiphasica más completa. Si ambas modalidades eran completas, se utilizó la modalidad documentada como base para la decisión clínica final.
La etapa BCLC se asignó después de que se hubiera finalizado el estado de HCC. Se definió HCC en estadio temprano como etapa BCLC 0-A. Se definió HCC negativo para AFP como AFP <20 ng/mL en la extracción de sangre previa a la obtención de imágenes. Estas etiquetas de subgrupo se utilizaron para la evaluación del desempeño por subgrupos, no para el entrenamiento del modelo ni para la elegibilidad de los participantes.
Recolección de muestras y procesamiento del plasma
Se recogió sangre venosa periférica por la mañana tras un ayuno nocturno de al menos 8 h, antes de la confirmación mediante tomografía computarizada o resonancia magnética con contraste y antes de iniciar la terapia antitumoral. Se extrajeron un total de 10 mL de sangre venosa en tubos para recolección de sangre con anticoagulante K2-EDTA. Los tubos se invirtieron 8–10 veces inmediatamente después de la recolección y se transportaron al laboratorio a 4 °C. El intervalo entre la punción venosa y la centrifugación se mantuvo dentro de las 2 h y se registró en el registro de muestras.
El plasma se separó mediante centrifugación a 1.600 × g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrifugadora refrigerada. El sobrenadante de plasma se transfirió a tubos microcentrífugos libres de nucleasas de 1,5 mL y se fraccionó en porciones de 0,5–1,0 mL. Los alícuotas se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Antes de la medición del biomarcador, un alícuota se descongeló una vez a temperatura ambiente, 20–25 °C, durante 20–30 min, se mezcló suavemente mediante inversión y se analizó dentro de las 2 h posteriores a la descongelación completa. Se rechazaron las muestras con coagulación visible, hemólisis moderada a severa o marcada lipemia, de acuerdo con los criterios predefinidos de aceptación en el laboratorio. Para la cohorte de validación prospectiva, se realizó una nueva extracción de sangre antes de la confirmación mediante imágenes, cuando era clínicamente factible.
Medición de AFP y PIVKA-II
Se midieron AFP y PIVKA-II mediante inmunoensayos electroquimioluminiscentes en un analizador inmunoanalítico automatizado. La AFP se registró en ng/mL y el PIVKA-II en mAU/mL. Los resultados se exportaron directamente desde el sistema de información de laboratorio.
Cada lote analítico incluyó calibradores específicos del ensayo y al menos dos niveles internos de control de calidad. Para la aceptación del lote, se requería que todos los resultados del control de calidad cayeran dentro del rango de control predeterminado por el laboratorio. Los objetivos de precisión analítica eran un coeficiente de variación dentro del mismo ensayo ≤10 % y un coeficiente de variación entre ensayos ≤15 % para AFP y PIVKA-II. Si el control de calidad fallaba o se detectaba una deriva del lote, este se rechazaba, el analizador se recalibraba y el lote se repetía si quedaba suficiente volumen de muestra. Para un resultado individual implausible o fuera de rango, se realizaban dos mediciones repetidas a partir del mismo alícuota descongelado cuando era posible, y se utilizaba la media de los dos valores repetidos aceptados. Si la repetición no era exitosa o el volumen de muestra era insuficiente, el resultado se marcaba como inválido y se manejaba según la regla para datos faltantes.
Extracción rutinaria de variables clínicas
Se extrajeron variables clínicas de rutina del mismo encuentro clínico que la extracción de sangre previa a la imagenología para AFP/PIVKA-II. Las variables candidatas incluyeron edad, sexo, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, albúmina, bilirrubina total, ratio normalizado internacional (INR), tiempo de protrombina y recuento de plaquetas. Cuando había múltiples valores disponibles dentro del período previo a la imagenología, se seleccionó el valor más cercano al momento de la toma de muestra de AFP/PIVKA-II. Las unidades se estandarizaron antes del análisis. La edad se registró en años; el sexo se codificó como femenino = 0 y masculino = 1; el recuento de plaquetas se registró como ×10⁹/L; la albúmina se registró como g/L; la bilirrubina total se registró como μmol/L; la AFP se registró como ng/mL; y el PIVKA-II se registró como mAU/mL.
Se realizaron verificaciones de rango, verificaciones de unidades y verificaciones de valores inverosímiles tras la extracción. Los valores marcados se verificaron frente a los registros originales. Solo se excluyó un valor cuando el registro fuente confirmaba un problema de calidad de la muestra, un error de conversión de unidades o una desviación en el procesamiento. Se mantuvieron los valores extremos verificados. El diccionario de variables definió la estructura del conjunto de datos, los nombres de las variables, las unidades, las reglas de codificación, las reglas de transformación y los códigos de valores faltantes.
Definición del predictor y selección de variables
Los predictores candidatos se definieron antes del desarrollo del modelo. Los biomarcadores principales fueron AFP y PIVKA-II. Los candidatos clínicos de rutina fueron edad, sexo, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, albúmina, bilirrubina total, INR o tiempo de protrombina y recuento de plaquetas. Los valores de AFP y PIVKA-II se transformaron mediante logaritmo natural. Los valores por debajo del límite de informe del ensayo se sustituyeron por la mitad del límite inferior de informe antes de la transformación.
Las comparaciones univariantes entre participantes con HCC y sin HCC en la cohorte de entrenamiento utilizaron pruebas t para muestras independientes para variables aproximadamente distribuidas de forma normal, pruebas U de Mann-Whitney para variables continuas asimétricas y pruebas χ2 o pruebas exactas de Fisher para variables categóricas. Se consideraron para el modelado multivariable las variables con P < 0,10 en el análisis univariante. La multicolinealidad se evaluó mediante el factor de inflación de la varianza (VIF), y un VIF >5 se consideró indicativo de una colinealidad preocupante. Cuando dos variables presentaban una fuerte colinealidad, se conservó la variable con una interpretación clínica más clara y un mejor rendimiento incremental del modelo.
El modelo final de regresión logística multivariable se desarrolló únicamente en la cohorte de entrenamiento. Se incluyeron forzosamente en el modelo ln(AFP) y ln(PIVKA-II). Los predictores adicionales se seleccionaron mediante eliminación hacia atrás guiada por el criterio de información de Akaike. Tras la selección hacia atrás, las variables conservadas fueron ln(AFP), ln(PIVKA-II), edad, sexo, albúmina, INR y recuento de plaquetas.
Desarrollo del modelo y cálculo del puntaje de riesgo
El modelo diagnóstico se ajustó mediante regresión logística multivariable con el estado de CHC como resultado binario. La probabilidad predicha de CHC se calculó a partir del predictor lineal η utilizando la siguiente ecuación:
p(HCC)=1/[1+exp(-η)]
η = -4.862+0.247×ln(AFP)+0.712×ln(PIVKA-II)+0.018×edad+0.331×sexo-0.062×albúmina+0.554×INR-0.004×recuentodeplaquetas
La AFP se midió en ng/mL, la PIVKA-II en mAU/mL, la edad en años, el sexo se codificó como femenino = 0 y masculino = 1, la albúmina se midió en g/L, el INR fue adimensional y el recuento de plaquetas se midió como ×109/L. Se utilizaron logaritmos naturales para AFP y PIVKA-II. Se generó un nomograma a partir de los mismos coeficientes ajustados. Para el análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC), el análisis de calibración, el análisis de la curva de decisión y la validación, se utilizó la probabilidad predicha, no la escala de puntos del nomograma.
Definiciones de puntos de corte y manejo de umbrales
Los umbrales de PIVKA-II se etiquetaron según el propósito analítico. El umbral clínico establecido para PIVKA-II fue de 40,0 mAU/mL. El umbral de Youden en la cohorte de entrenamiento para PIVKA-II fue de 45,0 mAU/mL. El umbral de especificidad fija se obtuvo seleccionando el valor umbral más cercano al 90 % de especificidad en la cohorte de entrenamiento; esto resultó en 38,0 mAU/mL para PIVKA-II. Un umbral aparente utilizado únicamente en la validación de 37,5 mAU/mL se consideró exploratorio y no se usó como umbral principal de validación.
Para el modelo combinado, el punto de corte binario principal se derivó a partir de la cohorte de entrenamiento utilizando el índice de Youden y se aplicó sin cambios a la cohorte de validación. Se utilizó el punto de corte clínico establecido de 20,0 ng/mL para la definición del subgrupo negativo para AFP y para la comparación con la práctica habitual. Los puntos de corte optimizados de AFP utilizados en el análisis ROC se etiquetaron por separado del umbral clínico. Por lo tanto, los puntos de corte se informaron según el propósito analítico y no como umbrales intercambiables.
Rendimiento, calibración y validación del modelo
La discriminación se evaluó mediante curvas de característica operativa del receptor y el área bajo la curva. Las AUC se informaron con intervalos de confianza del 95 %. Las comparaciones de AUC utilizaron la prueba de DeLong. El rendimiento de la clasificación se reportó como sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y exactitud en puntos de corte predeterminados.
La calibración se evaluó mediante el intercepto de calibración, la pendiente de calibración, la puntuación de Brier y la prueba de bondad de ajuste de Hosmer-Lemeshow. Los gráficos de calibración compararon las probabilidades predichas y observadas de HCC entre grupos de riesgo. La validación interna utilizó 1.000 muestras de reemplazo bootstrap en la cohorte de entrenamiento para estimar el AUC corregido por optimismo y la pendiente de calibración corregida por optimismo. La cohorte de validación se utilizó únicamente para la evaluación del desempeño externo. No se realizó actualización de coeficientes, reajuste del modelo, reoptimización de umbrales ni recalibración basada en subgrupos en la cohorte de validación.
Se evaluó la utilidad clínica mediante análisis de curvas de decisión en un rango de probabilidades umbral de 0,05 a 0,50. Se comparó el beneficio neto para AFP sola, PIVKA-II sola, el modelo basado en variables clínicas y el modelo combinado.
Manejo de datos faltantes y análisis de sensibilidad
El análisis principal utilizó un modelo de casos completos para los participantes con todas las variables incluidas en el modelo final. Se resumieron los valores ausentes para cada predictor candidato. Si la cantidad de datos faltantes superaba el 5 % para cualquier predictor incluido, se realizó una imputación múltiple mediante ecuaciones encadenadas como análisis de sensibilidad, utilizando el resultado, todos los predictores incluidos y el indicador de cohorte en el modelo de imputación. Las variables con más del 20 % de datos faltantes no fueron elegibles para el modelado multivariable. Los coeficientes del modelo, el AUC, la pendiente de calibración y las métricas de clasificación obtenidas del análisis con datos imputados se compararon con los resultados del análisis de casos completos.
Software y reporte reproducible
Todos los análisis se realizaron utilizando R versión 4.3.2 y RStudio versión 2023.12.1. La regresión logística se realizó utilizando el paquete base stats. El análisis ROC y las comparaciones de DeLong se realizaron utilizando pROC versión 1.18.5. El análisis de calibración se realizó utilizando rms versión 6.7-1 y ResourceSelection versión 0.3-6. La validación por bootstrap utilizó 1.000 remuestras con una semilla aleatoria fija de 70558. El análisis de curva de decisión se realizó utilizando rmda versión 1.6. La imputación múltiple, si era necesaria, se realizó utilizando mice versión 3.16.0. El script de análisis reprodujo el flujo de participantes, los coeficientes del modelo, las curvas ROC, las métricas de calibración, la validación por bootstrap, el análisis de curva de decisión, los análisis basados en puntos de corte y las tablas estadísticas.